未折疊蛋白響應(yīng)的激活機(jī)制*

王立堃 李 桃 徐芬芬

（中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所生物大分子國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101）

真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是分泌蛋白和膜蛋白折疊和翻譯后修飾的重要場(chǎng)所。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)異常時(shí)，大量未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白會(huì)在ER腔累積，這被稱為“ER應(yīng)激”。ER 應(yīng)激發(fā)生時(shí)，IRE1、PERK 和ATF6 以不同方式被激活，啟動(dòng)分子伴侶和折疊酶的表達(dá)，同時(shí)調(diào)整蛋白質(zhì)翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解速率，以恢復(fù)ER正常功能。這三條通路被稱為“未折疊蛋白響應(yīng)（unfolded protein response，UPR）”。作為ER應(yīng)激的感受器，IRE1、PERK 和ATF6 如何感知未折疊蛋白累積這一信號(hào)是該領(lǐng)域基本的科學(xué)問題。作為ER定位的跨膜蛋白，三者既能對(duì)ER腔環(huán)境改變也能對(duì)ER 膜狀態(tài)變化作應(yīng)答。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，來自胞質(zhì)和胞外的信號(hào)也能激活UPR。三條UPR通路的存在以及各自特有的激活方式使得UPR 信號(hào)的調(diào)控和功能更加多樣化。UPR 與細(xì)胞多種生理功能密切相關(guān)，也與疾病的發(fā)生發(fā)展密不可分，對(duì)于生理及生理病理?xiàng)l件下UPR 激活機(jī)制的深入研究有助于進(jìn)一步理解UPR 的調(diào)控機(jī)制和生理意義。這方面還有很多問題亟待解決。

本文對(duì)UPR 的激活機(jī)制作一介紹，將從未折疊蛋白依賴和非依賴的機(jī)制分別闡述。對(duì)于UPR和ER 應(yīng)激的關(guān)系，提出對(duì)今后需解決問題的看法。

1 UPR

1.1 UPR的發(fā)現(xiàn)及其和ER應(yīng)激的關(guān)系

UPR概念是在研究細(xì)胞如何應(yīng)對(duì)ER 腔未折疊蛋白累積這一問題中提出的。真核細(xì)胞中，分泌蛋白和膜蛋白的折疊和組裝在ER里進(jìn)行，ER腔中高度的氧化環(huán)境為蛋白質(zhì)氧化折疊提供了必要條件［1］。ER也是蛋白質(zhì)N-連接糖基化的場(chǎng)所，幫助糖蛋白正確折疊的分子伴侶鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CALR）、鈣聯(lián)結(jié)蛋白（calnexin，CNX）都是鈣結(jié)合蛋白，它們的活性受Ca2+調(diào)控［2］。可以想見，糖基化受阻，或是ER腔氧化還原水平、鈣濃度受干擾會(huì)影響ER 腔內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊。在20 世紀(jì)70 年代，人們發(fā)現(xiàn)葡萄糖剝奪能特異性激活一系列基因的表達(dá)，這些基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物被稱為“葡萄糖調(diào)控 蛋 白（glucose-regulated protein，GRPs） ”［3］。20世紀(jì)80年代鑒定到ER腔定位的、能夠結(jié)合免疫球蛋白重鏈的蛋白質(zhì)，將其命名為重鏈結(jié)合蛋白（binding immunoglobulin protein，BiP），隨即人們認(rèn)識(shí)到BiP 就是GRP 成員中的GRP78［4-5］。利用N-連接糖基化抑制劑衣霉素（tunicamycin，Tm）或葡萄糖類似物2-脫氧葡萄糖（2-deoxyglucose）處理細(xì)胞，能上調(diào)BiP 表達(dá)。不僅如此，BiP 能與錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)合，而在細(xì)胞中表達(dá)錯(cuò)誤折疊蛋白或過表達(dá)分泌蛋白也被證實(shí)能誘導(dǎo)GRPs 表達(dá)［6-7］。這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象促使人們將葡萄糖剝奪和蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊聯(lián)系起來，并提出，細(xì)胞具有一種叫“未折疊蛋白響應(yīng)”即UPR的機(jī)制，能對(duì)ER腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白累積這一信號(hào)做出響應(yīng)，上調(diào)GRPs的表達(dá)。

錯(cuò)誤折疊蛋白在ER 腔累積的現(xiàn)象被稱為ER應(yīng)激。利用Tm 抑制蛋白N-連接糖基化、利用ER膜定位的Ca2+泵SERCA 的抑制劑毒胡蘿卜素（thapsigargin，Tg）導(dǎo)致ER腔Ca2+濃度下降，或是利用小分子還原劑如β 巰基乙醇或二硫蘇糖醇（dithiothereitol，DTT）破壞蛋白質(zhì)二硫鍵，都能造成錯(cuò)誤折疊蛋白在ER腔中累積。這也是常用的誘發(fā)ER 應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)手段［8］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下，BiP的上調(diào)是在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行的。釀酒酵母的BiP同源基因KAR2的啟動(dòng)子區(qū)具有一個(gè)由22個(gè)堿基對(duì)組成的順式作用原件，對(duì)于Tm 處理下KAR2 轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)至關(guān)重要，被稱為未折疊蛋白響應(yīng)原件（unfolded protein response element，UPRE）［9-10］。20 世紀(jì)90 年代初期，以Walter 和Mori 為代表的研究者利用UPRE驅(qū)動(dòng)表達(dá)的報(bào)告系統(tǒng)，在釀酒酵母中進(jìn)行了一系列遺傳篩選工作，鑒定到迄今已知最為保守的UPR 通路：Ire1 及其下游轉(zhuǎn)錄因子Hac1［11-14］。1998 年，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中Ire1 的同源物ERN1 （也稱為肌醇需求酶1α，即inositolrequiring enzyme 1，IRE1α） 和ERN2 （也 稱 為IRE1β） 被 發(fā) 現(xiàn)［15-16］。2001 年，Hac1的同源物XBP1（X-box-binding protein 1）被鑒定到［17］。有意思的是，在此之前XBP1 已被發(fā)現(xiàn)是轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控B 細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合物II 類分子的表達(dá)［18］。后生動(dòng)物中，除了上述IRE1通路外，還發(fā)現(xiàn)另外兩條UPR 通路，蛋白激酶RNA 樣ER 激酶（PKR-like ER kinase，PERK）和激活轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）［19-21］。至此，目前通常所說的三條UPR通路均被鑒定到。

1.2 UPR信號(hào)通路

UPR 信號(hào)通路可經(jīng)由IRE1、PERK 和ATF6 啟動(dòng)。這3 種蛋白質(zhì)均為ER 定位的一次跨膜蛋白。在哺乳動(dòng)物中，IRE1α 全身性表達(dá)，而IRE1β 在腸道和肺上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，因此說到IRE1 通路，人們也常只提及IRE1α。一般認(rèn)為，當(dāng)ER 腔內(nèi)未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白累積時(shí)，IRE1、PERK 和ATF6 接收該信號(hào)并通過不同方式將信號(hào)傳遞到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，通過轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的調(diào)控來幫助蛋白質(zhì)折疊，恢復(fù)ER 穩(wěn)態(tài)。但是，持續(xù)激活的UPR 也可能誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡（圖1）［22］。

IRE1α 由N 端ER 腔結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和C 端胞質(zhì)區(qū)組成，其中胞質(zhì)區(qū)包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別具有蛋白激酶和RNA 內(nèi)切酶活性。IRE1α 能特異性識(shí)別并切割XBP1mRNA，啟動(dòng)XBP1mRNA 剪接，移除一段26 bp 的內(nèi)含子。這會(huì)導(dǎo)致翻譯閱讀框的移碼，其結(jié)果是剪接后XBP1（XBP1s，s 指spliced）的翻譯推遲終止，產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)錄因子活性的XBP1s 蛋白［11-12，15］。XBP1s 通過上調(diào)與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊、分泌和降解相關(guān)基因的表達(dá)，以應(yīng)對(duì)ER 應(yīng)激。IRE1α 還能降解一些mRNA 和微小RNA（microRNA）前體，該過程被稱為受調(diào)控的IRE1依賴的降解（regulated IRE1-dependent decay，RIDD）。RIDD 導(dǎo)致那些附著于ER 膜胞質(zhì)側(cè)的RNA（它們往往是ER定位蛋白、分泌蛋白和膜蛋白的mRNA）降解，影響細(xì)胞功能，也可能減輕ER蛋白折疊負(fù)擔(dān)［23-25］。 microRNA 前 體 如pre-miR17 的降解則被報(bào)道和程序性細(xì)胞死亡相關(guān)［26-27］。IRE1α也能與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（tumor necrosis factor receptor associated factor 2，TRAF2） 結(jié) 合， 上 調(diào)c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） 磷酸化并引起細(xì)胞凋亡［28］，或是促進(jìn)NF-κB 活化，從而激活炎癥因子的產(chǎn)生［29］。

與IRE1α 類似的，PERK 也是I 型跨膜蛋白，其C端胞質(zhì)區(qū)含激酶結(jié)構(gòu)域。PERK的激活也伴隨著二聚化的發(fā)生。PERK能磷酸化真核翻譯起始因子2的α亞基（eukaryotic translation initiation factor 2，subunit 1 alpha，eIF2α），抑制蛋白質(zhì)翻譯，減輕ER 蛋白質(zhì)折疊的負(fù)擔(dān)。但是，一些5'非翻譯區(qū)含有上游開放閱讀框（upstream open reading frame，UORF）的mRNA，此時(shí)主要ORF的翻譯水平反而會(huì)增強(qiáng)。轉(zhuǎn)錄因子ATF4 就是典型的在eIF2α 磷酸化時(shí)翻譯上調(diào)的蛋白質(zhì)［19-20］。一方面，ATF4 能上調(diào)參與氨基酸代謝、抗氧化反應(yīng)及自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；另一方面，ATF4 也能上調(diào)GADD34 表達(dá)，而后者能負(fù)反饋抑制eIF2α 磷酸化。當(dāng)PERK 持續(xù)激活時(shí)，ATF4 能上調(diào)凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CHOP 和死亡受體DR5 的表達(dá)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。此外，PERK 還被報(bào)道能磷酸化核因子erythroid 2 相關(guān)因子 （nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2），后者作為轉(zhuǎn)錄因子能促進(jìn)抗氧化反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)。

ATF6 是II 型跨膜蛋白。ER 應(yīng)激發(fā)生時(shí)，ATF6 從ER 轉(zhuǎn)移到高爾基體，并被蛋白酶S1P 和S2P 水解，產(chǎn)生的N 端片段（稱為ATF6f）從高爾基體上脫落，入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能［30-31］。ATF6f和XBP1s均能結(jié)合到UPRE區(qū)，上調(diào)包括BiP在內(nèi)的UPR 相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。ATF6f 還能結(jié)合到ER 應(yīng)激元件I/II（ER stress element I/II，ERSE-I/II），上調(diào)基因轉(zhuǎn)錄［32］。ATF6f還能促進(jìn)XBP1和CHOP的表達(dá)［17，33］。對(duì)于ATF6 激活是否也能引起細(xì)胞凋亡，目前還不清楚。

Fig. 1 The unfolded protein response and its downstream signals圖1 UPR通路及其下游信號(hào)

需要指出，上述3 條UPR 通路不是截然分開的。ATF6f 和XBP1s 激活轉(zhuǎn)錄的基因有廣泛的交集。它們都能通過上調(diào)磷脂酰膽堿的生物合成來增大ER 體積，也都能上調(diào)ER 膜定位的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體SEC61 復(fù)合物的表達(dá)［34-36］。不同UPR 通路間也存在相互調(diào)控。比如PERK 通路能上調(diào)磷酸酶RPAP2 的表達(dá)，而RPAP2 可造成IRE1α 的去磷酸化［37］。IRE1α 能降解DR5mRNA，也能降解BiPmRNA，因而對(duì)三條UPR 通路下游信號(hào)均有負(fù)調(diào)控［24，38］。此外，XBP1s 和ATF6f 能形成異源二聚體，激活“ER 相關(guān)的蛋白質(zhì)降解（ER-associated protein degradation，ERAD） ”相關(guān)基因的表達(dá)［39］。這里，ERAD是ER內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白的降解途徑，通過將ER 腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿，再經(jīng)由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解［40］。UPR下游信號(hào)非常復(fù)雜，影響細(xì)胞諸多生理功能，有關(guān)UPR 功能的更多研究可參考相關(guān)綜述［22］。

縱觀UPR 的發(fā)現(xiàn)歷程，可以看到它的研究是和ER 應(yīng)激分不開的。直到今天，研究者有時(shí)還將UPR 和ER 應(yīng)激這一概念等同起來。本文對(duì)當(dāng)前UPR 激活機(jī)制的研究作一介紹，并試圖厘清UPR與ER應(yīng)激的關(guān)系，提出該方向有待解決的問題。

2 聚合狀態(tài)對(duì)IRE1活性的影響

Fig. 2 The crystal structure of the cytosolic part of IRE1圖2 IRE1胞質(zhì)區(qū)晶體結(jié)構(gòu)

生化和結(jié)構(gòu)研究揭示了IRE1 二聚化和寡聚化在其活化中的必要性。帶有熒光蛋白標(biāo)簽的IRE1在ER應(yīng)激時(shí)能聚集形成點(diǎn)狀，說明細(xì)胞內(nèi)IRE1也能發(fā)生聚集［41］。IRE1 同源二聚體的形成導(dǎo)致亞基間發(fā)生反式自磷酸化［42］。雖然IRE1α 激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化對(duì)其發(fā)揮RNA 酶活性而言并非必需，但激酶結(jié)構(gòu)域處于“激活”構(gòu)象是必要的［43-44］。這可能導(dǎo)致了IRE1α 的某種構(gòu)象變化，從而更容易剪切XBP1mRNA。晶體結(jié)構(gòu)顯示，酵母Ire1 胞質(zhì)段以“背靠背”二聚形式存在，C 端有一表面富含堿性殘基的區(qū)域，推測(cè)是XBP1mRNA 結(jié)合位點(diǎn)［45-46］。類似的聚合方式在人源IRE1α胞質(zhì)段晶體結(jié)構(gòu)中也被觀測(cè)到（圖2a）［47］。對(duì)人源IRE1α胞質(zhì)段晶體結(jié)構(gòu)的解析還鑒定到另一種“頭碰頭”的二聚化狀態(tài)。在“頭碰頭”結(jié)構(gòu)中，彼此靠近的亞基激酶結(jié)構(gòu)域中活性中心彼此靠近。IRE1α磷酸化主要發(fā)生在一段稱為“活性區(qū)（activation segment）”的無規(guī)卷曲區(qū)，雖然活性區(qū)由于柔性太大而難以識(shí)別，但從附近肽段走向上可以推測(cè)活性區(qū)從激酶結(jié)構(gòu)域伸出并靠近鄰近亞基激酶結(jié)構(gòu)域的ATP 結(jié)合口袋（圖2b）。這與IRE1α 的反式自磷酸化相吻合。但是，在“頭碰頭”構(gòu)象中，亞基的RNase結(jié)構(gòu)域彼此分離，難以解釋其如何結(jié)合RNA 底物。有可能IRE1α以“頭碰頭”形式發(fā)生反式自磷酸后，再以未知方式轉(zhuǎn)換為“背靠背”模式，發(fā)揮RNase 活性［48］。酵母Ire1 胞質(zhì)段的晶體結(jié)構(gòu)還呈現(xiàn)一種14聚體的螺旋結(jié)構(gòu)，14聚體內(nèi)部亞基間以“背靠背”模式結(jié)合成二體，相鄰二體間圍繞螺旋軸以右手螺旋方式彼此相錯(cuò)51.4o排列（圖2c）。突變破壞“背靠背”二體內(nèi)部亞基間相互作用位點(diǎn)、抑或破壞相鄰二體間結(jié)合面都能抑制Ire1 活性［49］。我們注意到，雖然“背靠背”二體內(nèi)任一亞基的活性區(qū)與另一亞基的ATP 結(jié)合口袋距離很遠(yuǎn)，但二體內(nèi)每個(gè)亞基的活性區(qū)都與相鄰二體中與該亞基相錯(cuò)51.4o的亞基的ATP 結(jié)合口袋靠近（最近距離大約10 ?），在14聚體內(nèi)形成依次銜接模式。考慮到活性區(qū)的柔性，推測(cè)這種螺旋狀聚集體可能是IRE1既有激酶活性又有RNase 活性的形式（圖2c）。此外，晶體結(jié)構(gòu)顯示IRE1 的ER 腔結(jié)構(gòu)域（lumenal domain，LD）也能形成二體［50-51］。最近利用原位冷凍光電關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)（cryogenic correlated light and electron microscopy combined with electron cryotomography，cryo-CLEM-ET）和免疫電鏡技術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)IRE1α聚焦點(diǎn)的觀察顯示，IRE1α寡聚體位于具有復(fù)雜分支的狹窄管狀ER，且IRE1α ER腔結(jié)構(gòu)域可能在ER腔內(nèi)壁附近形成兩束相互纏繞的左旋螺旋［52］?？傊琁RE1可能有多種聚合狀態(tài)。寡聚體的形成對(duì)于XBP1 剪接是必要的，但RIDD 功能可能主要由二體行使［53］。

3 來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的UPR激活信號(hào)

3.1 ER腔內(nèi)未折疊蛋白累積

這是最為經(jīng)典的UPR 激活途徑。對(duì)未折疊蛋白在ER腔中的累積如何被感知并啟動(dòng)UPR，目前主要有直接結(jié)合模型和間接識(shí)別模型兩種解釋（圖3）。

直接結(jié)合模型認(rèn)為，IRE1 的ER LD 能直接與未折疊蛋白結(jié)合并被激活（圖3）。釀酒酵母Ire1的LD晶體結(jié)構(gòu)顯示，Ire1-LD分子間通過反平行β折疊片層形成二聚體，在二聚體頂部有一長(zhǎng)而深的富含疏水殘基的凹槽，結(jié)構(gòu)上類似于MHC-I，推測(cè)能結(jié)合多肽［50］。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Ire1-LD能與富含堿性和疏水殘基的多肽結(jié)合，凹槽底部Trp426 突變?yōu)锳la 則會(huì)削弱蛋白質(zhì)與多肽相互作用［54］。人源IRE1α-LD 晶體結(jié)構(gòu)顯示與酵母Ire1-LD 相似的、反平行β折疊片層介導(dǎo)的二聚化，突變破壞二聚化位點(diǎn)能降低IRE1α 活性（圖4a）。雖然IRE1α-LD也有一MHC樣疏水凹槽，但尺寸太小，不能允許多肽的結(jié)合，這對(duì)直接結(jié)合模型提出了挑戰(zhàn)（圖4b）［51］。然而，體外實(shí)驗(yàn)表明，IRE1α-LD 也能結(jié)合多肽，且這種結(jié)合能促進(jìn)IRE1α-LD 寡聚化［55］。IRE1激活的直接結(jié)合模型仍需更多生化證據(jù)支持。

Fig. 3 The direct association model，competition model，and allosteric model of IRE1α activation under ER stress圖3 ER應(yīng)激下，IRE1α激活的直接結(jié)合模型、競(jìng)爭(zhēng)模型和別構(gòu)模型

直接結(jié)合模型在PERK上也得到了生化和結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持。研究者通過噬菌體展示技術(shù)篩選到能和牛源PERK的LD結(jié)合的12肽，結(jié)晶并解析了PERK-LD 與該多肽復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)顯示PERK-LD 形成四聚體，其中三個(gè)亞基通過一序列保守的凹槽結(jié)合12 肽，另一個(gè)沒有結(jié)合（圖4c）。通過比較結(jié)合和沒有結(jié)合12 肽的亞基結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)12肽誘導(dǎo)結(jié)合位點(diǎn)形成β折疊片，在沒有結(jié)合12 肽的亞基中，這部分由于構(gòu)象不穩(wěn)定而在晶體結(jié)構(gòu)中難于被辨認(rèn)，研究者推測(cè)12 肽的結(jié)合能穩(wěn)定該部分構(gòu)象，而PERK-LD 結(jié)合多肽的部位有很大柔性，便于識(shí)別和結(jié)合具有不同結(jié)構(gòu)的底物蛋白。不僅如此，由于結(jié)合12肽而新產(chǎn)生的β折疊片還與位于附近另一個(gè)不對(duì)稱單元的亞基中的β折疊片形成β片層結(jié)構(gòu)，暗示底物蛋白的直接結(jié)合能促進(jìn)PERK 寡聚體形成，而這對(duì)于PERK 激酶活性的發(fā)揮有促進(jìn)作用（圖4c）［56］。

間接識(shí)別模型中，IRE1、PERK、ATF6 在非激活狀態(tài)下與BiP 結(jié)合。當(dāng)ER 腔出現(xiàn)大量未折疊蛋白時(shí)，BiP 從IRE1 和PERK 的LD 區(qū)解離，導(dǎo)致IRE1 和PERK 寡聚化（圖3）。BiP 的解離是可逆的，這保證了UPR 活化程度的可調(diào)控性。在細(xì)胞中過表達(dá)BiP能抑制IRE1和PERK的活性［57］。BiP結(jié)合位點(diǎn)被破壞的IRE1α 突變體在沒有ER 應(yīng)激的情況下也表現(xiàn)出部分活性［58］。以上結(jié)果均說明BiP的解離能促進(jìn)IRE1和PERK活化，但是BiP解離后IRE1 和PERK 的活化是否仍然需要未折疊蛋白的直接結(jié)合尚不清楚。另一方面，對(duì)釀酒酵母Ire1的研究則得出不同的結(jié)果，喪失BiP 的結(jié)合位點(diǎn)的Ire1 沒有表現(xiàn)出更強(qiáng)的對(duì)ER 應(yīng)激的反應(yīng)能力，但對(duì)乙醇和高溫應(yīng)激更敏感［59］。一種折中的解釋是，BiP從Ire1上解離并非Ire1激活的直接原因，但BiP結(jié)合Ire1 能促進(jìn)Ire1 寡聚體的解聚，從而導(dǎo)致Ire1信號(hào)衰減［60］。BiP從ATF6上解離也可能是ATF6轉(zhuǎn)移到高爾基體從而被激活的直接誘因，但這只是推測(cè)，沒有實(shí)驗(yàn)證據(jù)［61］。

Fig. 4 The crystal structure of the lumenal domain （LD） of IRE1 and PERK圖4 IRE1和PERK ER腔結(jié)構(gòu)域（LD）晶體結(jié)構(gòu)

BiP 屬于Hsp70 家族，含有核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding domain，NBD）和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（substrate-binding domain，SBD）。和其他Hsp70 家族成員一樣，BiP 與底物蛋白的結(jié)合是受NBD 調(diào) 控 的：當(dāng)NBD 和ADP 結(jié)合時(shí)，SBD 采取“關(guān)閉”構(gòu)象并與底物蛋白形成牢固復(fù)合物；在核苷酸交換因子（nulceotide exchange factor，NEF）幫助下，ADP 從NBD 解離并被ATP 取代，此時(shí)SBD 成為“打開”狀態(tài)，底物蛋白釋放。一種觀點(diǎn)認(rèn)為，BiP與IRE1結(jié)合也是通過SBD，BiP-IRE1結(jié)合實(shí)際上就是分子伴侶-底物蛋白的結(jié)合，這樣未折疊蛋白和IRE1 在結(jié)合BiP 這一點(diǎn)上是直接競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，這被稱為間接識(shí)別模型中的競(jìng)爭(zhēng)模型（competition model）。在該模型中，ERdj4作為BiP的協(xié)同分子伴侶（co-chaperone）與IRE1 的LD 結(jié)合并招募BiP，后者與IRE1 結(jié)合并使IRE1 處于失活狀態(tài)。ERdj4 也能結(jié)合ER 腔未折疊蛋白并將其呈遞給BiP，因此，ER 腔中未折疊蛋白會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ERdj4 和BiP，削弱它們對(duì)IRE1 的抑制作用，導(dǎo)致IRE1活化［62］。需要指出，BiP從IRE1上解離是ATP-NBD 的結(jié)合驅(qū)動(dòng)的，而非未折疊蛋白與SBD 結(jié)合所致，未折疊蛋白只是與IRE1 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合那些尚未結(jié)合到IRE1 上的BiP。別構(gòu)模型（allosteric model） 是另一種類型的間接識(shí)別模型［63］。在別構(gòu)模型中，BiP 的NBD 結(jié)構(gòu)域與IRE1結(jié)合，其SBD 與未折疊蛋白的結(jié)合導(dǎo)致其構(gòu)象改變，從而從IRE1 上解離（圖3）。目前，有關(guān)間接識(shí)別模型的研究仍主要集中在IRE1 上，上述模型是否適用于PERK和ATF6仍有待驗(yàn)證。

3.2 ER腔定位的UPR活性調(diào)控因子

可以看出，間接識(shí)別模型中很重要的一點(diǎn)是BiP 對(duì)IRE1、PERK 和ATF6 這三種UPR 感受器的抑制。近年來的研究發(fā)現(xiàn)了一些ER腔定位的負(fù)調(diào)控IRE1活性的蛋白質(zhì)，在IRE1激活程度的精細(xì)調(diào)控上發(fā)揮重要作用。其中，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）家族成員PDIA1和PDIA6 均被報(bào)道能抑制IRE1 活性。PDIA1 在被蛋白激酶Fam20C磷酸化后能與IRE1 LD非共價(jià)結(jié)合，而PDIA6 則與IRE1 LD 的Cys148 形成二硫鍵［64-66］。Fam20C 是分泌型激酶，其在ER 腔滯留可能是ER應(yīng)激的信號(hào)；PDIA6與IRE1的共價(jià)結(jié)合則可能是對(duì)ER 腔氧化還原狀態(tài)的某種反映。MANF 是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下表達(dá)上調(diào)的分泌蛋白，也具有ER 腔定位，可以幫助細(xì)胞緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。研究發(fā)現(xiàn)MANF 在持續(xù)的ER 應(yīng)激下能結(jié)合IRE1，防止其過度激活［67］。ERP47是一種ER腔定位的分子伴侶。與上述分子不同，ERP47能與BiP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IRE1，且ERP47 的結(jié)合能激活I(lǐng)RE1［68］。ER腔定位的UPR感受器調(diào)控因子究竟有多少，它們是否以及如何將ER內(nèi)蛋白折疊狀態(tài)的信號(hào)傳遞給UPR感受器，有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和研究。

3.3 ER膜

不難想到，ER膜狀態(tài)改變能調(diào)控ER膜蛋白的構(gòu)象和功能。作為ER 定位的跨膜蛋白，IRE1、PERK和ATF6三個(gè)UPR感受器均能在ER膜脂飽和度增加的情況下被激活。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用棕櫚酸（一種長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸）處理細(xì)胞和抑制酯酰輔酶A 去飽和酶1（stearoyl CoA desaturase 1，SCD1）時(shí)，ER 膜脂飽和度增加，此時(shí)IRE1α 和PERK 通路被激活，且激活不依賴于兩者LD的存在，因而與ER腔內(nèi)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊與否無關(guān)［69-70］。對(duì)IRE1的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其跨膜螺旋的N端有一兩親性螺旋，對(duì)于感知這種膜狀態(tài)的變化至關(guān)重要。分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示，跨膜區(qū)以一種斜插的方式穿過脂質(zhì)雙分子層，而其N端的兩親性使得這部分附著在ER膜面向ER腔一側(cè)的表面，這種與脂質(zhì)結(jié)合的方式會(huì)在其附近壓縮膜厚度，使整個(gè)系統(tǒng)處于一種高能不穩(wěn)定狀態(tài)?？缒ぢ菪舜丝拷芸s小這種高能微區(qū)，從而釋放能量使系統(tǒng)更穩(wěn)定。脂酰鏈飽和度的增加及固醇比例的增加使得磷脂雙分子層厚度增加且脂質(zhì)分子排布更有序，此時(shí)跨膜螺旋彼此結(jié)合能釋放更多能量，熱力學(xué)上講是更容易發(fā)生的。這可以解釋為什么ER膜脂飽和度增加能促進(jìn)IRE1寡聚化（圖5a）［71］。另一項(xiàng)研究提出了不同的解釋，認(rèn)為位于跨膜區(qū)中部、完全埋藏在脂質(zhì)雙分子層內(nèi)部的一個(gè)色氨酸殘基對(duì)于IRE1 聚集是重要的，這可以用色氨酸側(cè)鏈的兩親性解釋。將此殘基突變?yōu)楸奖彼釟埢妥阋云茐腎RE1 對(duì)膜脂飽和度增加的感應(yīng)（圖5b）［72］。對(duì)于PERK 如何感知并響應(yīng)ER膜的改變目前尚未見報(bào)道。ATF6的跨膜區(qū)能感知ER膜上特定鞘脂二氫鞘氨醇和二氫神經(jīng)酰胺的存在而被激活，但二氫鞘氨醇和二氫神經(jīng)酰胺并不激活I(lǐng)RE1和PERK（圖5c）［30］。

研究者用“脂雙層應(yīng)激（lipid bilayer stress，LBS）”來命名由于ER 膜脂成分和膜物理性質(zhì)的變化造成的細(xì)胞應(yīng)激，以區(qū)別于ER應(yīng)激。ER應(yīng)激下IRE1 能形成光學(xué)顯微鏡下可見的聚集斑點(diǎn)（puncta），但對(duì)釀酒酵母Ire1 的研究發(fā)現(xiàn)，LBS 不會(huì)造成IRE1 聚集斑點(diǎn)形成，所引起的轉(zhuǎn)錄組變化也不同于ER應(yīng)激下轉(zhuǎn)錄水平改變［73］。LBS是否使IRE1處于一種和ER應(yīng)激下不同的激活構(gòu)象并啟動(dòng)特異的下游信號(hào)通路，還需要進(jìn)一步研究。此外，ER通道Sec61復(fù)合物和ER跨膜蛋白EI24也被報(bào)道能結(jié)合并阻止IRE1 的激活［74-75］。LBS 是否影響上述蛋白質(zhì)和IRE1的相互作用仍有待回答。

Fig. 5 The activation of IRE1α and ATF6 under lipid bilayer stress（LBS）圖5 脂雙層應(yīng)激（LBS）下IRE1α和ATF6的激活

4 來自胞質(zhì)的UPR激活信號(hào)

4.1 UPR感受器結(jié)合蛋白

迄今已有不少關(guān)于UPR 感受器-胞質(zhì)蛋白相互作用的報(bào)道。這些蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用使得三條UPR 通路的調(diào)控具有更好的特異性和靈活性。這方面的研究目前仍主要集中于IRE1。需要指出，胞質(zhì)蛋白對(duì)UPR 感受器的調(diào)控是多方面的，這里僅對(duì)促進(jìn)UPR活化的蛋白質(zhì)做介紹。

Bcl-2 家族是細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑中關(guān)鍵的凋亡調(diào)節(jié)因子。前面講到，IRE1 的持續(xù)或過度激活能造成程序性細(xì)胞死亡。Bcl-2家族成員BAX和BAC能與IRE1α 胞質(zhì)區(qū)相互作用并增強(qiáng)IRE1 活性［76］，BIM 和PUMA 則在IRE1 下游XBP1 信號(hào)的持續(xù)激活和RIDD發(fā)生中扮演重要角色［77］。非肌肉性肌球蛋白重鏈IIB（nonmuscle myosin heavy chain IIB，NMHCIIB）能特異結(jié)合IRE1α 并幫助IRE1α 聚集體形成［78］。因此，細(xì)胞骨架蛋白對(duì)UPR 感受器聚合狀態(tài)的調(diào)控可能是UPR 激活的一種新方式。類似的，酪氨酸蛋白激酶ABL1 也能結(jié)合IRE1 胞質(zhì)區(qū)并造成IRE1 的寡聚化，這一功能不需要ABL1激酶活性［79］。在上述例子中，NMHCIIB 和ABL1很可能起到支架蛋白的作用，輔助和促進(jìn)IRE1 寡聚體形成。

UPR 感受器的翻譯后修飾是另一種激活UPR的手段。蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）是胞質(zhì)定位的蛋白激酶，在糖脂代謝中發(fā)揮重要作用。PKA 能直接磷酸化位于IRE1α 活性區(qū)的Ser724，這是IRE1α 上高度保守的磷酸化位點(diǎn)。PKA 是除IRE1 外第一個(gè)報(bào)道的磷酸化IRE1α 的激酶，其對(duì)IRE1α的磷酸化在胰高血糖素信號(hào)途徑中扮演重要角色［80］。E3 泛素連接酶CHIP（carboxyl terminus of HSC70-interacting protein） 能 催 化IRE1α的泛素化，其中一個(gè)泛素化位點(diǎn)Lys545突變?yōu)榫彼釟埢髸?huì)下調(diào)IRE1α 的磷酸化。CHIP 催化的IRE1α 泛素化對(duì)IRE1α 下游XBP1 信號(hào)沒有影響，但是能增強(qiáng)IRE1α-TRAF2 互作及其下游JNK磷酸化［81］。這種特異激活I(lǐng)RE1α 激酶結(jié)構(gòu)域、但不影響RNase活性的激活特點(diǎn)是目前已知的、來自ER的UPR激活信號(hào)所不具備的。此外，多腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly（ADP-ribose）polymerase，PARP）催化多個(gè)ADP-核糖分子轉(zhuǎn)移至靶蛋白的翻譯后修飾，研究發(fā)現(xiàn)PARP16 能聚ADP-核糖基化IRE1α 和PERK，但不會(huì)修飾ATF6。在沒有ER 應(yīng)激的情況下，該修飾也能導(dǎo)致IRE1α和PERK的激活［82］。PARP16 是ER 跨膜蛋白，其酶活結(jié)構(gòu)域位于胞質(zhì)，可見這種修飾發(fā)生在胞質(zhì)側(cè)；但PARP16的C 端位于ER腔部分對(duì)于其激活I(lǐng)RE1 和PERK也是必需的。在用Tm 誘導(dǎo)ER 應(yīng)激發(fā)生的前提下，PARP16 能減少IRE1α 和PERK 與BiP 互作，因此PARP16的ER腔段和胞質(zhì)段對(duì)IRE1α和PERK的激活均有作用［82］。

判斷一個(gè)蛋白質(zhì)激活UPR是否需要ER腔內(nèi)未折疊蛋白信號(hào)為前提的標(biāo)準(zhǔn)是，該蛋白質(zhì)是否能激活缺失LD的UPR感受器。遺憾的是，這方面的研究非常少，主要障礙在于過表達(dá)的、缺失LD 的IRE1 和PERK 能自發(fā)激活。如果通過基因編輯技術(shù)直接改造內(nèi)源基因，對(duì)于回答這一問題將有很大幫助。

4.2 Ca2+離子

ER是細(xì)胞內(nèi)的“鈣庫”，其腔內(nèi)Ca2+濃度上千倍于胞漿中Ca2+濃度，ER膜定位的鈣泵SERCA和鈣通道蛋白IP3R、RyR等能調(diào)控ER內(nèi)外Ca2+濃度，影響ER穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞生命活動(dòng)。破壞ER的Ca2+穩(wěn)態(tài)是常用的ER應(yīng)激誘導(dǎo)方式之一，但是對(duì)于這究竟如何激活UPR，目前并不清楚。最直接的可能是ER 腔依賴的蛋白質(zhì)折疊受阻，導(dǎo)致未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白的大量累積。值得注意的是，近期的研究發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)Ca2+濃度上升也可能是PERK活化的直接因素。SERCA 活性受抑制時(shí)，胞質(zhì)Ca2+濃度的升高能迅速上調(diào)PERK磷酸化水平，甚至對(duì)于缺失LD 的PERK 也是如此［83］。進(jìn)一步研究揭示，Ca2+能直接結(jié)合并穩(wěn)定PERK 胞質(zhì)段，但Ca2+對(duì)PERK磷酸化的促進(jìn)仍然需要Mg2+，后者是激酶輔因子［84］。Ca2+究竟以何種方式結(jié)合PERK，又是如何調(diào)控PERK構(gòu)象變化，還需要進(jìn)一步研究。

5 來自胞外的UPR激活信號(hào)

5.1 細(xì)胞膜受體介導(dǎo)的UPR激活

生理水平UPR 的激活不局限于單個(gè)細(xì)胞，來自胞外的信號(hào)也能激活UPR。Toll 樣受體（Tolllike receptor，TLR）在感知病原入侵和激活免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。巨噬細(xì)胞的TLR 通路能特異性激活I(lǐng)RE1α 及其下游XBP1mRNA 剪接，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生［85-86］。TLR4 和TLR2 通過誘導(dǎo)NADPH 氧化酶2（NOX2）的表達(dá)來激活I(lǐng)RE1α，但具體分子機(jī)制未知［85］。另一項(xiàng)研究顯示，腫瘤壞死因子受體關(guān)聯(lián)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）在TLR 介導(dǎo)的IRE1α活化中起重要作用，TRAF6造成IRE1α泛素化，而這抑制了IRE1α與催化其去磷酸化的磷酸酶PP2A 的相互作用，導(dǎo)致IRE1α 活性上升［86］。XBP1是在研究B細(xì)胞抗原呈遞時(shí)發(fā)現(xiàn)的［18］?？紤]到IRE1α-XBP1通路在免疫反應(yīng)中的重要性，其處于TLR 信號(hào)下游并不奇怪。TLR 信號(hào)激活I(lǐng)RE1α-XBP1還能上調(diào)前列腺素2 （prostaglandin H2，PGH2）的生物合成，在小鼠的痛覺反應(yīng)中發(fā)揮重要功能［87］。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生。VEGF 能快速激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）中IRE1α、PERK 和ATF6 三條UPR 通路，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明UPR 的激活對(duì)于血管新生至關(guān)重要。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，VEGF 是通過激活PLCγ、進(jìn)而激活mTORC1 來促進(jìn)UPR 活化的。雖然沒有明確的證據(jù)，但推測(cè)VEGF 受體參與了VEGF-PLCγmTORC1-UPR信號(hào)傳遞［88］。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 （brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員之一，在神經(jīng)元的分化、成長(zhǎng)與重塑中起重要作用。BDNF 能在神經(jīng)元中特異性激活I(lǐng)RE1α-XBP1信號(hào)通路［89］。和IRE1α在對(duì)胰高血糖素信號(hào)應(yīng)答中一樣，BDNF也是通過促進(jìn)PKA對(duì)IRE1α的磷酸化實(shí)現(xiàn)的［90］。推測(cè)BDNF 的受體原肌球蛋白相關(guān)激酶B（tropomyosin-related kinase B，TrkB）在BDNF激活I(lǐng)RE1α的過程中起作用。

5.2 細(xì)胞非自主的UPR

細(xì)胞非自主的UPR是近年來提出的一個(gè)概念，指細(xì)胞將ER應(yīng)激信號(hào)以某種方式傳遞到其他細(xì)胞并在信號(hào)接收細(xì)胞中激活的UPR。這一現(xiàn)象已在不同類型細(xì)胞、組織和器官中被觀察到，包括秀麗線蟲的神經(jīng)細(xì)胞-腸道細(xì)胞、小鼠下丘腦POMC 神經(jīng)元-肝臟細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞-免疫細(xì)胞、心肌細(xì)胞-巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞-肝細(xì)胞、肌細(xì)胞-肌細(xì)胞等［91-102］。其中一些研究鑒定到供體細(xì)胞的IRE1α-XBP1信號(hào)是產(chǎn)生細(xì)胞非自主UPR的必要條件，但這是否適用于所有情況還有待檢驗(yàn)［93-94，98］。對(duì)于跨細(xì)胞信號(hào)傳遞方式，有研究認(rèn)為分泌因子以小細(xì)胞外囊泡（small extracellular vesicle，sEV）形式傳遞，比如在肌細(xì)胞和肌細(xì)胞間的傳遞［102］。也有報(bào)道稱肝細(xì)胞-肝細(xì)胞之間是通過細(xì)胞間連接傳遞信號(hào)的［99］。但更多的研究中并未對(duì)該問題作出清晰的回答。

哪些分子的跨細(xì)胞傳遞導(dǎo)致細(xì)胞非自主UPR的發(fā)生？在秀麗線蟲中，神經(jīng)細(xì)胞分泌的酪胺能激活腸道細(xì)胞IRE1-XBP1 通路［98］。棕櫚酸刺激導(dǎo)致ER 應(yīng)激發(fā)生的肌細(xì)胞則通過傳遞神經(jīng)酰胺到下游肌細(xì)胞，激活下游細(xì)胞IRE1α-XBP1 通路［102］。在肝細(xì)胞癌中，發(fā)生ER 應(yīng)激的癌細(xì)胞通過上調(diào)高爾基蛋白73（Golgi protein 73，GP73）的分泌，激活腫瘤浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞UPR［97］。

從以上例子可以看出，細(xì)胞非自主UPR 可能沒有統(tǒng)一的激活機(jī)制，而是存在細(xì)胞和組織特異性。在不同的ER 應(yīng)激條件下，細(xì)胞也可能以不同的方式啟動(dòng)UPR 信號(hào)的跨細(xì)胞傳遞。該領(lǐng)域還有很多問題有待深入研究。

5.3 其他環(huán)境因素

UPR 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，大量研究報(bào)道腫瘤細(xì)胞中存在UPR 的激活。腫瘤細(xì)胞自身的基因突變是UPR 活化的原因之一，腫瘤細(xì)胞所處環(huán)境的特殊性也可能在UPR激活中起重要作用。缺氧是腫瘤微環(huán)境的特征之一，細(xì)胞培養(yǎng)中低氧應(yīng)激能導(dǎo)致UPR，但這往往需要很低的氧分壓（1%或更低），在接近生理病理?xiàng)l件（1%~5% O2）條件下UPR 只有微弱的激活。缺氧干擾了蛋白質(zhì)的氧化折疊，造成ER 應(yīng)激；氧氣對(duì)于脂質(zhì)去飽和化也是必需的，脂質(zhì)飽和度增加會(huì)影響ER體積的擴(kuò)張，不利于ER應(yīng)激的緩解，此外也會(huì)造成LBS［71，103］。缺氧導(dǎo)致IRE1-XBP1 信號(hào)通路激活，研究發(fā)現(xiàn)XBP 可以 與缺氧誘導(dǎo)因子1α （hypoxia-inducing factor 1α，HIF1α）結(jié)合，共同促進(jìn)HIF1α 靶基因的轉(zhuǎn)錄［104］。缺氧會(huì)下調(diào)蛋白質(zhì)翻譯，這對(duì)于腫瘤細(xì)胞而言是一種保護(hù)措施，PERK的缺失不利于翻譯水平的下降［105］。缺氧也會(huì)造成細(xì)胞活性氧水平上升，干擾蛋白質(zhì)糖基化［106］。PERK 可以誘導(dǎo)谷胱甘肽合成，從而降低缺氧應(yīng)激下細(xì)胞活性氧水平［107］。

酸性環(huán)境是另一種造成UPR 的因素。腫瘤細(xì)胞糖酵解產(chǎn)生乳酸造成pH 值下降，乳酸和低氧共同刺激下腫瘤細(xì)胞XBP1、CHOP 和ATF3 表達(dá)上升［108］。在內(nèi)皮細(xì)胞中，微酸性環(huán)境（pH 6.4）能導(dǎo)致eIF2α 和IRE1α 磷酸化，上調(diào)ATF3、ATF6f 和XBP1mRNA 剪接水平［109］。質(zhì)子感應(yīng)G 蛋白偶聯(lián)受體GPR4 和GPR68 在酸性激活UPR 中起作用［109-110］。

葡萄糖缺乏和過多也被報(bào)道能激活UPR。葡萄糖缺乏影響蛋白質(zhì)糖基化，可以造成ER 應(yīng)激［111］。葡萄糖缺乏影響胰島β 細(xì)胞的SERCA 活性，干擾ER腔Ca2+穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)PERK和eIF2α磷酸化［112］。高糖刺激也能激活β 細(xì)胞IRE1α 通路，但具體機(jī)制尚不清楚［88］。代謝相關(guān)疾病如糖尿病、肥胖等，往往伴隨著UPR 信號(hào)上調(diào)，這是否能歸結(jié)于高糖高脂刺激還有待研究。

UPR 與很多疾病密切相關(guān)，在癌癥、代謝性疾病、神經(jīng)退行性疾病中均有UPR 通路激活的報(bào)道［113］。以上舉例說明腫瘤和代謝疾病中環(huán)境因素導(dǎo)致UPR 激活。需要指出，生理和生理病理?xiàng)l件下UPR 的研究更多關(guān)注其生理意義，忽視了對(duì)UPR 激活機(jī)制的細(xì)致探究。復(fù)雜環(huán)境下UPR 的激活很可能是多種因素綜合作用的結(jié)果。

6 討論和展望

迄今為止，IRE1 是了解最多的UPR 感受器，也是已知的唯一能切割XBP1 mRNA、啟動(dòng)XBP1 mRNA 剪接的蛋白質(zhì)。已知的PERK 和ATF6 下游信號(hào)則并非僅位于這兩個(gè)UPR 感受器下游。尤其需要注意的是，PERK-eIF2α 通路屬于整合應(yīng)激響應(yīng)（integrated stress response，ISR）的一支，ISR還包括另外3 條通路：PKR、GCN2 和HRI。在氨基酸缺乏、線粒體應(yīng)激、氧化應(yīng)激等條件下，ISR通路的激活均可引起eIF2α 磷酸化，繼而上調(diào)ATF4、CHOP的表達(dá)（圖6）［114］。一些研究將上述ISR 下游信號(hào)歸結(jié)于PERK 激活，但并沒有驗(yàn)證PERK磷酸化水平是否上升，這有可能得出錯(cuò)誤的結(jié)論。

UPR 和疾病密切相關(guān)，但對(duì)生理病理?xiàng)l件下UPR 激活機(jī)制的研究很困難，這一方面是因?yàn)檫@些條件下UPR 激活很可能是多種因素綜合作用所致，另一方面也因?yàn)檠芯空吒P(guān)注UPR 激活的生理意義。事實(shí)上，對(duì)UPR 生理功能的認(rèn)識(shí)很多來自UPR 感受器基因敲除實(shí)驗(yàn)，缺乏嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)說明，在野生型細(xì)胞或個(gè)體中相同的生理?xiàng)l件下UPR感受器確實(shí)被激活。

UPR 與未折疊蛋白的關(guān)系是另一個(gè)值得關(guān)注的問題。雖然最初的UPR概念是指細(xì)胞對(duì)ER內(nèi)未折疊蛋白累積這一信號(hào)的應(yīng)答，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，UPR 也能以不依賴于未折疊蛋白的方式被激活。厘清UPR激活與未折疊蛋白累積間的關(guān)系，對(duì)于深入理解UPR 激活機(jī)制至關(guān)重要。然而，目前缺乏實(shí)用的檢測(cè)ER 腔內(nèi)未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白的工具。硫黃素T（thioflavin T，ThT）染料與蛋白質(zhì)聚集體結(jié)合后熒光信號(hào)增強(qiáng)，被用于檢測(cè)蛋白質(zhì)聚集體，但該染料更適用于檢測(cè)淀粉樣沉淀［115-117］。有研究表明，ThT能用于檢測(cè)ER內(nèi)未折疊蛋白聚集，其實(shí)用性尚需更多的實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)［117］。近期報(bào)道一種ER 腔定位的Halo 蛋白突變體（AgHalo（ER）），這種突變體容易發(fā)生錯(cuò)誤折疊和聚集，同時(shí)能被小分子熒光探針標(biāo)記，因而可用于指示ER蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)［64，118］。但AgHalo（ER）只對(duì)熱應(yīng)激有反應(yīng)，且長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)會(huì)自發(fā)聚集，限制了其應(yīng)用［118］。開發(fā)更好的檢測(cè)ER 腔內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的工具對(duì)于推進(jìn)UPR機(jī)制研究很有必要。

Fig. 6 The four signal pathways of the integrated stress response圖6 整合應(yīng)激響應(yīng)的四條信號(hào)通路