山西省屠宰生豬肺臟細(xì)菌的分離及耐藥性檢測(cè)

譚仕明，張 甜，石玉節(jié)，王 晨，高 宇，程 宇，王照煌，盧 旺，王 瑩，武星辰，馬海利

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

隨著我國(guó)畜牧經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，生豬養(yǎng)殖模式從傳 統(tǒng)的散養(yǎng)逐步向規(guī)?；?、集約化的工廠式轉(zhuǎn)變。伴隨集約化養(yǎng)殖出現(xiàn)了一系列傳染病，特別是由豬呼吸系統(tǒng)疾病引起的豬群發(fā)病率和死亡率逐年上升，影響了規(guī)?；B(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益[1-2]。引起豬呼吸系統(tǒng)疾病的原因主要有細(xì)菌感染、病毒感染、寄生蟲感染，其中細(xì)菌性病原主要包括放線桿菌、鏈球菌、巴氏桿菌和支原體[3]。殷松[4]從四川部分地區(qū)采集具有典型豬呼吸系統(tǒng)疾病的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)到鏈球菌、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、放線桿菌和李氏桿菌感染。梁娟[5]運(yùn)用建立的豬呼吸系統(tǒng)病原菌五重PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬呼吸系統(tǒng)普遍存在單一或混合病原菌感染。李進(jìn)福[6]從河南省隱性感染的豬病變肺臟分離到大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、葡萄球菌、芽孢桿菌和鏈球菌。張小華等[7]采集鎮(zhèn)江地區(qū)不同養(yǎng)豬場(chǎng)糞便樣品進(jìn)行病原菌鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬群生活的環(huán)境中存在致病性大腸桿菌、巴氏桿菌和葡萄球菌。然而，由于各地區(qū)氣候環(huán)境不同，細(xì)菌感染種類存在差異，同時(shí)，不同地區(qū)抗菌藥物的使用習(xí)慣和劑量不同[8]，也造成細(xì)菌耐藥和多重耐藥的現(xiàn)象頻發(fā)[9-10]，甚至導(dǎo)致超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生[11-12]。

為全面了解山西省生豬肺臟組織中細(xì)菌的分布和耐藥情況，本研究于2019年從山西省11個(gè)地市20個(gè)屠宰場(chǎng)收集521份生豬肺臟樣本，并進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定和藥敏試驗(yàn)，旨在為山西省規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)防控細(xì)菌性呼吸系統(tǒng)疾病、合理用藥和完善豬源細(xì)菌感染及耐藥譜臨床數(shù)據(jù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源

樣品采集點(diǎn)分布如圖1所示。

圖1 山西省樣品采集點(diǎn)Fig.1 Sampling locations in Shanxi province

于2019年6—7月從山西省11個(gè)地市的20個(gè)屠宰場(chǎng)采集521份豬肺臟組織（圖1），其中，北部地區(qū)（包括大同市、朔州市、忻州市）131份，中部地區(qū)（包括陽(yáng)泉市、太原市、呂梁市、晉中市）181份，南部地區(qū)（包括長(zhǎng)治市、臨汾市、晉城市、運(yùn)城市）209份。

1.2 主要試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、MH培養(yǎng)基、紅色熒光核酸染料、50×TAE緩沖液，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；2×Taq PCR MasterMix購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；DL2000 Marker購(gòu)自青島賽奧生物科技有限公司；氨芐西林、慶大霉素、克林霉素、復(fù)方新諾明、紅霉素、青霉素G、頭孢他啶、四環(huán)素、多黏菌素B、環(huán)丙沙星藥敏紙片，均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 用灼燒過的剪刀烙燙肺組織表面并剪開，用無(wú)菌接種環(huán)伸入切口內(nèi)，蘸取組織液（可重復(fù)多次），分別在營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、血液瓊脂培養(yǎng)基上分區(qū)劃線，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后觀察并記錄菌落形態(tài)，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色和純化培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)菌的PCR鑒定 以提取的菌液DNA為模板，選用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物[13]（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引 物 合 成于上海生工生物工程有限公司）進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系（20.0 μL）為：2×TagPCR Master Mix 10.0 μL，菌 液DNA模 板3.0 μL，上 游 引 物1.0 μL，下 游 引 物1.0 μL，無(wú) 菌ddH2O 5.0 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，將目的條帶切膠純化后送上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI進(jìn)行比對(duì)，以確定菌種。

1.3.3 藥敏試驗(yàn) 采用K-B[14]法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。用無(wú)菌棉簽蘸取菌液，接種至MH平板，靜置5 min，將藥敏紙片貼在平板表面，37 ℃倒置培養(yǎng)16～24 h，量取抑菌圈的直徑，并記錄。依據(jù)《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的技術(shù)要求（WS/T 639—2018）》[15]進(jìn)行耐藥（R）、中度敏感（I）、敏感（S）判斷。

1.3.4 氣溫記錄 收集山西省氣象局公布的2019年氣溫?cái)?shù)據(jù)，包括各季節(jié)的日平均氣溫、日最低氣溫和日最高氣溫。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，使用GraphPad Prism 9對(duì)4種主要細(xì)菌的耐藥率和山西不同地區(qū)細(xì)菌耐藥性進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

從521份生豬肺臟樣品中共分離到133株細(xì)菌，其中，革蘭陰性菌（G-）105株，占總數(shù)的78.9%；革蘭陽(yáng)性菌（G+）28株，占總數(shù)的21.1%。經(jīng)16S rRNA基因通用引物擴(kuò)增（圖2）、測(cè)序并上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，進(jìn)一步將133株細(xì)菌鑒定為18個(gè)菌種。將105株革蘭陰性菌（G-）鑒定為12種細(xì)菌，分別為大腸埃希菌（Escherichia coli）34株、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）30株、氣單胞菌（Aeromonas）10株、腸桿菌（Enteric bacilli）9株、從毛單胞菌（Comanonas）9株、巴氏桿菌（Pasteurella）3株、克雷伯氏菌（Klebsiella）3株、變形桿菌（Proteus）2株、希瓦氏菌（Shewanella）2株、莫拉菌（Moraxella）1株、威克斯菌（Weeksella）1株和愛德華菌（Edwardsiella）1株；將28株革蘭陽(yáng)性菌（G+）鑒定為6種細(xì)菌，分別 為 葡 萄 球 菌（Staphylococci）11株、羅 氏 菌（Rosella）7株、鏈球菌（Streptococci）5株、漫游球菌（Roaming cocci）3株、微球菌（Micrococcus）和腸球菌（Enterococcus）各1株。其中，檢出率最高的4種細(xì)菌依次為大腸埃希菌（Escherichia coli）、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）、氣單胞菌（Aeromonas）、葡萄球菌（Staphylococci），檢出率分別為25.6%、22.6%、8.3%、7.5%。

圖2 部分細(xì)菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of PCR amplification products of some bacteria

由表1可知，不同地區(qū)檢出的優(yōu)勢(shì)菌株不同，其中，山西北部地區(qū)131份肺組織中分離出50株細(xì)菌，檢出率為38.2%，主要為大腸埃希菌（Escherichia coli），占該地區(qū)分離細(xì)菌數(shù)的40.0%；山西中部地區(qū)181份肺組織中分離出44株細(xì)菌，檢出率為24.3%，主要為大腸埃希菌（Escherichia coli）和葡萄球菌（Staphylococci），各占該地區(qū)分離細(xì)菌數(shù)的22.7%和20.5%；山西南部地區(qū)209份肺組織中分離出39株細(xì)菌，檢出率為18.7%，主要為不動(dòng)桿菌（Acinetobacter），占該地區(qū)分離細(xì)菌數(shù)的41.0%。

表1 細(xì)菌分離結(jié)果Tab.1 Bacterial isolation results

2.2 耐藥性檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 4種主要細(xì)菌的耐藥性檢測(cè)結(jié)果 4種主要分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖3），34株大腸埃希菌（Escherichia coli）對(duì)復(fù)方新諾明、青霉素G以及四環(huán)素耐藥性強(qiáng)，耐藥率分別為56.0%、53.0%、47.0%，對(duì)頭孢他啶、慶大霉素、多黏菌素B和環(huán)丙沙星較為敏感；30株不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率為50.0%，對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢他啶較為敏感；11株葡萄球菌對(duì)所選的藥物都較敏感；10株氣單胞菌（Aeromonas）對(duì)青霉素G的耐藥率高達(dá)80.0%，對(duì)慶大霉素和環(huán)丙沙星有較高的敏感性。

圖3 4種分離細(xì)菌的耐藥率分析Fig.3 Drug resistance rates analysis of four different bacteria isolated

2.2.2 4種主要細(xì)菌多重耐藥分析 對(duì)分離的4種主要菌株的耐藥性結(jié)果進(jìn)行多重耐藥分析，結(jié)果如表2所示。

表2 4種菌株多重耐藥結(jié)果Tab.2 Results of multiple drug resistances of four bacterial strains

由表2可知，34株大腸埃希菌（Escherichia coli） 中有24株表現(xiàn)為多重耐藥性，其中，2株為6重耐藥、3株為5重耐藥、5株為4重耐藥、7株為3重耐藥、7株為2重耐藥，占比分別為5.88%、8.82%、14.71%、20.59%和20.59%；30株不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）中有12株菌表現(xiàn)為多重耐藥，其中，1株為7重耐藥、2株為5重耐藥、3株為4重耐藥、3株為3重耐藥、3株為2重耐藥，占比分別為3.33%、6.67%、10.00%、10.00%和10.00%；11株葡萄球菌中有4株表現(xiàn)為多重耐藥，5重以上耐藥的有2株；10株氣單胞菌中有8株表現(xiàn)為多重耐藥，其中主要為4重耐藥和2重耐藥，占比分別為30.00%、40.00%。

2.2.3 不同地區(qū)分離菌株的耐藥性分析 對(duì)山西省不同地區(qū)分離細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行分析可知（圖4），不同地區(qū)分離細(xì)菌的耐藥率不同，山西北部地區(qū)分離細(xì)菌的耐藥率普遍高于山西中部和南部地區(qū)。北部地區(qū)分離細(xì)菌對(duì)青霉素G、復(fù)方新諾明和氨芐西林的耐藥率較高，分別為44.0%、42.0%和26.0%，高于該地區(qū)分離的細(xì)菌對(duì)其他藥物的耐藥率；中部地區(qū)分離細(xì)菌對(duì)復(fù)方新諾明、青霉素G、四環(huán)素和多黏菌素B的耐藥率較高，分別為25.0%、15.9%、13.6%和13.6%，高于該地區(qū)分離的細(xì)菌對(duì)其他藥物的耐藥率；南部地區(qū)分離細(xì)菌對(duì)復(fù)方新諾明、青霉素G和環(huán)丙沙星的耐藥率較高，分別為23.1%、12.8%和12.8%，顯著高于該地區(qū)分離的細(xì)菌對(duì)其他藥物的耐藥率（P<0.05）。

圖4 山西省不同地區(qū)細(xì)菌耐藥性分析結(jié)果Fig.4 Analysis results of bacterial drug resistance in dif?ferent areas in Shanxi province

2.3 山西省平均氣溫

根據(jù)山西省氣象局公布的2019年全省各個(gè)地區(qū)的氣溫?cái)?shù)據(jù)，對(duì)各個(gè)季度的平均氣溫進(jìn)行分析可知（表3），山西省北部全年平均氣溫比中部和南部的全年平均氣溫低，由北向南呈上升趨勢(shì)，而北部地區(qū)的細(xì)菌感染率高于中部地區(qū)和南部地區(qū)的細(xì)菌感染率，與各地區(qū)平均氣溫呈負(fù)相關(guān)。

表3 2019年山西省各地區(qū)平均氣溫Tab.3 The average temperature in various areas in Shanxi province in 2019

3 結(jié)論與討論

在養(yǎng)豬業(yè)中，細(xì)菌感染可引起豬呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重影響豬群健康。長(zhǎng)期以來(lái)，為了提高豬群生產(chǎn)性能和出欄率，大量使用抗生素導(dǎo)致了耐藥細(xì)菌、多重耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生，甚至出現(xiàn)超級(jí)細(xì)菌，嚴(yán)重威脅著人類健康。同時(shí)，細(xì)菌耐藥性是不可逆的[16]，耐藥菌的產(chǎn)生嚴(yán)重危害了食品安全[17-18]。在本研究采集的521份豬肺臟組織中，共分離到133株細(xì)菌。其中，從山西北部地區(qū)采集和分離到50株細(xì)菌，檢出率為38.2%；從山西中部地區(qū)采集和分離出44株細(xì)菌，檢出率為24.3%；從山西南部地區(qū)采集和分離出39株細(xì)菌，檢出率為18.7%，表明從山西北部地區(qū)到南部地區(qū)，豬肺臟細(xì)菌感染率逐漸降低，這可能與山西省南北部氣候差異有關(guān)。由2019年山西省氣溫變化可知，全年山西北部地區(qū)的平均氣溫比中部地區(qū)和南部地區(qū)低，而低溫環(huán)境下豬群易造成呼吸道黏膜損傷，引起肺部疾患。雒月云等[19]研究表明，冬季是細(xì)菌氣溶膠暴露風(fēng)險(xiǎn)最高的季節(jié)，低溫環(huán)境有利于延長(zhǎng)細(xì)菌在外界環(huán)境中生存時(shí)限，并形成細(xì)菌氣溶膠，使得細(xì)菌在豬群之間傳播，增加了感染的風(fēng)險(xiǎn)。

不同地區(qū)檢出的優(yōu)勢(shì)菌株不同。其中，山西北部地區(qū)以大腸埃希菌為主，中部地區(qū)以大腸埃希菌和葡萄球菌為主，南部地區(qū)以不動(dòng)桿菌為主。有研究表明，動(dòng)物機(jī)體細(xì)菌感染的種類與環(huán)境中存在的優(yōu)勢(shì)菌群具有一定的相關(guān)性[20]，說(shuō)明山西省不同地區(qū)養(yǎng)豬環(huán)境中存在不同的優(yōu)勢(shì)菌群，當(dāng)豬呼吸道黏膜損傷后，易引起環(huán)境優(yōu)勢(shì)細(xì)菌感染。

對(duì)分離率最高的4種細(xì)菌大腸埃希菌（Escherichia coli）、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）、氣單胞菌（Aeromonas）以及葡萄球菌（Staphylococci））進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并進(jìn)行多重耐藥性分析后發(fā)現(xiàn)，34株大腸埃希菌（Escherichia coli）對(duì)復(fù)方新諾明、青霉素G以及四環(huán)素耐藥性較高，最高可表現(xiàn)為6重耐藥，主要表現(xiàn)為3重耐藥和2重耐藥。沈鵬程等[21]2019年對(duì)江蘇地區(qū)分離的231株牛源大腸埃希菌進(jìn)行耐藥分析，發(fā)現(xiàn)45.0%細(xì)菌對(duì)四環(huán)素耐藥，44.1%的細(xì)菌對(duì)復(fù)方新諾明耐藥，表明從江蘇和山西兩地分離的大腸埃希菌的耐藥性相似。30株豬源不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率為50.0%，對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢他啶較為敏感，最高表現(xiàn)為7重耐藥，其中表現(xiàn)為4重耐藥、3重耐藥和2重耐藥菌株各占10.0%，與奉鑒金等[22]在2018年分離到的牛源不動(dòng)桿菌耐磺胺類藥物結(jié)果一致。本研究分離出的11株葡萄球菌對(duì)所有藥物都有較高的敏感性，與趙靜雯等[23]在2022年分離到的葡萄球菌對(duì)慶大霉素、四環(huán)素等藥物敏感性一致。本研究分離出的10株氣單胞菌對(duì)青霉素G的耐藥率高達(dá)80.0%，對(duì)慶大霉素和環(huán)丙沙星有較高的敏感性，與劉長(zhǎng)宇等[24]在2020年分離到的氣單胞菌對(duì)青霉素同樣有較高的耐藥性結(jié)果相似，推測(cè)不同地區(qū)分離的同種菌株產(chǎn)生的耐藥機(jī)制存在一定的相似性。

山西省不同地區(qū)分離細(xì)菌的耐藥率不同，北部地區(qū)細(xì)菌耐藥率普遍高于中南部地區(qū)。本研究發(fā)現(xiàn)，山西各地區(qū)分離的細(xì)菌對(duì)青霉素G、復(fù)方新諾明都具有較高的耐藥性，這可能與山西省生豬養(yǎng)殖過程的抗生素使用情況有關(guān)。除此之外，北部地區(qū)分離的細(xì)菌對(duì)氨芐西林的耐藥率也較高，中部地區(qū)分離的細(xì)菌對(duì)四環(huán)素和多黏菌素B的耐藥率較高，南部地區(qū)分離的細(xì)菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率較高。王國(guó)艷等[25]于2018年從山西太原地區(qū)分離的驢源性大腸桿菌對(duì)青霉素和多黏菌素B具有較高的耐藥性，與山西中部地區(qū)細(xì)菌耐藥性相似，這可能與不同地區(qū)氣候條件、不同養(yǎng)殖場(chǎng)使用獸藥的偏好不同有關(guān)。

由于細(xì)菌感染肺部會(huì)引起嚴(yán)重的豬呼吸系統(tǒng)疾病，從而影響豬群生產(chǎn)性能，所以，在養(yǎng)豬過程中，應(yīng)該加強(qiáng)飼養(yǎng)管理并提高豬群抗病能力[26-27]，通過飼喂抗生素替代物[28-29]控制細(xì)菌感染。在細(xì)菌性疾病的防治過程中，應(yīng)通過藥敏試驗(yàn)針對(duì)性選擇敏感藥物治療，防止細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。同時(shí)，各地區(qū)應(yīng)該建立抗生素使用記錄系統(tǒng)和抗生素耐藥性檢測(cè)系統(tǒng)[30-31]，以調(diào)整該地區(qū)的抗生素藥物的使用規(guī)范，為該地區(qū)防控豬呼吸系統(tǒng)疾病和合理用藥提供參考依據(jù)，保障養(yǎng)豬業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展以及公共衛(wèi)生安全。