CO2加富條件下胡蘿卜光合通路及差異基因表達分析

宋甜月，劉 偉，宋紅霞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801）

胡蘿卜（Daucus carotaL.）又稱“長壽菜”“土人參”“金筍”，原產(chǎn)于中亞細亞一帶，元末時傳入我國，在全國各地廣泛栽培[1]。胡蘿卜具有很高的營養(yǎng)價值，富含維生素C、類胡蘿卜素和人體必需的酶等，胡蘿卜素能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為維生素A，不僅能保護視力，還能保證人體生長發(fā)育需要，增強免疫力[2-3]。近年來，設(shè)施農(nóng)業(yè)發(fā)展迅速，但是溫室、大棚低溫季節(jié)為保溫其內(nèi)部相對封閉，導(dǎo)致CO2虧缺，影響作物的光合效率[4]。

CO2是植物光合作用的原料[5]，是光合作用能夠進行的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，其濃度變化直接影響光合能力的大小。CO2加富能提高植物光捕獲系統(tǒng)活性，促進光合電子傳遞，提高植物光合速率，增加干物質(zhì)積累，促進植物的生長發(fā)育，提高作物品質(zhì)，因此，設(shè)施內(nèi)增施CO2是促進植物生長發(fā)育和光合作用的重要途徑之一[6-7]。光合作用是生物界極其重要的反應(yīng)，可分為3部分：光能吸收傳遞與轉(zhuǎn)換、電子傳遞和光合磷酸化、碳同化。光系統(tǒng)Ⅱ（Photosystem Ⅱ，PSⅡ）復(fù)合體、光系統(tǒng)Ⅰ（Photosystem Ⅰ，PSⅠ）復(fù)合體、細胞色素b6f（Cytb6f復(fù)合體）和ATP合酶復(fù)合體是主要的光合作用進行的膜蛋白復(fù)合體[8-10]，Cytf是細胞色素b6f復(fù)合體的組分之一，參與真核生物光合電子傳遞過程，連接PSⅡ和PSⅠ的電子流，在光合作用中起重要作用[11]。研究表明，CO2濃度的高低調(diào)控參與光反應(yīng)的基因表達，進而影響植物的生長發(fā)育[12]，增施CO2能顯著促進作物幼苗的生長，提高壯苗指數(shù)，對作物的株高、葉片數(shù)、根冠比、干質(zhì)量、鮮質(zhì)量都有增加的效果[13]。任宏芳等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CO2濃度升高顯著增加谷子的株高、穗長、葉質(zhì)量、莖質(zhì)量、穗質(zhì)量和地上部生物量，且使谷子產(chǎn)量增加28.7%。

目前，關(guān)于CO2加富對植物的影響主要集中在生理特性方面的研究[15-16]，在光合通路及差異基因分析上的相關(guān)研究較少。本試驗以橙色胡蘿卜為材料，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，研究CO2加富對胡蘿卜光合通路及相關(guān)基因的影響，旨在為合理增施CO2促進胡蘿卜生長發(fā)育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試橙色胡蘿卜為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的甜紅1號的母本。其肉質(zhì)根為圓錐形，肉質(zhì)根內(nèi)芯柱比較細嫩，表皮光亮，生育期為110～120 d，適應(yīng)性強。

1.2 試驗方法

試驗于2019年9—12月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站的日光溫室中進行。9月29日進行小高壟播種，壟寬40 cm，壟間距50 cm，小區(qū)面積為5 m2。

1.2.1 試驗設(shè)計 在日光溫室中分別設(shè)置富碳區(qū)（FC，CO2濃度為（800±50）μmol/mol）和對照 區(qū)（CK，自然環(huán)境），其中，富碳區(qū)使用CO2自動釋放系統(tǒng)的裝置，以CO2鋼瓶為氣源。10月31日開始晴天9：00—11：00釋放，雪天和雨天不釋放，其余均為常規(guī)操作。

1.2.2 產(chǎn)量指標測定 收獲期分別統(tǒng)計富碳區(qū)和對照區(qū)的總生物學(xué)產(chǎn)量、地上部鮮質(zhì)量和地下部鮮質(zhì)量，并計算小區(qū)產(chǎn)量，折合公頃產(chǎn)量。

1.2.3 取樣及轉(zhuǎn)錄組測序 富碳處理61 d（12月28日）后，于晴天10：00取樣，分別從自然環(huán)境和富碳環(huán)境選取3株長勢相同、生長健壯的植株，選取第4片功能葉混合取樣，每個樣品約0.1 g，3次生物學(xué)重復(fù)。取樣后用液氮冷凍保存，用于RNA的提取及表達譜的測序。總RNA的提取和測序工作由北京百邁克公司完成。測序步驟、表達量分析、功能注釋、代謝途徑的分析方法同文獻[17]。

1.2.4 KEGG代謝途徑分析 首先，通過測序獲得原始測序數(shù)據(jù)，然后進行數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估，包括GC content和99.9%堿基識別精度等，然后對富碳處理后的差異基因進行KEGG注釋，再進行KEGG代謝途徑分析。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析 采用基因特異性引物進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）。使用Primer 3.0軟件設(shè)計引物序列（表1），對gene33346、gene33340和gene33386等3個光合相關(guān)基因進行實時熒光定量PCR驗證，反應(yīng)體系為（25 μL）：12.5 μL SYBR、2 μL引 物、2 μL cDNA和8.5 μL ddH2O；反應(yīng)程序為：95 ℃ 10 min，94 ℃ 15 s，60 ℃1 min，循環(huán)40次。

表1 光合相關(guān)基因qRT-PCR的引物序列Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR of photosynthesis-related genes

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 20.0進行整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2加富環(huán)境對胡蘿卜產(chǎn)量的影響

從表2可以看出，CO2加富后，其總生物學(xué)產(chǎn)量、地上部質(zhì)量、地下部質(zhì)量均顯著高于對照區(qū)（P<0.05），分別較對照增加了39.02%、80.25%、26.68%。富碳處理和對照處理的胡蘿卜地下部鮮質(zhì)量均大于地上部鮮質(zhì)量；富碳區(qū)的單根質(zhì)量達到了170 g以上，增幅明顯，增施CO2后小區(qū)凈產(chǎn)量有所增加，增產(chǎn)效果明顯，折合公頃產(chǎn)量高達42688.76 kg，較對照區(qū)增產(chǎn)36.56%。

表2 CO2加富對胡蘿卜產(chǎn)量的影響Tab.2 The effect of CO2 enrichment on the yield of carrot

2.2 測序結(jié)果質(zhì)量評估

對6個樣品CK-1、CK-2、CK-3、FC-1、FC-2、FC-3進行轉(zhuǎn)錄組分析，共獲得41.21 Gb高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)。將原始數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果如表3所示，CK-1、CK-2、CK-3、FC-1、FC-2、FC-3這6個基因文庫分別獲得Clean reads數(shù)分別為26650192、26920393、25945139、22204974、24809680、21642183條；Clean bases總堿基分別為7957707794、8037639700、7737059862、6624198608、7401073402、6455939670個；GC Content分別占總堿基數(shù)的45.27%、45.39%、45.31%、45.26%、45.05%、45.42%，說明測序中G和C、A和T含量相當，堿基類型沒有分離現(xiàn)象，測序過程較穩(wěn)定。對照處理的各樣品Q30堿基百分比分別為95.57%、95.70%、95.57%，CO2加富處理的各樣品Q30堿基百分比分別為95.81%、95.24%、95.74%，均大于95.24%，說明測序結(jié)果較為準確，可以用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序分析。

表3 樣品測序數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計Tab.3 Evaluation statistics of sample sequencing data

2.3 KEGG顯著性分析

如表4所示，以P-value≤1.5為標準篩選差異基因KEGG的代謝通路，篩選到6條差異基因顯著富集的代謝通路，分別為光合通路（ko00195）、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（ko04075）、α-亞麻酸新陳代謝（ko00592）、類胡蘿卜素生物合成（ko00906）、亞油酸代謝（ko00591）、氧化磷酸化（ko00190）。其中，光合通路（Photosynthesis）為第1顯著富集通路，其次是植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Plant hormone signal transduction）和α-亞麻酸新陳代謝通路（alpha-Linolenic acid metabolism），KEGG通路分析結(jié)果說明，CO2加富首先對光合、激素、α-亞麻酸和類胡蘿卜素生物合成產(chǎn)生了顯著影響。

表4 差異表達基因KEGG富集結(jié)果Tab.4 KEGG enrichment results of differentially expressed genes

光合作用是將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的過程，分為光能吸收傳遞與轉(zhuǎn)換、電子傳遞和光合磷酸化、碳同化。光合膜上的色素蛋白復(fù)合物按照功能通常分為：光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）、光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）、Cytb6f復(fù)合物及ATP合成酶復(fù)合物，在這4個蛋白復(fù)合體共同參與下，光合作用中的光反應(yīng)完成了電子從H2O到NADP+的傳遞過程，并產(chǎn)生ATP和釋放出O2。以PC值≥2為基因顯著表達，圖1（響應(yīng)CO2加富的植物光合通路（KO00195））中標紅基因表示表達量上調(diào)，富碳條件促進了光合電子傳遞和光合磷酸化過程以及相關(guān)酶和蛋白的合成，從而使得光系統(tǒng)Ⅰ相關(guān)基因（psaA和psaB與色素結(jié)合）、光系統(tǒng)Ⅱ相關(guān)基因（psbD、psbC、psbB、psbH、psbZ控制PSⅡ有關(guān)蛋白合成）、Cytb6f蛋白復(fù)合體（是連接2個光系統(tǒng)的電子傳遞體）相關(guān)基因（petB、petA）、ATP合成酶相關(guān)基因（gene33327）表達量上調(diào)。

圖1 植物光合通路Fig.1 Plant photosynthetic pathway

2.4 光合相關(guān)差異表達基因分析

對比富碳區(qū)和對照區(qū)下的胡蘿卜葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)富碳區(qū)下與光合相關(guān)的差異表達的基因有11個，參與反應(yīng)的酶涉及10種。如表5所示，通過與擬南芥同源基因?qū)Ρ确治?，其中g(shù)ene33346和gene33347的編碼基因分別為psaB和psaA，psaB和psaA是PSⅠ光反應(yīng)中心的基本多肽結(jié)構(gòu)，psaA控制合成的亞基PsaA功能是捕光，psaB控制的亞基PsaB功能是電荷分離、光保護、電荷穩(wěn)定，葉綠素和β-胡蘿卜素都與它們結(jié)合；gene33382、gene33314、gene33340、gene33339、gene33385和gene23768均為PSⅡ核心復(fù)合體的組成蛋白，參與放氧過程，其編碼基因分別為psbB、psbA、psbC、psbD、psbH、psbB，PSⅡ結(jié)合許多色素分子，包含葉綠素、β-胡蘿卜素和葉黃素。psbB、psbC是核心天線，psbA、psbD是反應(yīng)中心蛋白。psbH是細胞色素b559的亞基，其功能未知。gene33366和gene33386均為細胞色素b6f（Cytb6f復(fù)合體），其編碼基因分別為petA、petB。gene33327為ATP合酶跨膜的CF0單位的亞基，負責組織和穩(wěn)定CF0的結(jié)構(gòu)。這11個基因在CO2加富條件下均上調(diào)表達，說明CO2加富可能均促進了胡蘿卜的光合作用。

表5 CO2加富條件下胡蘿卜光合相關(guān)基因分析Tab.5 Analysis of carrot photosynthesis-related genes under CO2 enrichment

gene33346、gene33340和gene33386這3個基因分別代表光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)Ⅱ和細胞色素b6的相關(guān)基因，具有一定的代表性。所以，選取這3個光合相關(guān)基因進行RT-qPCR差異表達性分析，同時與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的FPKM值進行對比，試驗結(jié)果表明（圖2），富碳處理的gene33346、gene33340和gene33386這3個基因的相對表達水平均極顯著高于對照處理（P<0.01），且其相對表達量與相應(yīng)的FPKM值趨勢一致，說明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果是準確的，CO2富集影響基因表達，從而推測這些基因可能參與光合作用。

圖2 RT-qPCR驗證Fig.2 RT-qPCR validation

3 結(jié)論與討論

近年來，大氣CO2濃度逐漸升高，將會對植物生長發(fā)育及生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生影響；而光合作用是植物利用光，以CO2和水為原料，合成碳水化合物的過程[18]。合理增高CO2濃度，可以為光合過程提供充足的原料，增強光合過程中對CO2的固定能力，提高光合色素和葉綠素含量，提高植物的光能利用率，促進光合電子傳遞，從而提高光合作用，最終達到增產(chǎn)的目的。本研究結(jié)果表明，增施CO2后胡蘿卜的總生物學(xué)產(chǎn)量、地上部質(zhì)量、地下部質(zhì)量以及折合公頃產(chǎn)量均高于未施CO2的對照處理，且較對照處理增產(chǎn)36.56%，這與LI等[19]在板藍根的研究（增產(chǎn)36.8%）和劉月炎等[20]在虎耳草的研究（增產(chǎn)23.45%）結(jié)果相似。而關(guān)于該過程的分子響應(yīng)機制如何，ZHANG等[21]揭示了當CO2濃度升高后，在沙棘中GO功能主要富集在光合系統(tǒng)Ⅰ、光合作用和葉綠體類囊體膜中；趙靜[22]通過分析比較自然和富碳條件下草莓葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，推測與光合有關(guān)的差異表達基因共有15個，其中上調(diào)表達基因有10個。本試驗中，富碳條件下，光合通路為第1顯著富集的通路，光合相關(guān)基因表達上調(diào)，這可能是由于富碳條件促進了光合電子的傳遞及相關(guān)酶的合成。

研究表明，銀杏葉光合作用基因ESTs為97條，與光反應(yīng)相關(guān)的基因主要有PSⅡ捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白、PSⅠ捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白、PSⅠ反應(yīng)中心亞單位、鐵硫蛋白、鐵氧蛋白還原酶、ATP合成酶等[23]。psaA或psaB基因的失活都會導(dǎo)致PSⅠ復(fù)合物在類囊體中缺失，表明psaA或psaB不能單獨形成二聚體，而psaA-psaB異二聚體的存在是整個PSⅠ復(fù)合物組裝所必需的[24]。本試驗中，通過與擬南芥同源基因?qū)Ρ确治?，發(fā)現(xiàn)gene33346和gene33347的編碼基因分別為psaB和psaA，其在CO2加富條件下均上調(diào)表達，表明富碳條件下促進了PSⅠ復(fù)合物的合成。核心天線CP47和CP43分別是由葉綠體psbB和psbC基因編碼的47 ku和43 ku蛋白結(jié)合葉綠素a所構(gòu)成的蛋白復(fù)合物[25]。gene33314的編碼基因為psbA，psbA基因編碼光系統(tǒng)Ⅱ的D1蛋白，在光化學(xué)反應(yīng)中心負責電荷分離和電子轉(zhuǎn)移[26]，而這在其中發(fā)揮著重要作用。gene33366和gene33386均為細胞色素b6f（Cytb6f復(fù)合體），是光合電子傳遞鏈中3個重要的膜蛋白復(fù)合體之一，位于光系統(tǒng)Ⅱ和系統(tǒng)Ⅰ之間，介導(dǎo)2個光系統(tǒng)之間的電子傳遞，同時作為質(zhì)子泵跨膜轉(zhuǎn)運質(zhì)子，為ATP合成提供能量[27]。本試驗中，CO2處理的gene33386的表達量顯著高于對照，這可能是因為gene33386促進了2個光系統(tǒng)之間的電子傳遞。以上結(jié)果表明，CO2加富處理可積極調(diào)控這些基因的表達，促進胡蘿卜光合作用。

綜上所述，本研究共獲得41.21 Gb Clean data，各樣品Q30堿基百分比均不小于95.24%。KEGG分析表明，差異表達基因顯著富集的第1條通路為光合通路，通過與擬南芥同源基因?qū)Ρ确治觯l(fā)現(xiàn)富碳條件下11個光合相關(guān)基因表達上調(diào)，這些基因涉及色素合成、電子傳遞、ATP合成、有關(guān)酶的合成等，其中g(shù)ene33346、gene33340和gene33386這3個光合相關(guān)基因的相對表達量與其FPKM值趨勢一致，對進一步研究CO2施肥對胡蘿卜光合作用的分子機制研究具有重要意義。