向海地區(qū)綠頭鴨體內(nèi)1膜殼屬(Hymenolepis spp.)絳蟲(chóng)的分離鑒定

劉 瑩 李 杰 李秀云 王麗新 翟琪安 沈冬冬 彭智偉 侯志軍*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，哈爾濱，150040；2.陜西佛坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，佛坪，723400；3.哈爾濱北方森林動(dòng)物園，哈爾濱，150332)

綠頭鴨(Anasplatyrhynchos)隸屬于雁形目(Anseriformes)鴨科(Anatidae)鴨屬，是向海地區(qū)一種常見(jiàn)的湖泊游禽，主要棲息于水生植物豐富的湖泊、河流、池塘、沼澤等水域中。綠頭鴨冬季和遷徙期間也出現(xiàn)于開(kāi)闊的水庫(kù)、江河、沙洲和海岸附近沼澤和草地[1]。水禽體內(nèi)寄生蟲(chóng)的種類繁多，不同地域不同鳥(niǎo)類感染寄生蟲(chóng)也不盡相同[2]。韓紅玉等在上海(2013)調(diào)查發(fā)現(xiàn)鳥(niǎo)類腸道寄生蟲(chóng)檢出率為 26.21%，以絳蟲(chóng)為主要優(yōu)勢(shì)種[3]。Hanno等在加利福尼亞北部的鳥(niǎo)類寄生蟲(chóng)的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了5種棘頭蟲(chóng)，24種線蟲(chóng)，8種絳蟲(chóng)和27種吸蟲(chóng)，其中絳蟲(chóng)的感染率最高[4]。寄生于鳥(niǎo)體內(nèi)的絳蟲(chóng)可引起鳥(niǎo)類的體重減輕或腸梗塞[5]。李大心等曾報(bào)道舌狀絳蟲(chóng)導(dǎo)致一只正當(dāng)繁殖季節(jié)的雄黑鶴腸穿孔死亡[6]。

由于形態(tài)學(xué)觀察并不能完全有效的進(jìn)行絳蟲(chóng)的種屬鑒定，分子生物學(xué)方法被廣泛用于寄生蟲(chóng)的分類研究[7]。如今，分子生物學(xué)在絳蟲(chóng)種類的鑒定上，已經(jīng)有了一個(gè)較為廣泛的應(yīng)用。Greiman等在通過(guò)對(duì)28S rDNA基因的擴(kuò)增，結(jié)合形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)創(chuàng)立了一個(gè)新屬[8]。此外，Yang等利用線粒體基因cox1和ITS進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)鑒定膜殼屬絳蟲(chóng)(Hymenolepisspp.)[9]，總之，已經(jīng)有越來(lái)越多的將分子生物學(xué)成功應(yīng)用于一些絳蟲(chóng)種類鑒定的報(bào)道[10]。顯然，膜殼科(Hymenolepididae)種屬的鑒定需要形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法的結(jié)合使用[11]。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

絳蟲(chóng)取自吉林省向海地區(qū)的綠頭鴨小腸內(nèi)，取出絳蟲(chóng)后，置于70%～75%的酒精內(nèi)保存，按照其宿主、寄生部位和采樣日期進(jìn)行編號(hào)，置于冰箱內(nèi)，用于形態(tài)學(xué)和分子學(xué)的鑒定。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑：無(wú)水乙醇，丁香油，蘇木素，中性樹(shù)膠。

1.2.2 將絳蟲(chóng)樣品進(jìn)行測(cè)量并記錄。絳蟲(chóng)蟲(chóng)體經(jīng)蘇木素染色制成標(biāo)本后置于光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。

蘇木素染色[12]：

1.2.2.1 壓片：70%的酒精中壓3～4 d。

1.2.2.2 洗脫：依次投入50%酒精(30 min)、30%酒精(20 min)、蒸餾水(10 min)中進(jìn)行洗脫。

1.2.2.3 染色：將樣品投入10倍稀釋的染色液中染色12 h。

1.2.2.4 脫水：將樣品依次投入30%、50%、70%酒精中各脫水30 min。

1.2.2.5 脫色：將樣品投入1%的酸酒精中進(jìn)行脫色8 min。

1.2.2.6 脫水：將樣品一次投入梯度酒精中脫水，80%酒精(30 min)、90%酒精(30 min)、95%酒精(20 min)、100%Ⅰ 酒精(10 min)、100%Ⅱ 酒精(5 min)。

1.2.2.7 透明：將樣品投入100%二甲苯中透明1～2 min。

1.2.2.8 封片：將樣品置于載玻片上，用中性樹(shù)膠固封。

1.3 分子鑒定

1.3.1 Biospin組織基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒(杭州博日科技有限公司產(chǎn)品、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、DNA Maker、 Proteinasse K、DL2000T寶生物工程有限公司)產(chǎn)品。

1.3.2 DNA提?。涸谝旱袑⑾x(chóng)體組織塊研磨粉粹，使用組織細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒提取 DNA，-20℃下保存。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)：cox1使用的引物參考Haukisalmi等設(shè)計(jì)的，目的片段長(zhǎng)度為730 bp[13]。引物序列詳細(xì)見(jiàn)表1。

1.3.4 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

反應(yīng)體系：PCR buffer 2.5 μL，MgCl22.0 μL，dNTP 2.5 μL，Primer1 1.0 μL，Primer2 1.0 μL，DNA 3.0 μL，蒸餾水 12.0 μL，Taq酶1.0 μL。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7 min。

表1cox1基因擴(kuò)增引物序列

Tab.1 Amplification of primer sequences of cox1

1.3.5 將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳下進(jìn)行觀察。

1.3.6 產(chǎn)物純化、連接及轉(zhuǎn)化

將純化擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收(杭州博日科技有限公司的膠回收試劑盒)，將純化后產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上，16℃過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，振蕩培養(yǎng)后涂布在含 Amp的培養(yǎng)基上，過(guò)夜培養(yǎng)后挑選白色的單菌落，配制菌液，對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定，篩選陽(yáng)性PCR產(chǎn)物被送到吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行Blast比對(duì)分析，確定蟲(chóng)種。

1.3.7 序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建(采用貝葉斯進(jìn)行建樹(shù))

所測(cè)絳蟲(chóng)基因序列(Hymenolepisspp.mallard)與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)上的其他膜殼科絳蟲(chóng)的cox1序列采用貝葉斯發(fā)建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)絳蟲(chóng)

采集日期：2015年10月2日

宿主位置：吉林省向海地區(qū)

檢獲數(shù)量：3條

模式樣本正模(NEFU-HY1923)，存放于東北林業(yè)大學(xué)寄生蟲(chóng)研究中心，頭節(jié)及部分節(jié)片經(jīng)染色制片留存(3條)。

2.2 形態(tài)描述

小型絳蟲(chóng)，蟲(chóng)體全長(zhǎng)為35 mm，蟲(chóng)體最大寬度為0.7 mm。

頭節(jié)呈球形，直徑范圍為0.16～0.42 mm，平均為0.29 mm，具4個(gè)吸盤，吸盤為圓形，頭節(jié)上有一個(gè)短而圓、可伸縮的頂突，頂突上有20～30個(gè)小鉤，呈單環(huán)排列。

頸部較長(zhǎng)而纖細(xì)。鏈體約由160個(gè)節(jié)片組成。所有節(jié)片均寬大于長(zhǎng)并由前向后逐漸增大，

成熟節(jié)片：每個(gè)節(jié)片具有3個(gè)圓球形的睪丸，3個(gè)橫列，1個(gè)靠生殖孔，2個(gè)在對(duì)側(cè)，儲(chǔ)精囊較發(fā)達(dá)。卵巢呈分葉狀，位于節(jié)片中央。卵黃腺橢圓形，在卵巢和后方的腹面。

孕卵節(jié)片：0.15～0.30 mm×0.8～1.0 mm，所有節(jié)片生殖孔都位于蟲(chóng)體同側(cè)。子宮呈袋狀，其中充滿蟲(chóng)卵并占據(jù)整個(gè)節(jié)片。

通過(guò)觀察試驗(yàn)絳蟲(chóng)形態(tài)學(xué)特征；如小型絳蟲(chóng)(35 mm)，頭節(jié)呈球形具有4個(gè)吸盤和1個(gè)短而圓、可自由伸縮的頂突。成節(jié)有3個(gè)圓球形的睪丸，位于節(jié)片的中部，排成一橫列?？梢源_定該絳蟲(chóng)為膜殼屬絳蟲(chóng)。

2.3 分子進(jìn)化分析

Bayesian法構(gòu)建的cox1序列的進(jìn)化樹(shù)結(jié)果見(jiàn)圖1，進(jìn)化樹(shù)由所測(cè)絳蟲(chóng)基因序列(Hymenolepisspp.mallard)與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)上的其他絳蟲(chóng)的cox1序列建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，以Arostrilepishorrida為外群基因，單獨(dú)為一支，在進(jìn)化樹(shù)的上方，其他基因選自膜殼屬，分別為：微小膜殼絳蟲(chóng)(Hymenolepisnana)、縮小膜殼絳蟲(chóng)(Hymenolepisdiminuta)、Hymenolepishibernia絳蟲(chóng)，微小膜殼絳蟲(chóng)單獨(dú)聚在一支，縮小膜殼絳蟲(chóng)聚在一支，Hymenolepishibernia絳蟲(chóng)單獨(dú)聚在一支，由進(jìn)化樹(shù)可見(jiàn)該試驗(yàn)絳蟲(chóng)為膜殼科膜殼屬絳蟲(chóng)。

圖1 綠頭鴨體內(nèi)分離的絳蟲(chóng)與其他膜殼絳蟲(chóng)cox1基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)Fig.1 phylogenetic tree for cox1 gene sequences of Hymenolepis spp.isolates from mallard and other Hymenolepis spp.

3 結(jié)論與討論

通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)方法分析，確定在綠頭鴨小腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)的絳蟲(chóng)為膜殼科膜殼屬的絳蟲(chóng)。

本次所鑒定野生綠頭鴨寄生絳蟲(chóng)均采集自鳥(niǎo)的腸道，與絕大多數(shù)絳蟲(chóng)的寄生部位類似。在雁形目鳥(niǎo)類中，有17個(gè)屬的膜殼科絳蟲(chóng)被發(fā)現(xiàn)[11]。但由于鳥(niǎo)類所處地域不同，環(huán)境多樣化，物種為了適應(yīng)其所處的生存環(huán)境，自身的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生不同的變化以更好地生存。因此，不同的膜殼科絳蟲(chóng)有不同的形態(tài)特征，觀察絳蟲(chóng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)是區(qū)分不同種絳蟲(chóng)最直接的方式。如有無(wú)吻鉤，吸盤是否為鋸齒狀，睪丸的數(shù)量和卵巢的形狀等形態(tài)學(xué)特征是鑒定絳蟲(chóng)的重要特征之一[14]。

在本試驗(yàn)的絳蟲(chóng)中，頭節(jié)具有4個(gè)吸盤和1個(gè)短而圓、可自由伸縮的頂突，頂突上有20～30個(gè)小鉤，排成一圈，根據(jù)這些膜殼屬絳蟲(chóng)的典型特征，基本可以確認(rèn)其的屬階分類。形態(tài)學(xué)的觀察在寄生蟲(chóng)鑒定的方面是一種不可或缺的手段，但是有時(shí)單單依靠形態(tài)學(xué)的觀察鑒定，并不能完全有效地區(qū)分物種[15]，例如，亞洲帶絳蟲(chóng)和牛帶絳蟲(chóng)，其形態(tài)幾乎完全相同，因此長(zhǎng)時(shí)間被認(rèn)為是同一個(gè)物種，直到對(duì)其線粒體基因組測(cè)序后才發(fā)現(xiàn)它們屬于兩個(gè)不同的種。本實(shí)驗(yàn)采用擴(kuò)增該絳蟲(chóng)的cox1基因建樹(shù)補(bǔ)充鑒定該試驗(yàn)絳蟲(chóng)的種類，該絳蟲(chóng)和微小膜殼絳蟲(chóng)、縮小膜殼絳蟲(chóng)和Hymenolepishibernia在進(jìn)化樹(shù)中各成一支，確認(rèn)其為膜殼屬絳蟲(chóng)，同形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相同。

現(xiàn)已有報(bào)道的在綠頭鴨體內(nèi)寄生的絳蟲(chóng)有：片形遂緣絳蟲(chóng)(Fimbriariafasciolaris)、叉棘單睪絳蟲(chóng)(Aploparaksisfurcigera)、纖細(xì)幼鉤絳蟲(chóng)(Sobolevicanthusgracilis)、冠雙盔絳蟲(chóng)(Dicranotaeniacoronula)、Cloacotaeniamegalops絳蟲(chóng)、Diorchisparvogenitalis絳蟲(chóng)、Diorchisstefanskii絳蟲(chóng)、Microsomacanthusparacompressa絳蟲(chóng)、Schistocephaluspungiti絳蟲(chóng)、Aploparaksisfurcigera絳蟲(chóng)、膜殼科絳蟲(chóng)(Hymenolepididaesp.)[16-17]等。本試驗(yàn)在綠頭鴨小腸內(nèi)檢測(cè)到的膜殼絳蟲(chóng)是首次在向海地區(qū)發(fā)現(xiàn)的。

本次所鑒定出的寄生蟲(chóng)為膜殼科膜殼屬絳蟲(chóng)，該絳蟲(chóng)為向海地區(qū)綠頭鴨小腸內(nèi)首次檢測(cè)，填補(bǔ)了我國(guó)向海地區(qū)野生鳥(niǎo)類寄生絳蟲(chóng)種類的空白。