金桂種子休眠類型鑒定及休眠打破方法探討

焦雪輝 ，史喜兵 ，岳長平 ，申瀟瀟 ，周小娟 ，孫毅寧

（1.鄭州市農(nóng)林科學(xué)研究所，河南 鄭州 450005；2.鄢陵縣東華種植農(nóng)民專業(yè)合作社，河南 許昌 461200）

種子休眠的現(xiàn)象普遍存在于高等植物中，林木、果樹、花卉、農(nóng)作物等均存在種子休眠現(xiàn)象。引起休眠的原因包括胚外周組織的機(jī)械、物理或化學(xué)性抑制等外在原因和胚未分化或發(fā)育未成熟、代謝抑制物等內(nèi)在原因[1]。BASKIN等[2]提出了種子休眠分類系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要包括物理休眠、形態(tài)休眠、生理休眠、復(fù)合休眠和形態(tài)生理休眠5個(gè)種類。

桂花種子存在休眠現(xiàn)象，一般在4月下旬至5月上旬成熟，通常需要經(jīng)過6個(gè)月以上的常溫沙藏才會(huì)萌芽。前人對桂花種子休眠進(jìn)行過研究。張義等[3]研究發(fā)現(xiàn)，低溫層積能夠促進(jìn)桂花種子發(fā)芽。赤霉素浸泡與低溫層積相結(jié)合效果更好，以3000 mg/L赤霉素浸泡2 d和2000 mg/L赤霉素浸泡2 d或4 d，層積60 d效果最好，發(fā)芽率可達(dá)62.7%。許岳香[4]研究發(fā)現(xiàn)，胚乳的機(jī)械作用是造成美國桂花（Osmanthus americanus）種子休眠的主要原因。去種殼+赤霉素處理+赤霉素拌沙低溫層積對解除美國桂花種子的休眠最為有效，在處理后45 d能使種子的發(fā)芽率達(dá)到74%。籽銀桂的種皮和胚乳中含有抑制發(fā)芽的物質(zhì)，赤霉素與低溫層積結(jié)合可以解除種子休眠，其中，以1000 mg/L赤霉素浸種，低溫層積105 d的發(fā)芽率最高，達(dá)72.37%[5]。

目前，對桂花種子休眠的研究多集中在休眠打破方法上，其中，休眠打破多以低溫層積和赤霉素浸泡為主，而從形態(tài)結(jié)構(gòu)及內(nèi)源物質(zhì)等方面對休眠特性進(jìn)行鑒定，根據(jù)休眠特性和原因探索打破休眠方法的研究不多。本試驗(yàn)對金桂（Osmanthus fragransvar.thunbergii）種子種殼吸水性及內(nèi)源抑制物進(jìn)行了研究，并通過低溫沙藏、種殼機(jī)械處理、GA3及硝酸鑭浸泡等方法對種子進(jìn)行了休眠打破，旨在揭示金桂種子的休眠類型，總結(jié)休眠打破方法，縮短播種育苗周期，為降低繁育成本提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2020年5月初，于鄭州市農(nóng)林科學(xué)研究所須水試驗(yàn)場采集成熟的金桂果實(shí)，去除果肉，洗凈晾干，從中挑選大小均勻、飽滿、無病蟲害的種子，用3%高錳酸鉀溶液浸泡20 min，蒸餾水沖洗3次，放置于實(shí)驗(yàn)室備用。

試驗(yàn)中GA3購自北京中科起源科技有限公司，硝酸鑭購自阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 休眠類型鑒定試驗(yàn)

1.2.1.1 種殼吸水性試驗(yàn) 分別取去殼種子及劃口種子（從胚一端開始，用解剖刀向下對稱劃開種殼，至種子1/2處，露出胚但不損傷胚）各20粒，以完整種子作為對照。種子稱量初始質(zhì)量（G0），放入錐形瓶中，加入30 mL蒸餾水，置于25 ℃恒溫環(huán)境中，每隔一定時(shí)間取出種子用吸水紙吸干表面水分后稱質(zhì)量（Gi），重復(fù)3次，直至種子質(zhì)量不再增加為止。前8 h，每浸泡2 h取一次稱質(zhì)量，之后每隔12～24 h取一次。以凈吸水量隨時(shí)間的變化來表示種子的吸水率（Vi），并繪制吸水曲線。

1.2.1.2 金桂種子內(nèi)源抑制物對白菜籽發(fā)芽的影響 取新鮮的種子，剝開種子并分離種殼和胚乳，分別稱取1 g，放入預(yù)冷的研缽內(nèi)研碎，加入80%甲醇溶液20 mL，搖晃均勻，放入5 ℃冰箱恒溫浸提24 h，每4 h晃動(dòng)一次，24 h后過濾，連續(xù)浸提3次，將3次濾液合并后倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，減壓蒸干后用蒸餾水沖洗，最后定容到100 mL作為種殼和胚乳浸提液。重復(fù)3次。

挑選飽滿的白菜籽，用0.5%高錳酸鉀溶液消毒，蒸餾水沖洗凈后自然風(fēng)干備用。將培養(yǎng)皿中放入2層濾紙，加入浸提液20 mL，放入白菜籽30粒，培養(yǎng)皿上覆一層保鮮膜，均勻扎孔保證透氣，放入25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，期間保持濾紙濕潤。以蒸餾水培養(yǎng)作為對照。每個(gè)處理重復(fù)3次。48 h后統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中發(fā)芽的白菜籽數(shù)量，以發(fā)芽長度超過種子直徑為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算平均發(fā)芽率；72 h后測量根長，記錄白菜籽生長情況。

1.2.2 休眠打破試驗(yàn)

1.2.2.1 GA3質(zhì)量濃度對金桂種子發(fā)芽的影響 取劃口種子30粒，分別放入質(zhì)量濃度為1000、2000、3000 mg/L的GA3溶液中浸泡48 h，以蒸餾水浸泡作對照。浸泡后用蒸餾水洗凈，放入陶盆中5 ℃低溫沙藏處理60 d后取出種子，用3%高錳酸鉀溶液浸泡20 min，蒸餾水沖洗3次，放入25 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光照16 h、黑暗8 h。每組重復(fù)3次，連續(xù)5 d不再發(fā)芽時(shí)試驗(yàn)結(jié)束，以發(fā)芽長度超過種子直徑為標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

1.2.2.2 硝酸鑭質(zhì)量濃度對金桂種子發(fā)芽的影響取劃口種子30粒，分別放入質(zhì)量濃度為10、20、30 mg/L的硝酸鑭溶液中浸泡48 h，以蒸餾水浸泡作對照。浸泡后用蒸餾水洗凈，放入陶盆中5 ℃低溫沙藏處理60 d后取出種子，用3%高錳酸鉀溶液浸泡20 min，蒸餾水沖洗3次，放入25 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光照16 h、黑暗8 h。每組重復(fù)3次，連續(xù)5 d不再發(fā)芽時(shí)試驗(yàn)結(jié)束，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

1.2.2.3 種殼處理方式對金桂種子發(fā)芽的影響 分別取完整種子、劃口種子、去殼種子各30粒，用1000 mg/L GA3溶液浸泡48 h，蒸餾水沖洗干凈后，放入陶盆中5 ℃沙藏60 d，取出種子，用3%高錳酸鉀溶液浸泡20 min，蒸餾水沖洗3次，放入25 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光照16 h、黑暗8 h。每組重復(fù)3次，連續(xù)5 d不再發(fā)芽時(shí)試驗(yàn)結(jié)束，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

1.2.2.4 低溫沙藏時(shí)間對金桂種子發(fā)芽的影響取劃口種子30粒，用1000 mg/L GA3溶液浸泡48 h，蒸餾水沖洗干凈后，分別放入陶盆中5 ℃沙藏30、60、90 d，以沙藏0 d作對照。種子沙藏后用3%高錳酸鉀溶液浸泡20 min，蒸餾水沖洗3次，放入25 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光照16 h、黑暗8 h。每組重復(fù)3次，連續(xù)5 d不再發(fā)芽時(shí)試驗(yàn)結(jié)束，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

1.2.3 綜合因素對金桂種子發(fā)芽的影響 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選出單因素中對休眠打破效果較好的處理進(jìn)行優(yōu)化，綜合幾個(gè)因素進(jìn)行種子休眠打破試驗(yàn)（表1）。種子在不同溶液中的浸泡時(shí)間均為48 h，消毒、培養(yǎng)、發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)等處理同單因素試驗(yàn)，每處理取30粒種子，重復(fù)3次。

表1 多因素處理方法Tab.1 Multifactor treatment method

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金桂種子休眠類型鑒定

金桂種子吸水曲線如圖1所示。

圖1 金桂種子吸水曲線Fig.1 Water absorption curve of Osmanthus fragrans var. thunbergii seeds

從圖1可以看出，去殼種子和劃口種子的最終吸水率均顯著高于完整種子。完整種子吸水率最終為26.73%，去殼種子的吸水率為37.46%，劃口種子的吸水率為35.33%。劃口種子和去殼種子前6 h為快速吸水期，吸水率迅速上升，8 h后吸水率減緩，3 d后完整種子吸水達(dá)到飽和，6 d后劃口種子吸水達(dá)到飽和。去殼種子在0～12 h，種子迅速吸水，12～48 h種子吸水率上升速度最快，6 d后吸水達(dá)到飽和。由此可以看出，金桂的種殼對種子吸水存在一定的阻礙作用。

由表2可知，培養(yǎng)24 h后，3種培養(yǎng)條件下白菜籽發(fā)芽率差異顯著，蒸餾水培養(yǎng)24 h后白菜籽發(fā)芽率可達(dá)到100%，種殼和胚乳浸提液培養(yǎng)的白菜籽發(fā)芽率均顯著低于對照（P<0.05），且胚乳浸提液培養(yǎng)的白菜籽發(fā)芽率顯著低于種殼浸提液（P<0.05）。48 h后白菜籽發(fā)芽率差異仍然顯著，規(guī)律與24 h時(shí)相同，種殼和胚乳浸提液培養(yǎng)條件下白菜籽發(fā)芽率有所升高，胚乳仍然最低，僅為57.78%。48 h后3種培養(yǎng)條件下根長差異顯著，蒸餾水培養(yǎng)條件下根長最長，達(dá)到23.50 mm，胚乳浸提液培養(yǎng)條件下根長最短，僅為3.47 mm。72 h后 3種培養(yǎng)液對白菜籽根長的影響依然差異顯著。蒸餾水培養(yǎng)的白菜籽根長達(dá)到47.43 mm，比48 h時(shí)增加了23.93 mm；種殼浸提液培養(yǎng)的白菜籽根長也有所增加，胚乳浸提液依然最短，且僅比48 h時(shí)增加了0.06 mm。由此可見，種殼和胚乳浸提液對白菜籽的萌發(fā)及根的生長有明顯的抑制作用，其中，胚乳的抑制作用更明顯，說明種 殼及胚乳中可能含有抑制種子發(fā)芽的物質(zhì)。

表2 白菜籽發(fā)芽情況Tab.2 Germination of Chinese cabbage seeds

2.2 單因素處理對金桂種子休眠打破的影響

在所有處理中，金桂種子在放入培養(yǎng)箱第2天即開始發(fā)芽，培養(yǎng)15 d左右不再有新種子發(fā)芽。所有處理對種子開始發(fā)芽時(shí)間的影響差異不大。

由圖2可知，GA3質(zhì)量濃度為1000、2000 mg/L時(shí)，種子的發(fā)芽率顯著高于GA33000 mg/L，也顯著高于對照（P<0.05），1000、2000 mg/L GA3間發(fā)芽率差異不顯著。其中，GA3質(zhì)量濃度為1000 mg/L時(shí)種子發(fā)芽率最高，可達(dá)51.11%，而GA3質(zhì)量濃度為3000 mg/L時(shí)種子發(fā)芽率僅為15.56%，與對照間差異不顯著。可見，高質(zhì)量濃度的GA3可能對種子發(fā)芽有抑制作用。

圖2 GA3質(zhì)量濃度對休眠打破的影響Fig.2 Effect of GA3 mass concentration on dormancy breaking

硝酸鑭質(zhì)量濃度對金桂種子發(fā)芽率影響差異顯著（P<0.05），3個(gè)質(zhì)量濃度條件下種子發(fā)芽率均顯著高于對照。其中，硝酸鑭30 mg/L時(shí)發(fā)芽率最高，且顯著高于其他2個(gè)質(zhì)量濃度，種子發(fā)芽率可達(dá)44.44%。硝酸鑭質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，種子發(fā)芽率為37.78%，顯著高于質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)的27.78%（圖3）。可見，硝酸鑭對種子發(fā)芽有促進(jìn)作用，高質(zhì)量濃度的硝酸鑭對種子發(fā)芽促進(jìn)作用更明顯。

圖3 硝酸鑭質(zhì)量濃度對休眠打破的影響Fig.3 Effect of lanthanum nitrate mass concentration on dormancy breaking

將金桂種子進(jìn)行去殼和劃口處理后，種子發(fā)芽率顯著提高，其中，劃口種子發(fā)芽率最高，達(dá)到41.11%，與去殼種子發(fā)芽率間差異不顯著。完整種子發(fā)芽率僅為11.11%，顯著低于其他2種處理（圖4）。可見，種殼對種子發(fā)芽存在一定的機(jī)械阻礙。在試驗(yàn)中觀察到，去殼種子盡管完全擺脫了種殼的機(jī)械阻礙，但其發(fā)芽率卻并非是最高的，可能是因?yàn)榉N子完全去殼后，胚乳直接暴露在空氣中，更容易被細(xì)菌污染，從而導(dǎo)致發(fā)芽率降低。

圖4 種子處理方式對休眠打破的影響Fig.4 Effect of seed treatment on dormancy breaking

在不同貯藏時(shí)間對金桂種子發(fā)芽影響試驗(yàn)中，貯藏90 d后種子的發(fā)芽率最高，達(dá)到52.22%，與貯藏60 d間差異不顯著，但二者均顯著高于貯藏30 d和對照的發(fā)芽率（P<0.05）。貯藏30 d后種子發(fā)芽率為16.67%，而對照的種子發(fā)芽率僅為5.56%（圖5）。可見，低溫貯藏時(shí)間對種子發(fā)芽影響顯著，貯藏時(shí)間越長，種子發(fā)芽率越高。

圖5 低溫沙藏時(shí)間對休眠打破的影響Fig.5 Effect of low temperature sand storage time on dormancy breaking

從圖2～5還可以發(fā)現(xiàn)，低溫沙藏時(shí)間對種子休眠打破的影響最顯著，低溫沙藏90 d與未經(jīng)過低溫沙藏的種子萌發(fā)率相差46.66百分點(diǎn)，而種殼處理方式中劃口種子與完整種子萌發(fā)率相差30百分點(diǎn)，可見，生理后熟可能是造成金桂種子休眠的主要原因，而種殼的機(jī)械阻礙可能是造成種子休眠的次要原因。

2.3 多因素處理對金桂種子休眠打破的影響

因單因素處理中金桂種子發(fā)芽率最高也僅能達(dá)到52.22%（圖5），為進(jìn)一步提高種子發(fā)芽率，對單因素試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，綜合幾個(gè)因素對金桂種子休眠打破進(jìn)行試驗(yàn)。從圖6可以看出，所有處理?xiàng)l件下種子發(fā)芽率均顯著高于對照，其中，處理1、4、5、7條件下種子發(fā)芽率均在80%以上。處理5條件下種子萌發(fā)率最高，可達(dá)87.78%，與處理1、4間差異不顯著，說明在其他因素一致的情況下，硝酸鑭質(zhì)量濃度分別為40、50 mg/L時(shí)，與30 mg/L時(shí)對發(fā)芽率影響無顯著差異。在同樣濃度下，同時(shí)使用GA3和硝酸鑭處理的發(fā)芽率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單獨(dú)使用其中一種時(shí)的發(fā)芽率。處理1條件下種子發(fā)芽率顯著高于處理2、3，而處理2、3之間差異不顯著，說明GA3質(zhì)量濃度為1000 mg/L時(shí)休眠打破效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于低質(zhì)量濃度。處理6條件下發(fā)芽率要顯著低于處理1，說明相同條件下劃口種子休眠打破效果要顯著好于去殼種子。處理1條件下種子發(fā)芽率與處理7間差異不顯著，但二者均顯著高于處理8，說明5 ℃沙藏60、50 d對種子發(fā)芽率影響差異不大，但顯著高于40 d時(shí)發(fā)芽率，由此可見，金桂種子在低溫沙藏50 d后可能已經(jīng)解除休眠了。

圖6 多因素處理對種子休眠打破的影響Fig.6 Effect of multifactor treatment on seed dormancy breaking

3 結(jié)論與討論

造成種子休眠的因素很多，主要包括環(huán)境因素，如溫度[6-7]、光照[8]等，以及種子內(nèi)源因素，如種皮結(jié)構(gòu)[9]、內(nèi)源抑制物質(zhì)[10]、種胚發(fā)育不成熟[11]、胚乳的機(jī)械阻隔[12-13]等。打破種子休眠常用的方法有種皮去除、層積處理、外源激素及化學(xué)試劑處理等，其中，外源激素打破種子休眠具有高效、便捷等優(yōu)點(diǎn)[14]。楊秀蓮等[15]對紫梗籽銀桂種子休眠原因進(jìn)行了初步探討，認(rèn)為種皮和種仁中的抑制物質(zhì)可能是引起種子休眠的原因，而堅(jiān)硬的外種皮并不是引起休眠的原因。本研究中對金桂種殼的吸水性和內(nèi)源抑制物進(jìn)行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去掉堅(jiān)硬的種殼或者在種殼上劃口處理，最終的吸水率要高于完整種子，說明金桂種子的種殼對吸水性存在一定的阻礙作用。但金桂種子的種殼比較薄，即使完整種子吸水速率也并非特別低，可以保證種子萌發(fā)對水分的需求，因此，種殼的機(jī)械阻礙并不是造成金桂種子休眠的主要原因。

種子的內(nèi)源抑制物質(zhì)種類具有多樣性，主要包括辛酸、棕櫚酸[16-17]、酚類、脂類、酮類[18]等，這些物質(zhì)對種子萌發(fā)都有抑制作用，但作用方式和機(jī)制各不相同。施婷婷等[19]對紫梗籽銀桂果皮、種實(shí)內(nèi)源抑制物進(jìn)行了提取和鑒定，發(fā)現(xiàn)存在多種抑制物質(zhì)，主要為脂肪酸類物質(zhì)。本研究中利用白菜籽萌發(fā)試驗(yàn)，間接證明了金桂種子中也存在抑制物質(zhì)，主要抑制白菜籽根的發(fā)芽和伸長，且胚乳的抑制作用要比種殼明顯。不過，本研究所得出的抑制作用是針對白菜籽的，且浸提液未進(jìn)行稀釋，濃度較高，金桂種子的內(nèi)源抑制物質(zhì)對其自身種子萌發(fā)是否存在抑制作用，以及抑制物濃度達(dá)到多少才會(huì)對其種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用，還需要進(jìn)一步論證。

種子由抑制物質(zhì)起主要作用轉(zhuǎn)向促進(jìn)物質(zhì)占主導(dǎo)地位，是解除休眠的決定性因素[20]。休眠解除過程受多種激素控制。ABA含量與GA3/ABA值可能是解除休眠的關(guān)鍵因素[21]。種子經(jīng)過層積處理后，可以減少萌發(fā)抑制物，調(diào)控種子內(nèi)部激素水平向利于休眠解除的方向發(fā)展，同時(shí)能夠增加種皮的透性，促進(jìn)種子生理后熟。楊秀蓮等[5]研究認(rèn)為，赤霉素結(jié)合低溫層積可以有效解除桂花種子的休眠。袁王俊等[22]則研究認(rèn)為，使用赤霉素和3個(gè)月層積處理不能促進(jìn)桂花種子萌發(fā)，但層積3個(gè)月后進(jìn)行離體培養(yǎng)，再在培養(yǎng)基中加入NAA和BA可以打破休眠，促進(jìn)桂花種子萌發(fā)。本研究分別對赤霉素和低溫層積時(shí)間進(jìn)行了梯度試驗(yàn)，結(jié)果表明，GA3質(zhì)量濃度為1000、2000 mg/L均可以提高金桂種子發(fā)芽率，且顯著高于對照和GA3質(zhì)量濃度為3000 mg/L時(shí)的種子發(fā)芽率，這與楊秀蓮等[15]研究結(jié)論基本一致。低溫層積60、90 d均可以顯著提高種子發(fā)芽率，且顯著高于對照和低溫層積30 d時(shí)的發(fā)芽率，這與楊秀蓮等[15]研究結(jié)論不一致。一方面可能是試驗(yàn)材料本身的差異，另一方面可能是因?yàn)閷臃e溫度和層積容器的差異，楊秀蓮等[15]試驗(yàn)中所用材料為紫梗籽銀桂，在塑料棚中2～4 ℃低溫層積，而本研究中用的是金桂，在陶盆中5 ℃低溫層積。通過試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，GA3和低溫層積處理對種子發(fā)芽的促進(jìn)作用要顯著強(qiáng)于種殼機(jī)械處理，因此，可以斷定金桂種子應(yīng)該屬于復(fù)合休眠類型，同時(shí)存在生理休眠與物理休眠。生理后熟是導(dǎo)致桂花種子休眠的主要因素，而種殼的機(jī)械阻礙只是次要因素。

許多研究和綜述[23]已經(jīng)指出，稀土元素可促進(jìn)植物生長發(fā)育，提高作物產(chǎn)量，提高作物淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、過氧化物酶、硝酸還原酶和酯酶等活性及土壤酶的活性，促進(jìn)新陳代謝，說明稀土是一種新型的植物生長調(diào)節(jié)劑。鑭是17種稀土元素中最重要和最活潑的元素[24]。本研究利用硝酸鑭對金桂種子進(jìn)行休眠打破試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對金桂種子休眠的打破有促進(jìn)作用，可能是因?yàn)橄⊥猎罔|對種子萌發(fā)的促進(jìn)作用，鑭能夠提高種子或種芽中與生長發(fā)育相關(guān)的酶活性，從而加快大分子物質(zhì)的代謝，提供種子、種芽萌發(fā)所需能量和養(yǎng)分，因此，促進(jìn)了種子、種芽的萌發(fā)。而將硝酸鑭與赤霉素混合，同時(shí)結(jié)合低溫層積和種殼機(jī)械處理，可以進(jìn)一步提早解除休眠，提高種子發(fā)芽率。GA31000 mg/L+硝酸鑭50 mg/L+5 ℃沙藏60 d+種子劃口處理組合對金桂種子休眠打破效果最好。