高溫干旱下縮節(jié)胺通過調(diào)節(jié)碳和氨基酸代謝提高Bt棉殺蟲蛋白含量的生理機(jī)制

邢羽桐，滕永康，吳天凡，劉媛媛，陳源，陳媛，陳德華，張祥

高溫干旱下縮節(jié)胺通過調(diào)節(jié)碳和氨基酸代謝提高棉殺蟲蛋白含量的生理機(jī)制

揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/江蘇省作物遺傳生理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)，江蘇揚(yáng)州 225009

【目的】探討高溫干旱脅迫下縮節(jié)胺（mepiquat chloride，DPC）調(diào)控（）棉殺蟲蛋白含量的生理機(jī)制，為高抗蟲性棉品種選育及高產(chǎn)高效栽培提供理論依據(jù)?！痉椒ā?020—2021年以轉(zhuǎn)抗蟲基因抗蟲棉品種泗抗3號為材料，采用盆栽法，在人工氣候室進(jìn)行高溫干旱脅迫，脅迫開始后立即用20 mg·L-1DPC和清水（對照）噴施。7 d后測定鈴殼殺蟲蛋白含量、α-酮戊二酸含量、丙酮酸含量以及谷氨酸合酶活性、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶活性、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量。并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，利用DESeq進(jìn)行差異基因分析，通過GO富集和KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫注釋參與DPC調(diào)節(jié)殺蟲蛋白含量的差異表達(dá)基因?！窘Y(jié)果】與清水對照相比，DPC可顯著提高高溫干旱條件下棉鈴殼中殺蟲蛋白含量，提高幅度達(dá)4.7%—11.9%。在碳代謝方面，α-酮戊二酸含量、丙酮酸含量提高46%—57%和25%—29%；在氨基酸代謝方面，谷氨酸合酶活性、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶活性、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量分別提高32%—44%、30%—40%、28%和22%—27%。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，DPC處理后上調(diào)基因7 542條，下調(diào)基因10 449條。GO和KEGG結(jié)果顯示，差異基因主要涉及氨基酸代謝、碳代謝等生物過程。其中編碼6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶、丙酮酸脫氫酶、檸檬酸合酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶、谷氨酸合酶、吡咯啉-5-羧酸脫氫酶、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶、N-乙酰谷氨酸合成酶、乙酰鳥氨酸脫乙酰酶基因表達(dá)顯著上調(diào)?！窘Y(jié)論】高溫干旱下，DPC通過調(diào)節(jié)碳、氨基酸代謝增加丙氨酸、α-酮戊二酸含量，提高天冬氨酸、谷氨酸、丙酮酸和精氨酸合成能力，進(jìn)而提高棉殺蟲蛋白含量。

棉；縮節(jié)胺；殺蟲蛋白；氨基酸代謝；碳代謝

0 引言

【研究意義】轉(zhuǎn)（）基因棉花（棉）是一種將蘇云金芽孢桿菌中殺蟲蛋白基因，經(jīng)過改造后轉(zhuǎn)入棉花體內(nèi)，從而使棉株表達(dá)殺蟲蛋白，防治鱗翅目害蟲的一種棉花。并且殺蟲蛋白含量高低決定棉的抗蟲效果。因此，種植棉可減少棉田農(nóng)藥的使用，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究人員發(fā)現(xiàn)在棉生長過程中植株各器官尤其是生殖器官殺蟲蛋白表達(dá)易受外部不良環(huán)境的影響，從而降低了其應(yīng)用效果。在全球棉花主產(chǎn)國，棉花花鈴期常出現(xiàn)極端高溫與土壤干旱現(xiàn)象，造成棉殺蟲蛋白含量下降和抗蟲性顯著下降。如夏蘭芹等[1]發(fā)現(xiàn)高溫可導(dǎo)致棉殺蟲蛋白含量急劇降低。CHEN等[2]和WANG等[3]則進(jìn)一步明確37℃和38℃分別是導(dǎo)致葉片和棉蕾中殺蟲蛋白表達(dá)量顯著下降的臨界溫度。BENEDICT等[4]和SACHS等[5]發(fā)現(xiàn)當(dāng)降水量較少時土壤含水量降低，土壤水分壓力會降低植株中殺蟲蛋白的含量。MARTINS等[6]和ROCHESTER[7]研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫導(dǎo)致棉葉殺蟲蛋白表達(dá)下降，并最終引起棉鈴蟲分布發(fā)生變化。在棉殺蟲蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)方面，近年來有研究表明，噴施生長調(diào)節(jié)劑可提高棉殺蟲蛋白含量。董志強(qiáng)等[8]研究發(fā)現(xiàn)縮節(jié)胺（mepiquat chloride，DPC）能提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，增加植株抗逆性。鄭青松等[9]研究發(fā)現(xiàn)DPC有利于緩解鹽漬對棉苗生長的抑制。董志強(qiáng)等[8]則研究發(fā)現(xiàn)棉花專用生長調(diào)節(jié)劑B1P1S1（油菜素內(nèi)酯、DPC、水楊酸各1份）能提高棉盛蕾期上部葉片、花鈴期下部葉片和果枝葉中殺蟲蛋白含量；ZHANG等[10]進(jìn)一步證實(shí)了單施DPC亦可顯著調(diào)節(jié)殺蟲蛋白含量。但目前，DPC對高溫與干旱互作脅迫下棉殺蟲蛋白含量的影響及相關(guān)生理機(jī)制還未見系統(tǒng)報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文將以高溫干旱逆境下棉植株為材料，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)和相關(guān)生理測定分析，來明晰DPC對逆境下殺蟲蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)效應(yīng)及其機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相關(guān)生理數(shù)據(jù)，分析外源調(diào)節(jié)劑DPC對高溫干旱逆境下棉殺蟲蛋白表達(dá)的影響及其生理機(jī)制，從而獲得提升逆境下棉自身抗蟲性的調(diào)節(jié)技術(shù)，緩解逆境對抗蟲性的負(fù)面影響，進(jìn)而減少棉田農(nóng)藥用量。研究結(jié)果對于基因育種提高棉自身殺蟲蛋白穩(wěn)定性具有重要意義，同時也可為生產(chǎn)上抗蟲棉的安全應(yīng)用提供技術(shù)指導(dǎo)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020—2021年在揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)溫室進(jìn)行。以生產(chǎn)上應(yīng)用較廣的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉常規(guī)品種泗抗3號（以下簡稱為SK-3）為材料。采用盆栽試驗(yàn)，所用盆缽直徑40 cm，盆高50 cm，每盆裝25 kg過篩的砂壤土（取自大田試驗(yàn)田）。采用育苗移栽方式種植，兩年均于4月6日播種，出苗41 d后，選擇長勢一致的壯苗移栽至盆缽中，每盆1株。其他生長管理措施按大田高產(chǎn)栽培要求進(jìn)行。

盛花期（7月20日）控制澆水，并標(biāo)記植株中部果枝內(nèi)圍當(dāng)日花。7月30日，在人工氣候室進(jìn)行高溫干旱脅迫，其中白天（7：00—19：00）溫度設(shè)為38℃，夜間（19：00—7：00）設(shè)為28℃。土壤含水量為最大持水量的50%。于早晨、中午、傍晚使用WET土壤三參數(shù)速測儀監(jiān)測土壤水分，用稱重法控制土壤水分，即當(dāng)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)土壤水分低于設(shè)計(jì)值時，進(jìn)行定量補(bǔ)水，達(dá)到預(yù)期水分指標(biāo)。開始脅迫后立即用 20 mg·L-1DPC和清水（Water）噴施植株。持續(xù)脅迫7 d，脅迫結(jié)束后，取棉株相同部位棉鈴，帶回實(shí)驗(yàn)室立即用無菌刀將棉花分為鈴殼、棉籽、纖維等三部分，分別液氮冷凍后在-80℃條件下保存，待測。

1.2 測定內(nèi)容和方法

1.2.1 殺蟲蛋白含量 應(yīng)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定，試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。測定方法參見文獻(xiàn)[11]。

1.2.2 碳、氨基酸代謝相關(guān)物質(zhì)含量 采用文獻(xiàn)[12]的方法測定谷氨酸合酶活性、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶活性、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量。按照Hodges[13]的方法測定α-酮戊二酸的含量。按照Mustroph等[14]的方法測定丙酮酸含量。

1.2.3 鈴殼轉(zhuǎn)錄組測序

1.2.3.1 cDNA文庫的構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序 處理7 d后取標(biāo)記棉鈴鈴殼用于cDNA文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序。樣品cDNA由上海鹿明生物科技有限公司制備，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。所得原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾得到有效數(shù)據(jù)，利用hisat2[15]比對到棉花基因組得到總映射和唯一映射。

1.2.3.2 差異基因的篩選、功能富集及聚類分析 使用DESeq[16]（2012）R package對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并使用nbinom Test函數(shù)計(jì)算差異比較的值和fold change值，挑選出值小于0.05，差異倍數(shù)大于2的差異基因，并進(jìn)行差異基因的GO基因本體（gene ontology）和KEGG[17]（kyoto encyclopedia of gene and genomes，京都基因與基因組百科全書）富集分析，以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能或者通路。同時對差異基因進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類，利用熱圖的形式展示差異基因在不同樣本間的表達(dá)模式。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。應(yīng)用SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，采用Duncan’s多重比較法檢驗(yàn)處理間的差異顯著性（＜0.05）。試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的均值，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 DPC對高溫干旱脅迫下Bt棉殺蟲蛋白含量影響

圖1表明，與清水（對照）相比，DPC可顯著提高高溫干旱條件下棉鈴殼中殺蟲蛋白含量，兩年提高幅度達(dá)4.7%和11.9%。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（p＜0.05）

2.2 DPC對高溫干旱脅迫下Bt棉碳代謝、氨基酸代謝相關(guān)酶活性和物質(zhì)含量影響

與清水（對照）相比，DPC可提高高溫干旱脅迫下棉鈴殼碳代謝、氨基酸代謝相關(guān)酶活性和物質(zhì)含量（表1）。在碳代謝方面，DPC處理α-酮戊二酸含量、丙酮酸含量分別比清水處理高46%—57%和25%—29%；在氨基酸代謝方面，DPC處理谷氨酸合酶活性、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶活性、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量分別提高32%—44%、30%—40%、28%和22%—27%。

2.3 DPC處理前后的轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量評估

由表2可知，在RNA序列中，過濾后得到的有效數(shù)據(jù)為48 769 270—53 204 746，Q30比例（錯誤率＜0.1%）在94.72%—95.25%，GC比例均大于43%，說明測序結(jié)果質(zhì)量良好。測序結(jié)果與棉花基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對結(jié)果說明，97%以上的測序序列可以映射到基因組，并且唯一映射率達(dá)89%以上。

表1 DPC對高溫干旱脅迫下Bt棉碳、氨基酸代謝和可溶性蛋白含量影響

每列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示同一年份處理間差異顯著（＜0.05）

Different small letters after each column of data meant significant difference at＜0.05 level among treatments

表2 Bt棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

2.4 DPC處理前后的Bt棉差異表達(dá)基因分析

以fold change（FC）≥2且value＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，DPC和清水處理間差異表達(dá)基因數(shù)目達(dá)17 991條（圖2），其中與清水處理（對照）相比，DPC處理后上調(diào)基因7 542條，下調(diào)基因10 449條。說明DPC處理后棉鈴殼中多數(shù)基因表達(dá)受到了抑制。

2.5 DPC處理前后的Bt棉差異基因功能注釋和富集分析

對高溫干旱下DPC處理和清水處理差異基因進(jìn)行基因本體GO功能分析，篩選GO分類的生物過程、細(xì)胞組分和分子功能中各值前10的主要基因功能信息見表3。

與清水對照相比，在生物過程分類下，DPC處理上調(diào)的差異表達(dá)基因主要富集到下列詞條：ATP水解耦合質(zhì)子傳輸、三羧酸循環(huán)、對乙烯的反應(yīng)、乙烯激活信號通路的負(fù)調(diào)控、亮氨酸分解代謝過程、脂肪酸β氧化、線粒體中電子傳遞（細(xì)胞色素c到氧）、鹽脅迫反應(yīng)、糖酵解過程、氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。上述大多詞條與植株碳和氨基酸代謝密切相關(guān)。在細(xì)胞組成分類下，上調(diào)的差異表達(dá)基因主要富集在膜組成部分、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等。在分子功能分類下，質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶活性，旋轉(zhuǎn)機(jī)制、細(xì)胞色素C氧化酶活性、氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、脂肪酰輔酶A結(jié)合、鈷離子結(jié)合、乙酰輔酶A C-?；D(zhuǎn)移酶活性、泛醌細(xì)胞色素C還原酶活性、烯醇輔酶A水合酶活性、蔗糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等9個詞條與碳氮代謝關(guān)系密切。上述結(jié)果表明，DPC主要通過影響棉植株體內(nèi)生物學(xué)過程來調(diào)控殺蟲蛋白表達(dá)，同時也涉及調(diào)控其分子功能來影響殺蟲蛋白含量，因此通過GO功能分類的富集途徑解釋DPC提高棉殺蟲蛋白含量的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有較為積極的意義。

圖2 DPC和清水處理Bt棉鈴殼差異表達(dá)基因的火山圖

表3 高溫干旱下DPC處理 vs 清水處理鈴殼中差異表達(dá)基因的GO富集

2.6 DPC處理前后的Bt棉差異基因的KEGG生物通路分類及富集分析

在生物體內(nèi)，不同的基因產(chǎn)物相互協(xié)調(diào)來行使生物學(xué)功能，對差異表達(dá)基因的通路（pathway）注釋分析有助于了解棉殺蟲蛋白合成所涉及的途徑，從而進(jìn)一步了解DPC提高高溫干旱逆境下棉殺蟲蛋白含量的分子機(jī)理。對差異表達(dá)基因（7 765個）進(jìn)行 KEGG功能注釋分析，發(fā)現(xiàn)它們被富集到194條代謝通路，本文挑選值較小的前20 條 pathway 條目在圖中進(jìn)行展示（圖 3），分別屬于代謝（19條）和環(huán)境信息處理（1條）KEGG分支。而在代謝分支中，5條屬于氨基酸代謝，7條屬于碳代謝，3條屬于全局和總覽圖，2條脂質(zhì)代謝，萜類和聚酮的代謝、能量代謝各1條?？梢奃PC主要是通過調(diào)節(jié)代謝分支，尤其是碳代謝和氨基酸代謝來調(diào)節(jié)殺蟲蛋白表達(dá)。

糖酵解是將葡萄糖降解為丙酮酸并伴隨著ATP生成的一系列反應(yīng)，是生物體內(nèi)普遍存在的葡萄糖降解的途徑。糖酵解的關(guān)鍵酶有3個，即己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，它們催化的反應(yīng)基本上都是不可逆的[18]。圖4表明，DPC處理對棉植株糖酵解途徑有明顯的影響。編碼6-磷酸果糖激酶（6-phosphofructokinase）10個基因（GH_A02G1558、GH_A05G1771、GH_A06G0746、GH_A07G0253、GH_A07G0497、GH_D03G0426、GH_D05G0280、GH_D05G1804、GH_D06G0723、GH_D07G0262）表達(dá)全部顯著上調(diào)，其中GH_A07G0253、GH_D07G0262 log2FC 分別達(dá)62.94和29.83；編碼丙酮酸激酶（pyruvate kinase）10個基因，其中6個（GH_A03G0315、GH_A08G0889、GH_A09G1595、GH_A10G2189、GH_D03G1659、GH_D09G1539）基因表達(dá)顯著上調(diào)，4個基因表達(dá)顯著下調(diào)，但上調(diào)基因數(shù)量和上調(diào)幅度均大于下調(diào)基因。綜上，DPC處理后可加速糖酵解途徑的運(yùn)行速率，利于丙酮酸的形成，并且主要是通過上調(diào)6-磷酸果糖激酶表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

氣泡顏色代表p值大小，p值越小代表富集結(jié)果越顯著。氣泡大小代表差異表達(dá)基因的數(shù)目，氣泡大代表差異基因數(shù)目多，氣泡小代表差異基因數(shù)目少

方格中紅色代表差異上調(diào)基因；深綠色代表差異下調(diào)基因；黃色代表同一個基因不同轉(zhuǎn)錄本，既有差異上調(diào)也有差異下調(diào)基因；淺綠色或紫色代表物種特有基因，非差異顯著性基因；白色代表該物種沒有的基因或未檢測到的基因。下同

檸檬酸循環(huán)（三羧酸循環(huán)）是需氧生物體內(nèi)普遍存在的代謝途徑，不但為機(jī)體提供能量，同時檸檬酸循環(huán)是三大營養(yǎng)物質(zhì)的共同氧化途徑：乙酰CoA，不但是糖氧化分解的產(chǎn)物，也是脂肪酸和氨基酸代謝的產(chǎn)物。此外，檸檬酸循環(huán)是三大物質(zhì)代謝聯(lián)系的樞紐：糖有氧氧化過程中產(chǎn)生的α-酮戊二酸、丙酮酸和草酰乙酸等與氨結(jié)合可轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的氨基酸；這些氨基酸脫去氨基又可轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的酮酸而進(jìn)入糖的有氧氧化途徑。同時脂類物質(zhì)分解代謝產(chǎn)生的甘油、脂肪酸代謝產(chǎn)生的乙酰CoA也可進(jìn)入糖的有氧氧化途徑進(jìn)行代謝。

糖酵解的產(chǎn)物丙酮酸，在有氧條件下進(jìn)入線粒體，開始檸檬酸循環(huán)，形成水和二氧化碳并釋放能量。檸檬酸共有10步反應(yīng)，其中檸檬酸合酶（citrate synthase）是檸檬酸循環(huán)的限速酶。異檸檬酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶系是另外兩種關(guān)鍵酶。DPC總體上提高了所有步驟的反應(yīng)速率（圖5）。其中編碼丙酮酸脫氫酶E1α亞單位（pyruvate dehydrogenase E1 component alpha subunit）共7個基因，其中6個表達(dá)上調(diào)，編碼丙酮酸脫氫酶E1β亞單位（pyruvate dehydrogenase E1 component beta subunit）共5個基因，其中4個表達(dá)上調(diào)；編碼丙酮酸脫氫酶E2共4個基因，表達(dá)全部上調(diào)。說明DPC可以加快催化丙酮酸向乙酰輔酶A轉(zhuǎn)變，增加了進(jìn)入檸檬酸循環(huán)的底物乙酰輔酶A的可獲得性。

編碼檸檬酸合酶（GH_A05G1609、GH_A11G0627、GH_D05G1636、GH_D11G0654）的基因顯著上調(diào)表達(dá)；編碼異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase）4個基因中3個顯著上調(diào)表達(dá)；編碼α-酮戊二酸脫氫酶（2-oxoglutarate dehydrogenase）（GH_A05G3704）基因顯著上調(diào)表達(dá)。綜上，DPC提高了高溫干旱逆境下棉檸檬酸循環(huán)反應(yīng)速率。

圖5 高溫干旱下DPC處理對鈴殼中檸檬酸（三羧酸）循環(huán)通路（ko00020）的影響

檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物丙酮酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸也是合成氨基酸的原料。而谷氨酸在氮素合成代謝中起關(guān)鍵作用，同時也是其他氨基酸的氨基主要供體。谷氨酸合酶（glutamate synthase）可催化谷氨酰胺和α-酮戊二酸形成谷氨酸（Glu）。圖6可見，編碼谷氨酸合酶基因2個（GH_A12G2700、GH_D12G2727）顯著上調(diào)，1個（GH_D08G1115）下調(diào)；編碼谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）基因6個顯著下調(diào)2個顯著上調(diào)，但下調(diào)幅度顯著高于上調(diào)幅度。說明DPC處理促進(jìn)谷氨酸的形成，并抑制其向谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化。此外，高等植物體內(nèi)脯氨酸首先可以被脯氨酸脫氫酶（PDH）氧化成吡咯啉-5-羧酸（P5C），后者在吡咯啉-5-羧酸脫氫酶的作用下也可生成谷氨酸。而本文中編碼吡咯啉-5-羧酸脫氫酶（GH_A03G0786、GH_D03G1048）基因顯著上調(diào)。綜上，DPC處理有利于谷氨酸的積累。

圖6 高溫干旱下DPC處理對鈴殼中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路（ko00250）的影響

谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）在植物體內(nèi)催化草酰乙酸合成天冬氨酸，且催化天冬氨酸與α-酮戊二酸間的氨基轉(zhuǎn)換反應(yīng)，與蛋白質(zhì)及氨基酸含量有關(guān)[19-20]。編碼谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶11個基因，其中9個（GH_A09G0041、GH_A10G1610、GH_D09G0044、GH_D10G1279、GH_D05G0584、GH_A06G0690、GH_A07G0277、GH_D06G0665、GH_D07G0289）基因顯著上調(diào)，如GH_A10G1610、GH_D10G1279 log2FC 分別達(dá)38.44和18.74，僅有2個（GH_A07G276、GH_D07G0288）基因顯著下調(diào)，上調(diào)基因無論是數(shù)量還是上調(diào)幅度均明顯高于下調(diào)基因。可見DPC處理可加快草酰乙酸向天冬氨酸的轉(zhuǎn)變，促進(jìn)天冬氨酸合成。

由圖6可知，編碼谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）（GH_A10G0511、GH_D05G1444、GH_D10G0537）基因顯著上調(diào)表達(dá)，加快了丙酮酸向丙氨酸的轉(zhuǎn)化，這利于丙氨酸的積累。

在植物細(xì)胞核內(nèi)，精氨酸的生物合成起始于L-谷氨酸乙酰化作用并涉及連續(xù)的8個酶的催化過程，其中第一個酶乙酰谷氨酸合成酶是精氨酸反饋抑制的靶點(diǎn)[21-22]。圖7表明，DPC上調(diào)了編碼N-乙酰谷氨酸合成酶（amino acid N-acetyltransferase，argAB）（GH_A10G0898、GH_D11G2171）基因表達(dá)量，其中GH_D11G2171 log2FC達(dá)21.30。此外，編碼乙酰鳥氨酸脫乙酰酶（acetylornithine deacetylase，argE）（GH_A03G0060、GH_D03G1904）基因也顯著上調(diào)，這利于鳥氨酸的形成從而也進(jìn)一步為精氨酸合成提供前體?？梢奃PC可促進(jìn)了精氨酸的合成。

圖7 高溫干旱下DPC處理對鈴殼中精氨酶合成通路（ko00220）的影響

3 討論

3.1 DPC可提高高溫干旱脅迫下Bt棉殺蟲蛋白含量

前人研究表明，高溫干旱可顯著抑制棉殺蟲蛋白合成，導(dǎo)致其含量下降。而縮節(jié)胺可調(diào)節(jié)作物碳、氮代謝，且能提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，增加植株抗逆性[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，在晝夜38℃/28℃、土壤含水量為最大持水量的50%脅迫條件下，噴施20 mg·L-1DPC可顯著提高棉鈴殼中殺蟲蛋白含量，這與前人研究結(jié)果基本一致[8,10]。此外，結(jié)合筆者前期研究結(jié)果[24]，本文發(fā)現(xiàn)高溫干旱逆境下DPC處理后棉鈴殼中殺蟲蛋白含量絕對值與正常溫度和土壤水分條件下的含量基本相似，說明施用外源調(diào)節(jié)劑可以降低甚至抵消本文逆境環(huán)境條件對棉抗蟲性的負(fù)面影響。因此，在大田生產(chǎn)中，若遇高溫干旱天氣可采用噴施DPC的方法提高棉自身抗蟲性，從而減少農(nóng)藥使用，提高棉花生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。

3.2 高溫干旱脅迫下Bt棉響應(yīng)DPC處理的轉(zhuǎn)錄組水平差異

植物根系吸收硝態(tài)氮（NO3-），通過硝酸還原酶和亞硝酸還原酶將NO3-還原成NH3，再經(jīng)谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶同化為谷氨酸，后者與來自碳代謝中間物的各種碳骨架（α-酮戊二酸、草酰乙酸）之間轉(zhuǎn)氨形成各種氨基酸。而蛋白質(zhì)生物合成即把mRNA分子中堿基排列順序轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)或多肽鏈中的氨基酸排列順序的過程[25-26]。本文認(rèn)為基因作為一種外源基因，其翻譯表達(dá)的殺蟲蛋白合成也應(yīng)依托棉花自身原有的代謝體系，可能并不涉及特有的酶。

本文采用RNA-seq技術(shù)對DPC處理后的棉基因表達(dá)譜進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因（7 765個）被富集到194 條代謝通路，其中值較小的前20 條 pathway 條目（圖3）主要屬于代謝KEGG分支（19條）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在上述代謝分支中，5條屬于氨基酸代謝，7條屬于碳代謝，3條屬于全局和總覽圖，2條脂質(zhì)代謝，萜類和聚酮的代謝、能量代謝各1條。因此，本文認(rèn)為DPC主要是通過調(diào)節(jié)代謝分支，尤其是碳代謝和氨基酸代謝來調(diào)節(jié)殺蟲蛋白表達(dá)。這也驗(yàn)證了前人關(guān)于棉碳氮代謝能力與殺蟲蛋白含量密切相關(guān)的結(jié)論[27]。這可能是由于外源基因的高效表達(dá)，必然影響宿主的生長和代謝，合理地調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系，是提高外源基因表達(dá)水平不可缺少的一個環(huán)節(jié)。本文中高溫干旱脅迫使得棉細(xì)胞代謝損傷，必然影響外源基因的表達(dá)，而DPC可以合理地調(diào)節(jié)棉細(xì)胞的代謝負(fù)荷，從而利于外源基因高效表達(dá)。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在糖酵解途徑中，DPC處理中6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶基因表達(dá)顯著上調(diào)，加速了糖酵解途徑的運(yùn)行速率，利于丙酮酸的形成（圖4）。隨后谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶基因也顯著上調(diào)表達(dá)（圖6），這加快了丙酮酸向丙氨酸的轉(zhuǎn)化，最終利于丙氨酸的積累。

此外，糖酵解的產(chǎn)物丙酮酸，在有氧條件下可進(jìn)入線粒體，經(jīng)丙酮酸脫氫酶作用轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴］o酶A從而進(jìn)入檸檬酸循環(huán)（圖5）。其中檸檬酸合酶（citrate synthase）是檸檬酸循環(huán)的限速酶，異檸檬酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶系是另外2種關(guān)鍵酶。DPC處理下編碼丙酮酸脫氫酶基因總體表達(dá)上調(diào)，催化丙酮酸向乙酰輔酶A轉(zhuǎn)變加快，進(jìn)入檸檬酸循環(huán)的底物乙酰輔酶A的可獲得性增加。同時編碼檸檬酸合酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶基因顯著上調(diào)表達(dá)。綜上，DPC提高了高溫干旱逆境下棉檸檬酸循環(huán)反應(yīng)速率，利于α-酮戊二酸（表1）、草酰乙酸的積累，這為后期天冬氨酸和谷氨酸合成提供了充足的底物。

谷氨酸合酶是催化谷氨酰胺的酰胺上氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸的酮基上，生成谷氨酸的氧化還原酶，而谷氨酰胺合成酶主要是催化依賴ATP的谷氨酰胺合成。本研究發(fā)現(xiàn)編碼谷氨酸合酶基因（GH_A12G2700、GH_D12G2727）和吡咯啉-5-羧酸脫氫酶（GH_A03G0786、GH_D03G1048）基因總體上也顯著上調(diào)，這與谷氨酸合酶活性顯著提高（表1）結(jié)果相一致，但編碼谷氨酰胺合成酶基因顯著下調(diào)。說明DPC處理不僅促進(jìn)高溫干旱逆境下棉鈴殼中谷氨酸的形成，同時抑制其向谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化，兩者共同促進(jìn)了谷氨酸的積累。這與前人發(fā)現(xiàn)的谷氨酸合酶對殺蟲蛋白合成起主要作用結(jié)果相一致[28]。

谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）是植物體內(nèi)氮代謝合成的關(guān)鍵酶。DPC總體上促進(jìn)GOT基因顯著上調(diào)（圖6），其中GH_A10G1610、GH_D10G1279 log2FC 分別達(dá)38.44和18.74，其活性顯著提高（表1）。說明DPC處理加快草酰乙酸向天冬氨酸的轉(zhuǎn)變，促進(jìn)天冬氨酸合成。在精氨酸合成過程中，本研究發(fā)現(xiàn)DPC上調(diào)了精氨酸的生物合成過程中關(guān)鍵酶N-乙酰谷氨酸合成酶（argAB）基因表達(dá)量，其中GH_D11G2171 log2FC達(dá)21.30，以及編碼乙酰鳥氨酸脫乙酰酶（argE）基因表達(dá)量，這均利于精氨酸的合成。

綜上所述，DPC處理后顯著提高高溫干旱脅迫下棉碳代謝能力，這不僅為后期氨基酸的生物合成提供碳骨架，也為殺蟲蛋白的合成提供了充足的能量。同時，DPC利于丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸等的合成，這為后期殺蟲蛋白的合成提供充足底物。結(jié)合游離氨基酸含量增加結(jié)果（表1），本研究認(rèn)為DPC處理總體而言提升了棉植物氨基酸合成能力。氨基酸是合成蛋白質(zhì)的基本單位，其含量的多少和組分的比例影響蛋白質(zhì)的合成效率[29]。殺蟲蛋白由18種共1 176個氨基酸及酰胺組成，其中天冬氨酸占氨基酸總數(shù)量比例最大（13.31%），其次為谷氨酸（11.98%）、精氨酸（7.65%）、亮氨酸（7.49%）、纈氨酸（7.32%）[30]。在本文DPC處理下，天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸表達(dá)量與殺蟲蛋白含量變化一致，但亮氨酸、纈氨酸卻與之相反。這可能是由于殺蟲蛋白合成需要較多的天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸，它們比例的增加更加促進(jìn)殺蟲蛋白的合成，這也解釋了前人噴施外源氨基酸可提高棉殺蟲蛋白含量的結(jié)果[31-32]。因此，生產(chǎn)中棉農(nóng)可以通過采取噴施外源生長調(diào)節(jié)劑等措施，調(diào)節(jié)棉碳氮代謝強(qiáng)度來提高殺蟲蛋白含量。

4 結(jié)論

噴施20 mg·L-1DPC可顯著提高高溫干旱脅迫下棉鈴殼中殺蟲蛋白含量。其主要是通過提高糖酵解途徑、檸檬酸循環(huán)的運(yùn)行速率，增加丙酮酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸等含量。同時顯著上調(diào)編碼谷氨酸合酶基因、吡咯啉-5-羧酸脫氫酶基因，下調(diào)編碼谷氨酰胺合成酶基因以及上調(diào)谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶、N-乙酰谷氨酸合成酶等編碼基因，從而利于谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸積累。最終通過改變棉鈴殼中的氨基酸含量和比例來調(diào)節(jié)殺蟲蛋白合成。

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Mepiquat Chloride Increases theProtein Content Through Regulating Carbon and Amino Acid Metabolism ofCotton Under High Temperature and Drought Stress

Agricultural college, Yangzhou University/Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province, Yangzhou 225009, Jiangsu

【Objective】The effects of mepiquat chloride (DPC) on the insecticidal protein contents in() cotton shell under high temperature and drought stress were investigated to provide a theoretical reference for thecotton breeding as well as high-yield and high-efficiency cotton cultivation.【Method】The study was undertaken on thecotton cultivar Sikang 3 during the 2020 and 2021 growing seasons at the Yangzhou University Farm, Yangzhou, China. The potted cotton plants were exposed to high temperature and drought stress, and 20 mg·L-1DPC and water (CK) were sprayed to cotton plants. Seven days after treatment, the insecticidal protein content, α-ketoglutarate content, pyruvic acid content, glutamate synthase activity, glutamic oxaloacetic transaminase activity, soluble protein content, free amino acid content in boll shell were analyzed, and the transcriptome sequencing was performed. DESeq was used for differential gene analysis. The GO and KEGG pathway databases were used to analyze the differentially expressed genes involved in regulating the insecticidal protein content through DPC.【Result】Compared with the water treatment (CK), the insecticidal protein contents under DPC treatment increased by 4.7%-11.9%. In terms of carbon metabolism, the contents of α-ketoglutarate and pyruvic acid were increased by 46%-57% and 25%-29%, respectively. In terms of amino acid metabolism, the activities of glutamate synthase and glutamic oxaloacetic transaminase, and the contents of soluble protein and free amino acid were increased by 32%-44%, 30%-40%, and 28%, 22%-27%, respectively. The transcriptome analysis revealed that there were 7 542 upregulation genes and 10 449 downregulation genes for DPC vs water. The GO and KEGG analysis showed that the differentially expressed genes were mainly involved in biological process such as amino acid metabolism and carbon metabolism. The genes coding 6-phosphofructokinase, pyruvate kinase, glutamic pyruvate transaminase, pyruvate dehydrogenase,citrate synthase, isocitrate dehydrogenase, 2-oxoglutarate dehydrogenase,glutamate synthase, 1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase, glutamic oxaloacetic transaminase, amino-acid N-acetyltransferase, and acetylornithine deacetylase were all significantly up-regulated.【Conclusion】 Under the stress of high temperature and drought, the DPC treatment increased the contents of α-ketoglutarate and pyruvic acid, and improved the synthesis ability of aspartic acid, glutamic acid, pyruvate and arginine, then enhanced the insecticidal protein contents in boll shell by regulating the carbon and amino acid metabolism.

cotton; mepiquat chloride; insecticidal protein; amino acid metabolism; carbon metabolism

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.004

2022-08-08；

2022-12-05

國家自然科學(xué)基金（31901462）、江蘇省高等學(xué)校自然科學(xué)基金（22KJA210005）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20191439）、江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程、江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程（PPZY2015A060）

邢羽桐，E-mail：xingyt0601_yzu@163.com。通信作者張祥，E-mail：zhangxiang@yzu.edu.cn。通信作者陳德華，E-mail：cdh@yzu.edu.cn

（責(zé)任編輯 楊鑫浩，岳梅）