鼠傷寒沙門氏菌熒光定位報告菌株的構建及其在豬肺泡巨噬細胞的示蹤應用

肖 紅,何 珍,田 棋,黃鑫淼,廖衛(wèi)東,黃廷華,姚 敏

(長江大學 動物科學學院,湖北 荊州 434020)

隨著沙門氏菌病的頻發(fā)以及給世界養(yǎng)殖業(yè)和公眾健康帶來的損失與危害,對沙門氏菌感染的研究成為社會關注的焦點之一。沙門氏菌通過三型分泌系統(tǒng)(T3SS-2)將蛋白轉運到宿主細胞的胞質中,與宿主免疫系統(tǒng)互作,調節(jié)其在宿主細胞內的存活和復制[1]。有效地跟蹤沙門氏菌在胞內的存活、增殖及與宿主細胞的互作是探索沙門氏菌致病機制的重要方面。

一些報告已使用化學熒光染料標記細菌開展病原菌與宿主細胞的互作及機制研究[2-4]。由于化學物質的非特異性,標記化合物可能從細菌泄漏到細胞,產生非細菌的熒光標記,干擾研究者對細菌在細胞內的行為觀察。其次,并非所有細菌都以相同的效率染色,并且細菌生物膜對熒光染料的滲透性差異妨礙了研究者對細菌活力的判斷[5]。因此,化學熒光染料標記細菌對于跟蹤活宿主細胞內細菌病原體的價值有限。增強型綠色熒光蛋白 (Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)是一種發(fā)光的水母蛋白,具有體積小、穩(wěn)定性強、探測時不需要外源底物等優(yōu)點。 它廣泛應用于生物學研究,包括細胞分化、基因追蹤和體內蛋白質定位和操作的研究[6-7]。 GFP能在多種原核生物中表達而發(fā)光,包括大腸桿菌、乳酸乳球菌和戈登鏈球菌[8-10]。EGFP的表達不會改變細菌與宿主細胞的相互作用,并且可以在活的哺乳動物細胞中觀察到表達EGFP的細菌[11]。

本研究通過電轉法將帶有沙門氏菌毒力基因PagC的啟動子序列(PpagC)和增強型熒光蛋白基因(EGFP)的質粒轉入Sal-14028中,獲得能產生熒光信號的Sal-pPpagC-EGFP菌株。比較研究了熒光菌株與野生菌株在生化特征和生長特征等方面的差異。此外,本研究通過細胞侵染試驗初步探討了Sal-pPpagC-EGFP在豬肺泡巨噬細胞中的定位示蹤作用,以期為沙門氏菌感染細胞的分子機制研究提供有效的生物材料。

1 材料和方法

1.1 菌株、質粒、細胞株和小鼠

鼠傷寒沙門氏菌14028標準株及其感受態(tài)細胞、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞均由長江大學動物科學學院實驗室保存。pET28a-EGFP質粒、pMD18-T載體購自TaKaRa公司。豬肺泡巨噬細胞3D4/21由本實驗室保存。BALB/c小鼠購自華中農業(yè)大學實驗動物中心,體質量18～25 g。

1.2 試驗試劑

T4DNA連接酶、限制性內切酶、卡那霉素(Kanamycin,Km)購自TaKaRa公司;蛋白胨和酵母粉購自Oxoid公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液購自Solarbio公司;兔單克隆抗體LAMP1、山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488購自Abcam公司;細菌質粒DNA小提試劑盒購自Omega公司。常規(guī)生化試劑均為國產分析純。

1.3 引物設計

利用GenBank 中鼠傷寒沙門氏菌 ATCC14028 標準株PagC基因的啟動子序列(PpagC)為模板進行設計:引物1(PpagC-F 5′-CGTGCGCAGTTAACCACTCTTAATAATAATG-3′)和引物2(PpagC-R 5′-GCTCTAGATACTACTTATTATTTACGGTGT-3′),由上海生工科技有限公司合成。

1.4 重組質粒的構建

以鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028為模板,擴增PpagC片段。將PpagC片段克隆到pMD18-T載體,并轉化大腸桿菌,使用Omega試劑盒提取質粒,XbaⅠ、FspⅠ限制性內切酶切下PpagC、EGFP片段后相連接,獲得重組質粒并命名為pPpagC-EGFP。重組質粒轉化大腸桿菌后使用Omega試劑盒提取質粒并進行PCR和酶切鑒定,陽性菌株進行測序。測序引物為5′-GCTGCCCATGGTATATCTCCT-3′。

1.5 熒光菌株的構建及鑒定

重組質粒pPpagC-EGFP在2.0 kV電壓下電擊4 ms,使其轉化進入鼠傷寒沙門氏菌感受態(tài)細胞。挑選轉化子進行測序驗證,測序引物同上。陽性菌株標記為Sal-pPpagC-EGFP,并使用熒光顯微鏡觀察。另設空白質粒電轉入鼠傷寒沙門氏菌作為對照。

1.6 重組熒光沙門氏菌Sal-pPpagC-EGFP的生物學性狀

1.6.1 Sal-pPpagC-EGFP的穩(wěn)定性檢測 挑取Sal-pPpagC-EGFP單克隆分別劃線于LB固體培養(yǎng)基(含有30 μg/mL Km)和LB固體培養(yǎng)基中,置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),每12 h移植1次,連續(xù)20次,分別于第3,6,9,12,15,18,20次,挑取單克隆制作涂片于熒光顯微鏡下觀察EGFP熒光信號。

1.6.2 Sal-pPpagC-EGFP的生長曲線測定 按照 1%的比例將Sal-pPpagC-EGFP和Sal-14028新鮮培養(yǎng)物分別接入含有 30 μg/mL Km的LB 液體培養(yǎng)基和無Km的LB 液體培養(yǎng)基中。置 37 ℃、180 r/min 恒溫搖床振蕩培養(yǎng),每隔 1 h 取樣,采用酶標儀讀取OD600值,試驗重復 3 次,并繪制生長曲線。

1.6.3 Sal-pPpagC-EGFP的半數(shù)致死量(LD50)測定 將熒光株Sal-pPpagC-EGFP和野生株Sal-14028培養(yǎng)至對數(shù)生長期,收集菌體,滅菌PBS洗滌3次,以滅菌PBS重懸菌液,分光光度計測定菌液濃度。130只8周齡BALB/c雌性小鼠,隨機分為3組,第1組為Sal-pPpagC-EGFP攻毒組,分別以108,107,106,105,104cfu/mL的劑量腹腔注射BALB/c小鼠,每個劑量重復12只。第2組為Sal-14028攻毒組,分別以108,107,106,105,104cfu/mL的劑量進行腹腔注射BALB/c小鼠,每個劑量重復12只。第3組為生理鹽水對照組,10只小鼠給予腹腔注射同體積生理鹽水。連續(xù)觀察21 d,記錄BALB/c小鼠的死亡情況,使用改良寇氏法計算Sal-pPpagC-EGFP和Sal-14028的LD50。

1.7 熒光菌株Sal-pPpagC-EGFP在豬肺泡巨噬細胞3D4/21中的示蹤初探

1.7.1 細胞和菌株培養(yǎng) 豬肺泡巨噬細胞3D4/21在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)于DMEM+10% FBS中。按照106/孔密度將細胞接種于12孔板中,Sal-pPpagC-EGFP和Sal-14028培養(yǎng)至對數(shù)生長期,用滅菌PBS洗滌并調整濃度,以MOI=10的感染指數(shù)侵染細胞,細菌與細胞孵育30 min后加入含50 μg/mL終濃度多粘菌素的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7.2 免疫熒光試驗 將感染3,6 h的3D4/21細胞用PBS洗滌3次后,以4%多聚甲醛固定10 min,0.1% TritonX-100透化10 min。細胞再次經PBS洗滌后,用5% BSA封閉60 min。將細胞與稀釋好的LAMP1一抗(1∶200)室溫反應2 h,再與山羊抗兔二抗(1∶400)37 ℃孵育45 min,然后用PBS緩沖液洗滌,DAPI染色3 min后洗滌3次,最后滴加抗熒光猝滅劑封片,進行顯微鏡分析。野生株Sal-14028感染細胞作為對照。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的構建及鑒定

2.1.1PpagC片段的擴增 為使質粒pET28a-EGFP在沙門氏菌中穩(wěn)定表達和復制,本研究計劃將沙門氏菌PagC基因的啟動子序列(PpagC)克隆并替換pET28a-EGFP中的T7啟動子,并將PpagC、EGFP片段連接到pET28a-EGFP質粒的XbaⅠ、FspⅠ位點(圖1),以期重組菌株具備穩(wěn)定發(fā)光的特征。試驗中以鼠傷寒沙門氏菌14028菌液為模板,分別用上下游引物PpagC(F1)、PpagC(R2)擴增,結果擴增出716 bp片段(圖2-A),片段長度與預期相符。

圖1 pPpagC-EGFP質粒結構圖譜Fig.1 Structural mapping of pPpagC-EGFP plasmid

2.1.2 重組質粒酶切鑒定 用限制性內切酶XbaⅠ、FspⅠ雙酶切重組質粒PMD18-PpagC和pET28a-EGFP,得到約716 bp的PpagC片段和4 184 bp的pET28a-EGFP片段(圖2-B),連接后得到重組質粒pPpagC-EGFP再次雙酶切獲得約716 bp的PpagC片段和4 184 bp的pET28a-EGFP片段(圖2-C)。

A.PCR擴增PpagC片段:M.DNA Marker DL2000;B.pMD18T-PpagC、pET28a-EGFP雙酶切電泳圖,瓊脂糖凝膠濃度為1.5%:1.pET28a-EGFP,2.pMD18T-PpagC,M.DNA Marker DL2000;C.重組質粒pPpagC-EGFP雙酶切(FspⅠ和Xba Ⅰ)電泳圖,瓊脂糖凝膠濃度為1.5%:1.原質粒,2—3.酶切質粒,M.DNA Marker DL2000。A.PCR amplification of PpagC promoter fragment:M.DNA Marker DL2000;B.pMD18T-PpagC,pET28a-EGFP double digestion 1.5% agarose gel electrophoresis map:1.pET28a-EGFP,2.pMD18T-PpagC,M.DNA Marker DL2000;C.1.5% agarose gel electrophoresis plot of recombinant plasmid pPpagC-EGFP double digested(Fsp Ⅰ and Xba Ⅰ)product:1.The original plasmid,2—3.The digested plasmid,M.DNA Marker DL2000.圖2 PpagC片段PCR擴增和pMD18T-PpagC、pPpagC-EGFP的酶切鑒定Fig.2 PCR Amplification of PpagC fragment and validation of pMD18T-PpagC and pPpagC-EGFP by enzymatic cleavage

2.2 鼠傷寒沙門氏菌Sal-pPpagC-EGFP菌株的測序鑒定及熒光檢測

2.2.1 Sal-pPpagC-EGFP菌株的測序鑒定 陽性菌株菌液委托上海生工科技公司測序,結果表明,重組質粒pPpagC-EGFP成功轉入鼠傷寒沙門氏菌14028。部分測序峰圖見圖3。

2.2.2 Sal-pPpagC-EGFP菌株的熒光鑒定 挑取電轉后的鼠傷寒沙門氏菌和空白對照單克隆制備菌液涂片,在熒光顯微鏡下觀察,可見強烈的綠色熒光(圖4-A),右圖為空白對照,在激發(fā)光下無可見熒光(圖4-B)。說明增強型綠色熒光蛋白基因(EGFP)已成功轉入鼠傷寒沙門氏菌14028,陽性轉化子命名為Sal-pPpagC-EGFP。

測序引物為5′-GCTGCCCATGGTATATCTCCT-3′。The sequencing primer is 5′-GCTGCCCATGGTATATCTCCT-3′.圖3 pPpagC-EGFP質粒測序峰圖(第一部分)Fig.3 pPpagC-EGFP plasmid sequencing peak map(part 1)

A.Sal-pPpagC-EGFP鼠傷寒沙門氏菌在熒光顯微鏡下的圖片(激發(fā)488 nm/發(fā)射507 nm、100×);B.空白對照在熒光顯微鏡下的圖片(激發(fā)488 nm/發(fā)射507 nm、100×)。A.Picture of Sal-pPpagC-EGFP Salmonella typhimurium under fluorescence microscope(excitation 488 nm/emission 507 nm,100×);B.Blank control under fluorescence microscope(excitation 488 nm/emission 507 nm,100×).圖4 標記EGFP的沙門氏菌的熒光圖Fig.4 Fluorescence map of salmonella labeled with EGFP

2.3 Sal-pPpagC-EGFP的生物學特性

2.3.1EGFP表達的穩(wěn)定性檢測 連續(xù)20次轉接劃線后檢測Sal-pPpagC-EGFP的熒光信號,結果表明,在不同的時間點,不論含抗生素或不含抗生素培養(yǎng)基上的單克隆都保持強烈的熒光,且菌落數(shù)量無較大差異,說明pPpagC-EGFP在Sal-14028中穩(wěn)定表達EGFP,且不受抗性選擇的影響。

2.3.2 熒光菌株的生長曲線 在相同培養(yǎng)條件下,熒光菌株與野生菌株生長曲線的變化趨勢基本相同,都在2 h后進入指數(shù)期,約10 h后進入穩(wěn)定期(圖5)。結果表明,pPpagC-EGFP質粒、卡那霉素的存在及EGFP的表達對宿主菌的生長沒有明顯影響。

圖5 Sal-14028和Sal-pPpagC-EGFP的生長曲線比較Fig.5 Comparison of the growth curves of Sal-14028 and Sal-pPpagC-EGFP

2.3.3 半數(shù)致死量(LD50)測定 使用改良寇氏法計算出Sal-pPpagC-EGFP的LD50為1.20×106cfu/mL,Sal-14028的LD50為1.45×106cfu/mL,兩者毒力無顯著差異(P>0.05)(表1),結果表明,EGFP基因的插入對熒光株的毒力無明顯影響。

表1 8周齡小鼠腹腔注射Sal-14028、Sal-pPpagC-EGFP菌株后LD50的測定Tab.1 Determination of LD50 after intraperitoneal injection of Sal-14028 and Sal-pPpagC-EGFP strains in 8-week-old mice

2.4 豬肺泡巨噬細胞3D4/21中吞噬溶酶體與熒光沙門氏菌的共定位

沙門氏菌在488 nm波長的激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光信號,Alexa Fluor 488標記的溶酶體蛋白LAMP1在495 nm波長的激發(fā)光下發(fā)出紅色熒光信號(圖6)。結果表明,沙門氏菌侵襲進入了3D4/21細胞,溶酶體廣泛表達在細胞質中,且與包含沙門氏菌的吞噬體發(fā)生共定位,吞噬體中沙門氏菌的EGFP熒光信號未受免疫熒光相關試劑、吞噬體膜和細胞膜的影響。

圖6 熒光沙門氏菌在3D4/21中與吞噬溶酶體共定位情況(100×)Fig.6 Co-localization of Salmonella fluorescens with phagocytic lysosomes in 3D4/21(100×)

3 結論與討論

鼠傷寒沙門氏菌是一種高致病力、兼性胞內感染的革蘭氏陰性細菌,是重要的人畜共患病原體之一,可導致人類和動物腸胃炎、豬敗血癥和死亡等。然而鼠傷寒沙門氏菌在宿主體內散播的分子機制尚待進一步確定。目前對鼠傷寒沙門氏菌的研究主要集中在對其致病因子表達調控網(wǎng)絡,毒力因子特異抗體的制備,新型藥物靶點的尋找等[12-13],沙門氏菌在宿主細胞內的示蹤及其在感染細胞內的行為狀態(tài)是開展上述研究的重要基礎。本研究通過基因重組構建了EGFP標記的熒光菌株Sal-pPpagC-EGFP,并評估了EGFP和Km基因的引入對鼠傷寒沙門氏菌 14028生物學特性和毒力的影響。另外,驗證了Sal-pPpagC-EGFP在豬肺泡巨噬細胞中的定位示蹤作用。本研究結果表明,Sal-pPpagC-EGFP是研究鼠傷寒沙門氏菌致病機制的潛在工具。

一些GFP質粒已成功用于標記某些沙門氏菌,但均存在缺點和限制。目前,熒光沙門氏菌菌株多基于pUCP18、pKK223系列質粒構建,如ATCC公司的Salmonella14028GFP菌株采用的是pUCP18MCSgfpmut3質粒轉化沙門氏菌所得,其熒光信號較強,但該菌株所含熒光質粒的結構尚未見報道,且國內難以獲得。pPpagCGFP_OVA和pPtacCGFP_OVA 質粒是應用較為成功的沙門氏菌熒光質粒,但主要針對SL1344缺陷型沙門氏菌菌株設計[14]。此外,研究報道pACYC和pSIF等載體中四環(huán)素抗性基因可影響吞噬入胞內的沙門氏菌的存活和生長[15]。以上質粒的優(yōu)缺點為進一步優(yōu)化構建熒光沙門氏菌提供了基礎數(shù)據(jù),也是本研究以PagC基因的啟動子序列(PpagC)和pET28a-EGFP質粒為基礎,并引入卡那霉素抗性基因,作為研究切入點的重要原因。

熒光質粒在沙門氏菌胞內的穩(wěn)定性與質粒攜帶的EGFP基因和Km抗性基因對細菌生長、毒力、胞內存活等生物學特性的影響是以PpagC和pET28a-EGFP質粒為基礎的熒光沙門氏菌能否成功應用的關鍵。大腸桿菌與沙門氏菌由一個祖先分化而來[16],此外,在大腸桿菌基因島OI-122中同樣存在毒力基因PagC,并與沙門氏菌毒力基因PagC具有顯著同源性[17-18]。因此,本研究基于大腸桿菌來源的PET28a-EGFP構建的pPpagC-EGFP質粒能夠在沙門氏菌中穩(wěn)定傳代。GFP的最大優(yōu)點是不損害標記對象,在細菌致病性研究中具有潛在用途。Valdivia 等[19]構建了GFP表達載體并在腸道病原體和鼠傷寒沙門氏菌中進行測試,結果表明,GFP表達不會對細菌存活產生不利影響,也不會損害細菌進入哺乳動物細胞或在巨噬細胞內存活的能力。本研究成功利用EGFP標記了鼠傷寒沙門氏菌 14028,并對其生長特性和毒力進行檢測,結果表明熒光株與野生株的生長曲線和毒力無顯著差異,與文獻報道結果一致。有研究報道,濃度為15～150 μg/mL的氨基糖苷類(卡那霉素)抗生素不會降低胞內沙門氏菌存活和增殖的能力[20]。本研究證明了pPpagC-EGFP衍生的卡那霉素抗性基因不會影響沙門氏菌在胞內存活與增殖的能力。試驗中,熒光顯微鏡觀察菌株Sal-pPpagC-EGFP在吞噬溶酶體中的定位情況,發(fā)現(xiàn)其侵染3D4/21細胞3 h后定位于溶酶體,并于6 h后增殖。說明一定時間范圍內,隨著感染時間增長,胞內沙門氏菌數(shù)量增多。本研究進一步揭示了,Km抗性基因標記的以PpagC和pET28a-EGFP質粒為基礎的Sal-pPpagC-EGFP可作為研究沙門氏菌致病機制的潛在工具。

本研究成功構建啟動子序列為14028標準沙門氏菌源性的pPpagC-EGFP質粒,電轉后獲得熒光菌株Sal-pPpagC-EGFP。通過細菌侵染試驗,初步了解其在豬肺泡巨噬細胞內與吞噬溶酶體的共定位情況及存活穩(wěn)定性。為進一步闡明沙門氏菌致病機制奠定基礎,提供了實時觀測胞內細菌行為狀態(tài)的有效生物材料。