線粒體轉(zhuǎn)移核糖核酸（mt-tRNA）的?；撬嵝揎?
——紀(jì)念鄒承魯先生百年誕辰

彭桂鑫 王恩多** 周小龍

（1）中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心/上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，分子生物學(xué)國家重點實驗室，上海 200031；2）中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100864；3）上海科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 201210）

轉(zhuǎn)移核糖核酸（tRNA）是蛋白質(zhì)合成的接頭分子，攜帶對應(yīng)的氨基酸，在核糖體上其反密碼子與信使RNA（mRNA）上的密碼子精確配對，按mRNA 的序列合成蛋白質(zhì)，在基因信息傳遞過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［1］。tRNA 通常由70~90 個核苷酸組成，具有三葉草型二級結(jié)構(gòu)和倒L型的三級結(jié)構(gòu)，包括氨基酸接受莖、二氫尿嘧啶莖/環(huán)（D莖/環(huán)）、反密碼子莖/環(huán)、可變莖/環(huán)、TΨC莖/環(huán)和CCA 3'端［2-3］（圖1）。tRNA 分子上各個堿基有一套固定的命名規(guī)則，例如，反密碼子統(tǒng)一標(biāo)注為34-35-36 位，CCA 末端統(tǒng)一標(biāo)注為74-75-76 位。tRNA 的成熟過程包括一系列的轉(zhuǎn)錄后加工，并且在核苷酸上添加多種化學(xué)修飾。截至目前，RNA上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約150 種修飾，其中tRNA 修飾占約80%［4］。這些tRNA修飾大多位于D莖/環(huán)、反密碼子莖/環(huán)、可變莖/環(huán)和TΨC 莖/環(huán)，各自具有不同的作用。其中位于D 莖/環(huán)、可變莖/環(huán)和TΨC 莖/環(huán)的修飾，可以穩(wěn)定tRNA 結(jié)構(gòu)和促進(jìn)正確折疊，并增強(qiáng)tRNA與相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用。位于反密碼子莖/環(huán)上的修飾最多，大多數(shù)集中在34 和37位，其中擺動（Wobble）位34 位的修飾在穩(wěn)定密碼子和反密碼子的配對、擴(kuò)展tRNA 的解碼能力、確保蛋白質(zhì)合成的精確性方面起著關(guān)鍵作用［5-6］，37位的修飾具有增強(qiáng)堿基堆疊和防止U33∶A37的環(huán)內(nèi)堿基配對的作用，以提高翻譯的保真性［7-8］，維持tRNA反密碼子莖和環(huán)結(jié)構(gòu)［9］。

線粒體通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，為細(xì)胞提供能量［10］。線粒體有自己獨立的基因組。哺乳動物的線粒體DNA（mtDNA）有37 個基因，編碼2 種核糖體RNA（rRNA）和22 種tRNA，用于解碼mtDNA編碼的11種mRNA，產(chǎn)生13種負(fù)責(zé)呼吸鏈復(fù)合物功能和組裝的蛋白質(zhì)亞基［11］。哺乳動物線粒體的解碼系統(tǒng)有別于經(jīng)典的遺傳學(xué)密碼，AUA密碼子編碼甲硫氨酸（Met），UGA 密碼子編碼色氨酸（Trp），AGA和AGG是終止密碼子［12］。線粒體蛋白質(zhì)合成是線粒體中最重要的生命活動之一，調(diào)控氧化磷酸化和呼吸鏈復(fù)合物活性，影響細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)。

Fig. 1 Secondary and tertiary structures of canonical tRNA圖1 tRNA的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)

已經(jīng)報道人類22種mt-tRNA的137個位點存在18 種tRNA 修飾，牛mt-tRNA 的118 個位點存在15種tRNA 修飾［13-14］。雖然mt-tRNA 存在諸多修飾，但只有2-甲基硫代-N6-蘇氨酰氨甲?；佘眨?-methylthio-N6-isopentenyl adenosine， ms2i6A）、5-甲酰胞苷（5-formylcytidine，f5C）、5-?；撬峒谆?2-硫 尿 苷 （5-taurinomethyl-2-thiouridine，τm5s2U）和5-?；撬峒谆蜍眨é觤5U）4 種修飾特異地存在于mt-tRNA 上。τm5U 和τm5s2U 修飾（統(tǒng)稱為?；撬嵝揎棧┌l(fā)生在mt-tRNA 的U34 位（圖2），其中τm5U 在亮氨酸t(yī)RNA UUR（mt-tRNALeu（UUR））和色氨酸t(yī)RNA（mt-tRNATrp），τm5s2U在賴 氨 酸t(yī)RNA （mt-tRNALys）、 谷 氨 酸t(yī)RNA（mt-tRNAGlu）和谷氨酰胺tRNA （mt-tRNAGln）（表1）［13，15］。這兩種修飾在21 世紀(jì)初通過質(zhì)譜法已經(jīng)被鑒定［16-17］。有趣的是，真海鞘mt-tRNAMet（AUR）和mt-tRNAGly（AGR）（R 為嘌呤核苷酸A或G） 上也發(fā)現(xiàn)了τm5U 修飾［18］，而長槍烏賊mt-tRNALeu（UUR）存在τm5s2U 修飾（表1）［19］。在細(xì)菌和酵母中，具有與哺乳動物τm5U和τm5s2U高度相似的修飾，分別稱為5-羧甲基氨甲基尿苷（5-carboxymethylaminomethyluridine，cmnm5U） 和5-羧甲基氨甲基2-硫尿苷（5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine， cmnm5s2U）修飾［20］（圖2）。

Fig. 2 The biosynthesis of τm5（s2）U and cmnm5（s2）U圖2 τm5（s2）U和cmnm5（s2）U的生物合成過程

Table 1 Taurine modifications and its similar modifications表1 ?；撬嵝揎椉捌漕愃菩揎?/p>

研究表明，?；撬嵝揎椌哂兄匾纳飳W(xué)意義，并且與線粒體疾病的發(fā)生密切相關(guān)。τm5U 和τm5s2U 修飾可以促進(jìn)對NNR （N 為4 種核苷酸U、C、A或G；R為嘌呤核苷酸A或G）密碼子的精確解碼，防止NNY（Y為嘧啶核苷酸U或C）密碼子的錯誤識別。mt-tRNALeu（UUR）上的A3243G 突變導(dǎo)致τm5U 修飾缺乏，引起線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作（mitochondial encephalomyopathy with lactic acidosis and strokelike episode，MELAS）［21-22］（圖3）；類似的情況是，mt-tRNALys上的A8344G 突變導(dǎo)致τm5s2U 修飾缺乏，引起肌陣攣性癲癇伴破碎紅纖維綜合征（myoclonic epilepsy associated with ragged red fiber，MERRF）［16，23］（圖3）。雖然上述疾病已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20多年，但是潛在的致病分子機(jī)制依然未知。研究?；撬嵝揎椉捌湫揎椕?，有助于更好地理解其生物學(xué)功能，為后續(xù)闡述牛磺酸修飾缺陷導(dǎo)致相關(guān)疾病的潛在機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

Fig. 3 Pathogenic point mutations associated with MELAS and MERRF on human mitochondrial tRNAs圖3 人mt-tRNA上與MELAS和MERRF相關(guān)的致病點突變

1 牛磺酸修飾及其類似形式修飾

1.1 τm5U

2002 年，日本學(xué)者Kimitsuna Watanabe 發(fā)現(xiàn)了牛mt-tRNA 的τm5U 修飾，揭示?；撬幔╰aurine）作為生物大分子參與τm5基團(tuán)的形成（圖2）。哺乳動物中，GTP 結(jié)合蛋白質(zhì)3（GTP binding protein 3， GTPBP3） 和線粒體翻譯優(yōu)化蛋白1（mitochondrial tRNA translation optimization 1，MTO1）高度保守并催化τm5U 的修飾。在細(xì)菌和酵母中同源蛋白質(zhì)分別是MnmE 和MSS1（對應(yīng)GTPBP3）、MnmG 和MTO1（對應(yīng)MTO1）［24-26］。在哺乳動物線粒體中，GTPBP3和MTO1形成復(fù)合物，利用?；撬帷?,10-亞甲基四氫葉酸（5,10-CH2-THF）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、鳥苷三磷酸（GTP）作為反應(yīng)底物和其他輔因子共同催化τm5U修飾［15］（圖2）。在這個過程中，絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2（serine hydroxymethyltransferase，SHMT2）首先將絲氨酸（serine）轉(zhuǎn)化成甘氨酸（glycine），然后絲氨酸的β-C 轉(zhuǎn)移至四氫葉酸THF，以此合成5,10-CH2-THF［27］，然后5,10-CH2-THF 在反應(yīng)中為τm5U第5位的甲基提供1C來源。雖然催化τm5U修飾的底物及修飾酶已經(jīng)明確，但是具體的生物合成過程以及催化步驟依然不清楚，且體外重組τm5U 修飾效率極低（3.3%）。有趣的是，大腸桿菌MnmE 和MnmG可以利用?；撬岷推渌牡孜?，在體外有限地合成τm5U［15］，暗示隨著線粒體不斷進(jìn)化，GTPBP3/MTO1 復(fù)合物逐漸能夠特異性識別?；撬帷Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)HeLa 細(xì)胞時去掉培養(yǎng)基中的牛磺酸，τm5U 修飾的豐度會急劇下降，隨后添加高濃度的?；撬幔觤5U 修飾的豐度有一定程度的恢復(fù)［15］，這說明細(xì)胞內(nèi)的?；撬釢舛瓤梢詣討B(tài)調(diào)控體內(nèi)τm5U 修飾的豐度。在貓和比目魚的動物實驗中，也觀察到類似的結(jié)果，進(jìn)一步證明從細(xì)胞外攝入的?；撬峥梢宰對觤5U修飾維持在較高的豐度，揭示了?；撬嵩谏砩系闹匾?。τm5U 修飾調(diào)控核糖體A位點密碼子和反密碼子的配對，通過穩(wěn)定U∶G 的擺動配對，促進(jìn)對UUG 密碼子的有效解碼［21，28］。

1.2 τm5s2U

τm5s2U 是在τm5U 的基礎(chǔ)上，34 位核苷酸尿嘧啶的第二位氧被硫取代而成（圖2）。τm5s2U的τm5和s2修飾是相互獨立的，沒有修飾的先后之分。線粒體tRNA 特異性2-硫代尿苷酶1（mitochondrial tRNA-specific 2-thiouridylase 1，MTU1）特異性催化mt-tRNA 的s2修飾［29］，其在細(xì)菌和酵母中的同源蛋白質(zhì)分別是MnmA 和MTU1；細(xì)胞質(zhì)tRNA 的s2修飾由Urm1/Uba4/NCS2/NCS6/TUM1 催化［30-31］，但是這些過程的具體底物和反應(yīng)步驟尚不清楚。在酵 母 中， 敲 除MTU1會 引 起mt-tRNALys、mt-tRNAGlu、mt-tRNAGln的s2修飾缺陷以及這些tRNA 穩(wěn)態(tài)水平降低，進(jìn)而影響線粒體翻譯和酵母生長［29，32］。人MTU1基因突變會引起可逆性嬰兒肝衰竭（reversible infantile liver failure，RILF），導(dǎo)致mt-tRNA 的s2修飾水平顯著降低［33-34］。MTU1純合敲除小鼠在胚胎發(fā)育的第8 天前后就會死亡。另外，特異性敲除MTU1小鼠，其肝細(xì)胞線粒體翻譯和呼吸鏈復(fù)合物活性受到嚴(yán)重?fù)p傷［35］，證明s2修飾缺失導(dǎo)致的線粒體功能障礙是引起RILF 的主要原因。

1.3 cmnm5U和cmnm5s2U

1981 年，在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）tRNALys反密碼子環(huán)的34 位上發(fā)現(xiàn)了cmnm5U 和cmnm5s2U修飾（圖2）［36］，這兩種修飾廣泛存在于各類細(xì)菌、酵母和古菌中。cmnm5U修飾存在于細(xì)菌tRNALeu（UAA）、tRNAArg（UCU） 和tRNAGly（UCC）（表1）；cmnm5s2U修飾存在于細(xì)菌 tRNALys（UUU）、 tRNAGlu（UUC）、tRNAGln（UUG），酵母mt-tRNALys、mt-tRNAGlu和mt-tRNAGln，以及古菌甲 烷 球 菌（Methanococcus maripaludis） tRNALys（UUU）（表1）［20，37-39］。對古菌和酵母細(xì)胞質(zhì)的tRNA 修飾圖譜了解不多，它們的其他tRNA 上或許也存在cmnm5U 修飾。cmnm5U 相較于τm5U，甘氨酸參與cmnm5基團(tuán)的形成，而不是?；撬幔▓D2）。在大腸桿菌中，MnmE和MnmG形成α2β2異源四聚體復(fù)合物，利用與τm5U 修飾反應(yīng)過程中相似的底物和輔因子，催化cmnm5U 形成［20，40］（圖2）。在大腸桿菌中，MnmA、IscS和TusA-E共同負(fù)責(zé)cmnm5s2U中s2修飾的生成［41-42］；在酵母中，MTU1 催化cmnm5s2U 中s2修飾的生成［29］。然而，MnmE/MnmG 復(fù)合物和MnmA 在催化過程中發(fā)揮的作用，以及反應(yīng)過程中的關(guān)鍵步驟還不清楚。此外，MnmE 和MnmG 是某些人類病原體毒性的重要調(diào)控元件［43-44］，暗示cmnm5U修飾對它們的生存至關(guān)重要。有趣的是，當(dāng)培養(yǎng)基不含?；撬崤囵B(yǎng)細(xì)胞時，cmnm5U 出現(xiàn)在人mt-tRNALeu（UUR） 和mt-tRNATrp上，cmnm5s2U出現(xiàn)在人mt-tRNAGlu和mt-tRNAGln上，后續(xù)回補(bǔ)?；撬?，cmnm5U 和cmnm5s2U則完全檢測不到，而τm5U和τm5s2U的豐度會逐漸增加［15］，表明在?；撬崛狈Φ沫h(huán)境下，GTPBP3/MTO1 復(fù)合物會利用甘氨酸合成微量的cmnm5U。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，cmnm5U 和cmnm5s2U分別天然存在于人mt-tRNATrp和mt-tRNAGln上（表1）［14］。從某種程度上說，cmnm5U和cmnm5s2U修飾是哺乳動物線粒體翻譯的一個替代修飾，但是哺乳動物mt-tRNA 中cmnm5U 和cmnm5s2U 修飾的生物學(xué)功能和意義尚不清楚，猜測可能與τm5U、τm5s2U功能類似。

2 τm5U修飾酶與線粒體疾病

2.1 GTPBP3

2.1.1人類GTPBP3（hGTPBP3）的GTPase活性根據(jù)序列比對和海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）MnmE 的 結(jié) 構(gòu)，hGTPBP3 有3 個 結(jié) 構(gòu)域，分別是N 端結(jié)構(gòu)域、G 結(jié)構(gòu)域、螺旋結(jié)構(gòu)域。其中，N 端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與5,10-CH2-THF 結(jié)合以及蛋白質(zhì)二聚化；G 結(jié)構(gòu)域有G1、G2、G3 和G4 四個基序，能夠結(jié)合和水解GTP，行使催化功能。最近本課題組［45］鑒定了hGTPBP3的成熟形式，確定其進(jìn)入線粒體的信號肽序列為N 端前20 個氨基酸殘基，揭示hGTPBP3 是一個有活力的GTPase，確定其以同源二聚體的形式行使GTP 水解功能。大腸桿菌MnmE 的G 結(jié)構(gòu)域擁有和全長MnmE 一樣高的GTPase 活力［46］，然而hGTPBP3 的G 結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出極低的GTPase 活力。研究表明，失去GTP 水解功能的MnmE 突變體無法對體內(nèi)的tRNA進(jìn)行修飾，證明MnmE 的GTPase 活力對cmnm5U的形成是必要的［20］。在MSS1基因敲除的酵母中回補(bǔ)hGTPBP3，可以拯救酵母生長［47］，回補(bǔ)GTPase活力缺陷的hGTPBP3突變體卻無法拯救酵母生長，表明hGTPBP3的GTP水解能力對τm5U修飾的功能很重要。

2.1.2hGTPBP3基因突變與線粒體疾病

全外顯子組測序鑒定到hGTPBP3基因上存在純合或者復(fù)合雜合的單點突變、雙點突變或者刪除突變，這些突變會引起線粒體缺陷相關(guān)疾病，病人表現(xiàn)為肥厚性心肌病、乳酸血癥及腦病［13］，但是潛在的致病分子機(jī)制未知。大部分的突變是錯義單點突變，遍布hGTPBP3 的N 端到C 端，以G 結(jié)構(gòu)域和螺旋結(jié)構(gòu)域最為集中。研究發(fā)現(xiàn)，在hGTPBP3 致病突變細(xì)胞系中，線粒體翻譯和氧氣消耗能力受損進(jìn)而造成線粒體功能障礙［48］。本課題組［45］的研究結(jié)果顯示，一些hGTPBP3致病突變體的體外GTPase活力和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)水平顯著降低，而這些不穩(wěn)定的突變體通過泛素-蛋白酶體途徑降解。該研究還揭示hGTPBP3 的R3L 突變會影響其線粒體定位，E142-R136 和E159-R431 的相互作用對于維持hGTPBP3 結(jié)構(gòu)與功能至關(guān)重要，而hGTPBP3-E142K和hGTPBP3-E159V的突變破壞了這種相互作用，可能是引發(fā)疾病的主要原因［45］。盡管hGTPBP3基因上一系列致病點突變導(dǎo)致線粒體疾病的生化與細(xì)胞基礎(chǔ)已經(jīng)建立，但是這些突變是否影響τm5U修飾尚需進(jìn)一步驗證。在HEK293T中敲除hGTPBP3會導(dǎo)致τm5U修飾缺陷，線粒體翻譯受損以及氧化磷酸化效率降低［15］。令人意外的是，gtpbp3敲除的斑馬魚卻表現(xiàn)出mt-tRNA氨基?；士傮w升高，而這種mt-tRNA 的異常代謝，顯著減少了ATP 的生成，造成氧化磷酸化失衡，最終可能導(dǎo)致心臟發(fā)育缺陷［49］。

2.1.3hGTPBP3的新蛋白質(zhì)同源異構(gòu)體

NCBI 和UniProt 數(shù)據(jù)庫顯示hGTPBP3 有4 個同源異構(gòu)體，其中前3個同源異構(gòu)體在N端有一段進(jìn)入線粒體的信號肽，而第4 個hGTPBP3 同源異構(gòu)體7（hGTPBP3-Iso7）的N 端則完全與它們不同。本課題組［45］發(fā)現(xiàn)了一個新的hGTPBP3-Iso7，與數(shù)據(jù)庫的相比，它僅少了1個外顯子，其他序列都一致，并且確定它在人的諸多細(xì)胞系里都存在。有趣的是，該hGTPBP3-Iso7 以同源二聚體的形式在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在，說明它并不參與τm5U 的生成，暗示其有未知的新功能，有可能在信號通路中起GTP水解的作用。

2.2 MTO1

人類MTO1（hMTO1）是高度保守的mt-tRNA修飾酶，根據(jù)超嗜熱菌（Aquifex aeolicus）MnmG的晶體結(jié)構(gòu)［50］，hMTO1 可能在修飾τm5U 過程中結(jié)合FAD，負(fù)責(zé)與tRNA結(jié)合，但這些都需要進(jìn)一步驗證。在酵母中敲除MTO1基因，會導(dǎo)致線粒體呼吸和翻譯受損，而回補(bǔ)hMTO1，可以拯救酵母生長［26］，表明hMTO1 可以代償酵母MTO1 的功能。hMTO1基因突變會引起多種病變，包括視神經(jīng)病變、認(rèn)知障礙、乳酸中毒和肥厚型心肌病［51-52］。很多病人會在出生后第1 年表現(xiàn)出癥狀，而有些病人則在出生后不久由于急性心臟功能障礙而死亡。這些致病性突變大部分是錯義單點突變，遍布hMTO1 的N 端到C 端，在人類基因組數(shù)據(jù)庫中罕見。在hMTO1基因突變病人的成纖維細(xì)胞中，呼吸鏈復(fù)合物I和IV活力下降，線粒體翻譯受到抑制以及線粒體內(nèi)蛋白酶激活［52］。小鼠細(xì)胞敲除Mto1，導(dǎo)致τm5U 修飾完全消失，嚴(yán)重影響氧化磷酸化復(fù)合物II 的組裝及其穩(wěn)定性［15，52］，同時損害內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)以及出現(xiàn)線粒體非折疊蛋白反應(yīng)（mitochondrial unfolded protein response，UPRmt）［53］。純合Mto1敲除的小鼠由于線粒體翻譯的嚴(yán)重?fù)p傷會在胚胎發(fā)育早期死亡，心臟特異性敲除的Mto1新生小鼠會在24 h內(nèi)死亡［53］，證明τm5U修飾對動物胚胎發(fā)育至關(guān)重要。

2.3 MELAS和MERRF

核基因和線粒體基因組的基因突變都可以導(dǎo)致線粒體功能障礙和代謝紊亂，造成人類疾?。ㄖ饕X病、肌病、腦肌?。y(tǒng)稱為線粒體疾?。?2］。已發(fā)現(xiàn)約400種基因突變導(dǎo)致的線粒體病，而 超 過200 種 定位 于22 種mt-tRNA 基 因中［54-55］。這些致病突變的致病機(jī)理不盡相同，包括影響tRNA 三級結(jié)構(gòu)、tRNA 修飾、tRNA 氨基?；?、核糖體解碼等多方面［56］。MELAS 和MERRF 是研究比較多的線粒體疾病。大約80%的MELAS病人攜帶mtDNA 上A3243G 的突變，導(dǎo)致mt-tRNALeu（UUR） 上的τm5U 缺失（圖3）。研究表明，mt-tRNALeu（UUR）因缺乏τm5U 修飾，無法解碼UUG密碼子，導(dǎo)致呼吸鏈復(fù)合物I和IV活力下降，進(jìn)而引發(fā)線粒體功能障礙［21］。在A8344G突變導(dǎo)致MERRF的患者中，mt-tRNALys缺 乏τm5s2U 修 飾（圖3），無法解碼AAA 和AAG 密碼子，造成線粒體翻譯缺陷和呼吸鏈復(fù)合物活性下降［21］。目前認(rèn)為s2修飾在MERRF 患者中對解碼效率起著關(guān)鍵作用，但是具體的分子機(jī)制有待研究。雖然A3243G（D 環(huán)）和A8344G（TΨC 環(huán)）位于不同tRNA基因的不同位置，但它們對tRNA的影響相似，充分說明了牛磺酸修飾對于維持正常生命活動的重要性。

3 治療?；撬嵝揎椚毕輰?dǎo)致線粒體疾病的潛在方法

MELAS 和MERRF 是比較嚴(yán)重且典型的線粒體疾病，潛在的分子致病機(jī)制依然不完全清楚。迄今為止，線粒體疾病尚無有效藥物，僅有一些候選藥物可以潛在地減輕由牛磺酸修飾缺陷引起的線粒體功能障礙。針對MELAS病人，?；撬崾悄壳白钚卵邪l(fā)的藥物。補(bǔ)充高濃度的?；撬?，可以提高τm5U修飾的豐度［57］。臨床試驗表明，口服?；撬釙岣擀觤5U修飾的豐度［58］。另一種藥物為?；切苋パ跄懰幔╰auroursodeoxycholic acid，TUDCA），它是一種?；撬崤悸?lián)的膽酸，可以作為分子伴侶促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊和預(yù)防蛋白質(zhì)的聚集［59］。研究表明，用TUDCA 處理小鼠Mto1敲除的細(xì)胞，會阻礙錯誤折疊蛋白質(zhì)的聚集，進(jìn)而抑制UPR 的細(xì)胞毒性和提高呼吸鏈復(fù)合物的活性［53］。在人體中已經(jīng)證明了TUDCA的安全性，同時該藥物在神經(jīng)疾病的臨床試驗中也取得了不錯的效果［60］。

除了藥物治療，遺傳學(xué)方法清除mtDNA 突變?nèi)諠u成為主流?；诙ㄎ挥诰€粒體的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）基因編輯技術(shù)可以靶向mtDNA［61］。研究發(fā)現(xiàn)，TALEN可以特異性地結(jié)合和切割帶有致病突變的mtDNA［62］，造成DNA 雙鏈斷裂。由于mtDNA的修復(fù)不像細(xì)胞核DNA那樣高效，雙鏈造成的斷裂會消除整個突變的DNA［63］。從理論上講，若TALEN可以應(yīng)用到人類卵母細(xì)胞，將可能預(yù)防線粒體疾病傳播到子代?？紤]到安全性，應(yīng)嚴(yán)格檢測TALEN在其他mtDNA區(qū)域的脫靶效應(yīng)。

傳統(tǒng)的CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)需要將RNA 引入線粒體，一直被認(rèn)為不適合治療線粒體疾病。最近新研發(fā)的單堿基編輯工具DddAderived cytosine base editor（DdCBE）可以在不產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂的情況下對mtDNA 進(jìn)行精確編輯。具體來說，介導(dǎo)雙鏈DNA 胞苷脫氨基化的細(xì)菌毒素DddA，它可以把胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U）。將DddA 與TALEN 和尿嘧啶糖基化酶抑制劑融合，構(gòu)建出RNA 非依賴的胞嘧啶堿基編輯器DdCBE，催化mtDNA 中C·G 到T·A 的高效特異性轉(zhuǎn)化［64-65］。DdCBE 不僅在人細(xì)胞中實現(xiàn)線粒體的成功編輯，更在人類早期胚胎中實現(xiàn)了高效的線粒體堿基編輯［66-67］。不過，DdCBE 依然有幾方面的缺陷：a. DddA 對哺乳動物細(xì)胞有毒；b. 尿嘧啶很容易從DNA 上切下來；c. 有非常嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)?？偟膩碚f，DdCBE 為線粒體疾病的機(jī)制研究和治療提供了十分有效的工具，是線粒體研究里程碑式的突破，不過后續(xù)需要繼續(xù)優(yōu)化，盡量減輕其副作用帶來的影響。此外，最近的研究提示，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)也可以在線粒體中發(fā)揮作用，但是其編輯效率尚需進(jìn)一步優(yōu)化［68］。

4 總結(jié)與展望

tRNA 作為接頭分子，精確解碼mRNA 的密碼子，為蛋白質(zhì)的生物合成提供原料。約10%~20%的 tRNA 堿基或核糖攜帶修飾，而大量的tRNA 修飾都集中在反密碼子環(huán)的擺動位34，保證翻譯精確性。至今為止，已經(jīng)鑒定超過30 種擺動位的修飾，它們調(diào)控tRNA解碼能力。哺乳動物線粒體的tRNA修飾圖譜已經(jīng)建立，而目前只發(fā)現(xiàn)了39種細(xì)胞質(zhì)tRNA修飾［69］。相比于高等真核生物，大腸桿菌tRNA有31種修飾，以及釀酒酵母tRNA有26種修飾已經(jīng)被鑒定，兩者tRNA修飾的功能得到了廣泛的研究［4］。此外，tRNA的修飾酶和催化機(jī)制還有諸多未知，這些修飾酶的功能也需進(jìn)一步探索。

有研究認(rèn)為，在MELAS或者M(jìn)ERRF病人中，GTPBP3/MTO1 復(fù)合物無法識別突變的tRNA，進(jìn)而導(dǎo)致牛磺酸修飾缺陷。臨床試驗發(fā)現(xiàn)口服?；撬釙p微提高mt-tRNALeu（UUR）上τm5U 修飾的豐度，有效減少病人中風(fēng)的再次發(fā)生［58］。tRNA修飾為動態(tài)調(diào)控，tRNA 修飾豐度會隨細(xì)胞環(huán)境的變化而變化。最近興起的基因編輯技術(shù)有望從基因水平治療疾病，但其效率、編輯種類、脫靶效應(yīng)、安全性等都需要進(jìn)一步優(yōu)化。

本課題組［45］的研究表明，不穩(wěn)定的hGTPBP3致病突變體，在人細(xì)胞中通過泛素-蛋白酶體途徑降解，而在酵母中能夠穩(wěn)定存在，這可能是由于酵母缺乏相應(yīng)的E3 連接酶所致。未來需進(jìn)一步尋找hGTPBP3 的E3 連接酶，通過添加小分子抑制劑，抑制E3連接酶活性，RNA干擾或蛋白質(zhì)靶向降解技術(shù)下調(diào)E3 連接酶蛋白質(zhì)含量等手段，讓不穩(wěn)定的hGTPBP3 致病突變體在細(xì)胞中穩(wěn)定存在，或許可以緩解hGTPBP3基因突變造成的線粒體疾病。

雖然體外重組τm5U 修飾已經(jīng)成功，但是重組效率太低。需要進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系和條件，如純化出高純度的酶，以及添加合適的輔因子，來提升τm5U 修飾重組的效率。深入研究高等真核生物的GTPBP3和MTO1，有利于加深對τm5U修飾生物合成途徑和生物學(xué)功能的理解，為揭示tRNA基因突變導(dǎo)致MELAS的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。