寧波奉化地區(qū)新生兒耳聾基因擴大篩查結(jié)果及其特點分析

呂立輝 徐亞萍 蔡路航 劉亞 陳瓊瓊

作者單位：310003 杭州，浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（呂立輝現(xiàn)在寧波市奉化區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科工作）

遺傳性耳聾是人類最常見的出生缺陷之一，往往導致終身殘疾。根據(jù)2018 年WHO 數(shù)據(jù)，約4.3 億人患有不同程度的殘疾性聽力損失，其中兒童有3 400 萬人。預計到2050 年，將有近7 億人（每14 人中有1 人）患有中度或中度以上的殘疾性聽力損失，占全球人口的十分之一[1]。聽力損失發(fā)病率隨著年齡增長而增加，在青少年中，這一比例達到3.5/1 000[2-4]。因此，對新生兒進行耳聾基因篩查非常重要，這有助于盡早發(fā)現(xiàn)耳聾，并及時提供適當?shù)母深A。目前絕大多數(shù)耳聾基因篩查僅針對一些常見基因的熱門突變，主要集中在GJB2、GJB3、SLC26A4 和MT-RNR1 這4 個基因及其20 個熱門突變位點。雖然這些基因和位點涵蓋了個體中大部分的致病性耳聾基因和可能致病的突變，但仍有很大比例的遺漏。為盡量減少此類遺漏，本研究對寧波奉化地區(qū)新生兒進行22 個耳聾基因及其159個位點的擴大篩查，分析寧波奉化地區(qū)新生兒遺傳性耳聾基因的突變類型和頻率。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018 年7 月至2019 年9 月寧波奉化地區(qū)出生的新生兒704 名，其中男373 名，女331 名；早產(chǎn)兒22 名，其余均為足月兒，無過期產(chǎn)兒；自然分娩455 名，剖宮產(chǎn)249 名。對新生兒進行病史收集及體格檢查，包括圍生期情況、家族史、藥物接觸史及潛在致聾因素（如聲接觸史、爆震史、外傷史、其他耳病及全身性疾病等）。本研究經(jīng)浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過[2018 科研快審第（949）號]，所有新生兒父母均簽署知情同意書。

1.2 新生兒聽力篩查 新生兒出生48 h 后采用瞬態(tài)聲誘發(fā)耳聲發(fā)射（型號：CAPELLA，丹麥MADSEN 公司）進行聽力初篩，對聽力初篩未通過的新生兒，分別于出生后第42 天、3 月齡、6 月齡時進行聽力復查，包括畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（型號：IL092，英國Otodynamics公司）和聽覺腦干誘發(fā)電位（型號：ICS.CHARTR EP，丹麥MADSEN 公司）。確診時間為出生后第6 個月，隨訪時間24～34 個月。

1.3 新生兒遺傳性耳聾基因篩查方案

1.3.1 血液標本采集 新生兒出生后3 d 內(nèi)采集足跟血，至少采集3 個血斑作為標本進行遺傳性耳聾基因擴大篩查。

1.3.2 遺傳性耳聾基因擴大篩查內(nèi)容 選擇22 個耳聾基因159 個位點方案進行篩查，耳聾基因包括：CDH23、COL11A1、DFNA5、DFNB59、DSPP、GJB2、GJB3、KCNJ10、MT- RNR1、MT- TL1、MT- TS1、MYO15A、MYO7A、OTOF、PCDH15、SLC26A4、SOX10、TCOF1、TMC1、USH1G、WFS1、WHRN。

1.3.3 遺傳性耳聾基因篩查實驗過程 使用核酸純化試劑盒[備案號：鄂漢械備20150086 號，華大生物科技（武漢）有限公司]提取人血液中的基因組DNA；利用多重PCR 技術(shù)擴增富集人基因組DNA 中靶序列；目的片段純化后進行超聲物理打斷，PCR 產(chǎn)物完成文庫制備；進行文庫質(zhì)檢，根據(jù)文庫定量結(jié)果將多個文庫混合為1 個上機文庫；使用測序儀（MGISEQ-2000，注冊證編號：國械注準20183400257）對測序樣本DNA 進行高通量測序，獲取序列堿基信息，從而確定159 位點的檢測結(jié)果（陽性樣本使用質(zhì)譜法或者Sanger 測序法進行二次驗證）。

1.4 資料分析 比較耳聾基因擴大篩查與傳統(tǒng)篩查方法（傳統(tǒng)的遺傳性耳聾基因篩查僅涉及4 個基因20個位點）的陽性檢出率，基因突變陽性檢出率=某種基因突變的檢出人數(shù)/總?cè)藬?shù)，位點突變陽性檢出率=某位點突變檢出人數(shù)/該位點所在基因突變的總?cè)藬?shù)，檢出率增加百分比=（擴大篩查檢出突變基因位點數(shù)目-常規(guī)篩查檢出突變基因位點數(shù)目）/常規(guī)篩查檢出突變基因位點數(shù)目×100%，并比較篩查結(jié)果與現(xiàn)有文獻[5-6]和基因庫數(shù)據(jù)（gnomAD，https://gnomad.broadinstitute.org）等位基因突變陽性檢出率（等位基因突變陽性檢出率=某種突變的等位基因數(shù)/人群總等位基因數(shù)），分析本地區(qū)新生兒耳聾基因突變類型和頻率是否與其他地區(qū)存在差異。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料組間比較χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 聽力篩查結(jié)果 704 名新生兒中，雙側(cè)或單側(cè)未通過聽力初篩61例（8.66%），復篩未通過5例（0.71%），對復篩未通過的5 例新生兒進行隨訪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均具有正常的聽覺語言功能。另有1 例攜帶高風險致病突變的新生兒在密切隨訪中于8 月齡時被確診為雙側(cè)重度聽力障礙，助聽器干預4 個月后無明顯效果，1 周歲時接受雙側(cè)人工耳蝸植入治療。

2.2 耳聾基因篩查結(jié)果 704 名新生兒中，有76 例（10.80%）攜帶至少一種遺傳性耳聾相關(guān)基因突變，GJB2 基因突變陽性檢出率最高，為7.95%（56/704），其次為SLC26A4 基因1.99%（14/704），MT-RNR1 基因0.57%（4/704），GJB3 基因0.43%（3/704）。其中有1 例攜帶GJB2（c.109G＞A）和SLC26A4（c.754T＞C）雙基因復合雜合突變，因此76 例篩查陽性的新生兒共檢測到77 個突變位點。

2.2.1 GJB2基因 GJB2基因突變56例，包括雜合突變55 例和純合突變1 例。其中c.109G＞A 陽性檢出率最高，占GJB2 基因總突變譜的46.43%（26/56），其次分別為c.235delC 37.50%（21/56）和c.299_300delAT 5.36%（3/56）。1 例純合突變的基因類型為c.235delC +c.235delC，為高風險致病性突變，見表1。

表1 GJB2基因突變位點（n=56）

2.2.2 GJB3 基因 GJB3 基因突變3 例，均為雜合突變，包括2 例c.538C＞T 和1 例c.547G＞A。

2.2.3 SLC26A4 基因 SLC26A4 基因突變14 例，均為雜合突變。其中c.919-2A＞G 突變陽性檢出率最高，占SLC26A4 基因總突變譜的64.29%（9/14），見表2。

表2 SLC26A4基因突變位點（n=14）

2.2.4 MT-RNR1 基因 共檢出4 例新生兒攜帶MTRNR1 基因突變，均為m.1555A＞G 同質(zhì)突變。

2.3 耳聾基因擴大篩查陽性檢出率獲益情況 與傳統(tǒng)篩查的20 個位點相比，擴大篩查的159 個位點中檢出突變位點77 個，均位于GJB2、GJB3、SLC26A4 和MT-RNR1 基因，未檢測到其他18 個基因及其位點突變，總陽性檢出率增加75.00%，其中GJB2 增加124.00%，SLC26A4 增加16.67%，見表3。

表3 耳聾基因擴大篩查陽性檢出率獲益情況

2.4 與文獻和基因庫數(shù)據(jù)比較 通過與文獻和gnomAD 基因庫現(xiàn)有數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)：（1）在GJB2 突變位點中，c.109G＞A 的等位基因突變陽性檢出率最高（18.466‰，26/1 408），高于基因庫中歐洲人群和猶太人群，但明顯低于基因庫中東亞人群的83.450‰（1 665/19 952），差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；其次是c.235delC（15.625‰，22/1 408），高于基因庫中歐洲人群、猶太人群和Wang 等[5]的研究數(shù)據(jù)，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。（2）在SLC26A4 突變位點中，c.919-2A＞G 的等位基因突變陽性檢出率最高（6.392‰，9/1 408），高于基因庫中歐洲人群的0.016‰（2/128 880），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。c.2168A＞G 的等位基因陽性檢出率為1.420‰（2/1 408），與Wang 等[5]的研究數(shù)據(jù)和gnomAD 基因庫數(shù)據(jù)對比，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。（3）在GJB3 突變位點中，c.547G＞A 的等位基因突變陽性檢出率高于基因庫中歐洲人群的0.015‰（2/129 134），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。（4）在MT-RNR1 基因突變中，m.1555A＞G 同質(zhì)突變位點人群檢出率為5.682‰（4/704），高于基因庫中歐洲人群及Dai 等[6]的研究數(shù)據(jù)，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表5。

表4 各等位基因突變陽性檢出率與現(xiàn)有文獻及基因庫數(shù)據(jù)比較

表5 MT-RNR1突變位點人群檢出率與現(xiàn)有文獻及基因庫數(shù)據(jù)比較

2.5 聽力和耳聾基因聯(lián)合篩查結(jié)果 2 例新生兒發(fā)現(xiàn)攜帶高風險致病突變，1 例為GJB2（c.235delC）純合突變，1 周歲時接受雙側(cè)人工耳蝸植入治療；另1 例為GJB2（c.109G＞A）/SLC26A4（c.754T＞C）雙基因復合雜合突變，隨訪期限內(nèi)其聽覺語言功能均正常。有4例MT-RNR1 的m.1555A＞G 同質(zhì)突變，新生兒本人及其母系家庭成員具有耳毒性藥物誘導的耳聾風險。

3 討論

本研究704 名新生兒中，有76 例新生兒耳聾基因篩查結(jié)果為陽性，陽性檢出率為10.80%。與傳統(tǒng)篩查相比，擴大篩查檢測到了更多的突變位點，總陽性檢出率增加了75.00%，其中GJB2 和SLC26A4 突變的陽性檢出率分別增加了124.00%和16.67%。根據(jù)2019年在中國進行的一項耳聾基因薈萃分析顯示，4 個基因9 個位點的篩查方式陽性檢出率為4.3%，4 個基因20 個位點的篩查方式陽性檢出率為4.7%[7]。因此，將耳聾基因篩查方式擴大到22 個基因的159 個突變位點可以提高陽性檢出率。

3.1 GJB2 突變和基因型 GJB2 編碼間隙連接蛋白Connexin26（Cx26），其突變是導致遺傳性非綜合征型耳聾（nonsyndromic hearing loss, NSHL）最常見的原因。在中國，NSHL 患者中最常見的GJB2 突變位點是c.235delC（11.90%）、c.299_300delAT（2.22%）、c.176del16（0.65%）和c.35delG（0.27%）[8]。本研究中，c.109G＞A是GJB2 基因中檢出率最高的位點，占46.43%。其是否具有致病性仍存在爭議。大多數(shù)專家認為，c.109G＞A 突變具有致病性[9-11]。Chen 等[12]提出攜帶c.109G＞A 純合突變的患者隨著年齡增長，聽力以平均每年0.40 分貝的速度下降，嚴重程度與年齡密切相關(guān)；男性更容易受到影響，而且聽力下降主要發(fā)生在較高的聲音頻率。2019 年，ClinGen 聽力損失專家小組將c.109G＞A 突變列為致病性突變[13]。Yu 等[14]認為c.235delC 突變是導致重度至極重度（84.93%）和輕度至中度聽力損失（54.05%）的最常見原因，而c.109G＞A 突變是導致輕度至中度聽力損失的另一個常見原因（40.54%）。

3.2 GJB3 突變和基因型 GJB3 位于人類染色體lp33-35 上，編碼由270 個氨基酸組成的Cx31 蛋白[15]。c.538C＞T 和c.547G＞A 位點的突變可導致常染色體顯性遺傳性非綜合征型耳聾，主要表現(xiàn)為高頻聽力損失[15]。然而，GJB3 的致病性僅基于某些病例報道，并無可靠的流行病學發(fā)病率數(shù)據(jù)，其致病性仍存在爭議。根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學會/分子病理學會的指南，c.538C＞T 和c.547G＞A 這兩個GJB3 基因突變被歸類為不確定的臨床意義[16]。

3.3 SLC26A4 突變和基因型 SLC26A4 位于染色體7q22.3 上，編碼一個由780 個氨基酸（86 kDa）組成的蛋白，稱為Pendrin[17]。該基因突變可導致Pendred 綜合征（pendred syndrome，PDS）和非綜合征型耳聾——前庭水管擴大（enlarged vestibular aqueduct，EVA）。

在中國，大約4%～17%的耳聾是由SLC26A4 基因突變引起的，c.919-2A＞G 被證明是SLC26A4 在中國人群中最常見的突變位點[18]。本研究中，c.919-2A＞G突變占SLC26A4 總突變譜的64.29%，高于基因庫數(shù)據(jù)和Wang 等[5]的研究數(shù)據(jù)。SLC26A4 的另一個常見致病突變類型是c.2168A＞G，其等位基因陽性檢出率為1.420‰。

PDS 和EVA 都是常染色體隱性遺傳，通常認為PDS 和EVA 患者將檢測出兩個突變的等位基因（M2）。然而，也有一些EVA 患者只有一個可檢測的突變等位基因（M1），甚至沒有突變等位基因（M0）[19-20]。M1 型和M2 型發(fā)生EVA 的原因尚不明確，有研究表明在大多數(shù)歐洲-高加索人的M1 型EVA 患者中存在1 個位于SLC26A4 上游由12 個突變體組成的單倍型，稱為高加索EVA（CEVA），該單倍型可作為致病性隱性等位基因?qū)е翸1 基因型發(fā)生EVA[21]。攜帶CEVA 單倍型的M1 患者與M2 患者比較，常無甲狀腺異常，且聽力損失較輕[22]。在M0 患者中，攜帶CEVA 的患者與非攜帶者相比，聽力損失更嚴重[22]。

3.4 MT-RNR1 突變和基因型 線粒體基因MTRNR1 的突變可導致氨基糖苷類等耳毒性藥物引起的聽力損失的遺傳易感性。突變模式有同質(zhì)突變和異質(zhì)突變兩種，主要的基因類型包括m.1095T＞C、m.1494C＞T、m.1555A＞G 和m.961T＞C。在中國，m.1555A＞G 突變是造成藥物耳毒性聾的最常見原因。m.1555A＞G 突變患者的表型可以是嚴重的先天性耳聾，或者成年后開始的進行性中度耳聾，甚至完全正常的聽力。推定的核修飾基因TRMU，可能解釋了m.1555A＞G 突變患者以及其他線粒體基因突變所致聽力障礙患者表型的差異性[23]。本研究發(fā)現(xiàn)4 例MT-RNR1（m.1555A＞G）同質(zhì)突變，人群檢出率為5.682‰（4/704），高于Dai 等[6]的研究數(shù)據(jù)以及基因庫中歐洲人群數(shù)據(jù)報道。

綜上所述，寧波奉化地區(qū)主要遺傳性耳聾基因及其位點為GJB2（c.109G＞A）和（c.235delC）、SLC26A4（c.919-2A＞G）和MT-RNR1（m.1555A＞G）。遺傳性耳聾基因擴大篩查的陽性檢出率顯著提高，總陽性檢出率增加75.00%，其中GJB2 增加124.00%，SLC26A4增加16.67%。盡管這項研究涉及22 個耳聾基因及其159 個突變位點的擴大篩查，但不可能涵蓋所有與耳聾有關(guān)的突變或一些新的和罕見的突變位點。而且由于本研究的樣本量不大，今后將擴大篩查人群，尋找更多的區(qū)域性致病和可能致病的耳聾基因突變譜特征。