調(diào)控高粱分蘗高度的基因及表達分析

王 瑞,程慶軍,王繪艷,巨 嵐,平俊愛,張福耀

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 高粱研究所,高粱遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新山西省重點實驗室,山西 晉中 030600)

高粱(Sorghumbicolor)是全球第五大類糧食作物,是世界上數(shù)億人口的主食[1-2],其作為C4谷物和飼草作物,可用于糧食、飼料、糖和生物能源生產(chǎn)[3]。高粱抗旱且耐鹽堿和瘠薄土壤,被視為干旱和鹽堿土壤農(nóng)業(yè)區(qū)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一種重要作物[4-6]。高粱也是我國的重要旱糧作物之一,目前全國種植面積約80萬hm2,主要分布在東北、華北、西南等區(qū)域。

株高是非常重要的農(nóng)藝性狀之一,在很大程度上影響植株的總生物量和產(chǎn)量。有關(guān)高粱株高的研究早在20世紀(jì)50年代就已開始,Quinby等[7]研究認為,高粱株高由Dw1、Dw2、Dw3和Dw4等4個株高的基因控制。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,調(diào)控高粱株高基因的研究逐步深入,Lin等[8]利用高粱和擬高粱(S.bicolor×S.propinquum)構(gòu)建的F2群體為研究對象,在1,3,6,7,9號染色體上鑒定出6個與株高相關(guān)的QTL;Pereira等[9]用CK60×PI229828的F2群體在高粱的6,7,9,10號染色體上分別檢測到4個與株高變異相關(guān)的QTL;其他研究者也先后在高粱上找到了多個控制高粱株高的QTL[10-17]。Dw3是高粱中第一個被克隆的株高基因[18],它編碼一個調(diào)節(jié)高粱莖稈中生長素極性運輸?shù)腁BCB1類型的生長素輸出載體蛋白且同源于玉米(Zeamays)的Br2基因[19-20]。之后,Lin等[8]、Pereira等[9]和Brown等[21]把Dwl基因定位于9號染色體上。在此基礎(chǔ)上,Hilley等[22]和Yamaguchi等[23]2016年克隆了該基因Sobic.009G229800,它編碼一個高度保守蛋白,該蛋白參與細胞增殖調(diào)節(jié)。2017年,Hilley等[24]利用圖位克隆的方法成功分離到Dw2基因(Sobic.006G067700),該基因同源于擬南芥(Arabidopsisthaliana)AGC蛋白酶家族中的KIPK且編碼蛋白激酶。

分蘗性是高粱的重要農(nóng)藝性狀之一,分蘗力強的高粱品種在補償缺苗斷壟造成的基本苗不足和增加產(chǎn)量上有明顯的優(yōu)勢。然而,大多數(shù)高粱品種分蘗株高高于主莖,造成品種整齊度差,尤其是給機械化收獲帶來重大影響。研究表明[25],分蘗高度的基因調(diào)控與Dw1、Dw2、Dw3和Dw4等4個株高基因不同,前期用分蘗與主莖株高一致的高粱品系K35-Y5與分蘗明顯高于主莖的高粱恢復(fù)系1383雜交,F1自交獲得F2分離群體,采用BSA和SLAF技術(shù)將高粱分蘗與主莖株高一致基因定位到Chr.9上,在關(guān)聯(lián)區(qū)域發(fā)現(xiàn)4個非同義突變的SNP,對應(yīng)到Sobic.009G197901.1、Sobic.009G213300.1和Sobic.009G221200.1等3個基因上。

為了進一步解析相關(guān)基因在調(diào)控分蘗高度中發(fā)揮的作用,本研究選取分蘗與主莖株高一致和不一致的極端材料組成自然群體作為研究對象,對4個SNP位點進行驗證,然后運用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技術(shù)對相關(guān)基因組織特異性的表達進行分析,以期確定高粱分蘗株高基因的調(diào)控模式,為適宜機械化生產(chǎn)高粱品種選育提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗設(shè)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高粱研究所榆次試驗基地。該地位于北緯37°5′,東經(jīng)112°5′,海拔780 m,年平均氣溫9.8 ℃,年降雨量418～483 mm,年日照時數(shù)2 662 h。2021年高粱生長季即4—9月平均氣溫分別為11.9(4月),18.4(5月),22.8(6月),24.3(7月),22.7(8月),18.7 ℃(9月),與常年氣溫相近。田間順序排列2行區(qū)種植,行長5 m,行距45 cm,留苗密度9.0萬株/hm2,生育期間管理同大田。開花后調(diào)查分蘗與主莖株高的一致性:分蘗株高與主莖株高同等或株高差≤5 cm,記為株高一致;分蘗株高與主莖株高差> 5 cm記為不一致[26]。

1.2 試驗材料

調(diào)控高粱分蘗高度基因研究選用32份高粱主要親本系為試驗材料,其中15份為分蘗與主莖同等高度,株高整齊一致;17份為分蘗高于主莖,株高不一致(表1)。

表1 試驗材料及分蘗性狀表型Tab.1 Germplasm tested and the tillering phenotypes

基因表達分析研究選用分蘗與主莖同等高度,株高整齊一致的品種K35-Y5與分蘗明顯高于主莖的品種1383這2個品種為試驗材料。

1.3 試驗方法

1.3.1 調(diào)控分蘗高度基因研究 DNA提取。采用CTAB法提取32份高粱基因組DNA,提取的DNA使用超微量核酸蛋白測定儀(scandrop100)測定其純度及濃度。

目標(biāo)片段PCR擴增、測序和序列比對。將32份高粱材料分別用4個SNP引物進行PCR擴增(表2),反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離,將單一擴增產(chǎn)物送北京擎科生物科技公司測序,利用DNAMAN v7.0軟件進行序列比對分析。

表2 引物序列和信息Tab.2 Sequence and information of the primers

1.3.2 基因表達分析 RNA提取。利用TRIzol法分別提取K35-Y5和1383不同時期的葉、根和莖中總RNA,提取的總RNA使用超微量核酸蛋白測定儀(scandrop100)測定其純度及濃度。

反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別以K35-Y5和1383在枝梗分化期、主莖孕穗期、分蘗孕穗期、主莖開花期、分蘗開花期的主莖和分蘗的葉、根和莖共50份組織的總RNA為模板,使用Aidlab公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit)進行反轉(zhuǎn)錄,500 ng總RNA建立20 μL體系,程序設(shè)置為42 ℃ 40 min,65 ℃ 10 min,反應(yīng)后得到cDNA樣品,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實時熒光定量 PCR。選擇高粱Actin基因作為內(nèi)參基因,以高粱總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板進行RT-qPCR擴增。其中,所用內(nèi)參及目的基因引物序列如表3所示。PCR反應(yīng)體系為:cDNA 1 μL,2× SYBR? Green Supermix(1×)5 μL,上、下游引物(200 nmol/L)各0.5 μL,ddH2O 3.0 μL。PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性10 s,退火30 s(表3),39個循環(huán)。

表3 引物信息Tab.3 Information of the primers

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個cDNA樣品重復(fù)3次試驗,實時熒光定量擴增所得Ct值,以Actin為內(nèi)參,利用2-ΔΔCt計算各個樣品的基因相對表達量[26-27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因測序比對與功能分析

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高粱研究所分子育種研究室前期用分蘗與主莖株高一致的高粱品系K35-Y5與分蘗明顯高于主莖的高粱恢復(fù)系1383雜交獲得F2分離群體,選擇高粱基因組Sorbi1.25作為參考基因組(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-25/fasta/sorghum_bicolor/),采用BSA和SLAF技術(shù)將高粱分蘗與主莖株高一致的基因定位到Chr9上,在關(guān)聯(lián)區(qū)域發(fā)現(xiàn)4個非同義突變的SNP。本研究選擇已經(jīng)測序完成的高粱基因組v3.1.1作為參考基因組(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!bulk?org=Org_Sbicolor),對原數(shù)據(jù)進行對比分析,結(jié)果顯示,包含原4個SNP突變位點,分別對應(yīng)到基因組v3.1.1的位置(表4)。

表4 SNP標(biāo)記信息Tab.4 Information of SNP

將32份高粱材料分別用4個SNP引物進行驗證,利用DNAMAN 7.0序列分析軟件將測序結(jié)果進行序列比對分析發(fā)現(xiàn),引物SNP1、SNP2、SNP4測序結(jié)果未能對應(yīng)參試品種表型,只有引物SNP3的測序結(jié)果與表型對應(yīng),株高整齊一致的品種No.1～14和K35-Y5在第55 892 216 bp處均為T,分蘗高于主莖的品種No.15～30和1383在第55 892 216 bp處為G,SNP3測序結(jié)果與田間表型完全一致(圖1),證明SNP3為調(diào)控高粱分蘗高度位點,其位點所屬基因為Sobic.009G213300.1.v3.2,命名為SbTH。

圖1 引物SNP3測序部分序列比對分析結(jié)果Fig.1 Comparative analysis result of SNP3 sequences

利用Psipred(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)對SbTH進行二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),由于一個堿基位點突變,引起甲硫氨酸(Met)變成精氨酸(Arg)(圖2),二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋(Helix)結(jié)構(gòu)區(qū)域延伸了一個氨基酸(圖3);利用pfam(http://pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫對該蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域分析,結(jié)果顯示,該突變氨基酸位于水解酶_4(Hydrolase_4)保守區(qū)域內(nèi)。

圖2 SbTH基因的突變位點Fig.2 Mutation site of SbTH

圖3 SbTH基因的二級結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structure of SbTH

2.2 SbTH基因在高粱不同組織的表達分析

2.2.1SbTH基因在高粱葉片中的表達 通過qRT-PCR分析K35-Y5和1383葉的基因相對表達量,在K35-Y5葉中,SbTH基因在主莖和分蘗的相對表達量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢,在主莖孕穗期的表達量最高,雖表達量不同,但變化趨勢基本一致;在1383葉中,SbTH基因的表達提前,主莖和分蘗的相對表達量均在枝梗分化期最高,隨后呈現(xiàn)下降的趨勢,變化趨勢也基本一致(圖4)。

圖4 SbTH在K35-Y5和1383葉中表達趨勢Fig.4 SbTH expression trend in K35-Y5 and 1383 leaves

2.2.2SbTH基因在高粱根系中的表達 分析K35-Y5和1383根的基因相對表達量,結(jié)果顯示(圖5),K35-Y5基因相對表達量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢,主莖孕穗期開始極速上升,在分蘗孕穗期表達量最高,到開花期又極速下降;1383基因相對表達量相差不是很大,先上升,在分蘗孕穗期表達量增高,隨后下降再上升,在分蘗開花期達到最高。在K35-Y5與1383根中,SbTH基因相對表達量不同,但趨勢基本一致。

圖5 SbTH在K35-Y5和1383根中表達趨勢Fig.5 SbTH expression trend in K35-Y5 and 1383 roots

2.2.3SbTH基因在高粱莖稈中的表達 通過qRT-PCR分析K35-Y5和1383莖的基因相對表達量,結(jié)果顯示(圖6),K35-Y5主莖與分蘗基因相對表達量在主莖開花期時有顯著差異,主莖相對表達量高,分蘗相對表達量低;1383主莖和分蘗基因相對表達量在各時期的變化無顯著差異,主莖的基因相對表達量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢,在主莖開花期達最高,分蘗的表達量逐漸升高,在分蘗開花期達最高。1383主莖和K35-Y5主莖基因相對表達量在各時期的變化趨勢一致;分蘗的相對表達量在主莖開花期時有顯著差異,K35-Y5分蘗相對表達量低,1383分蘗相對表達量高。

圖6 SbTH在K35-Y5和1383莖中表達趨勢Fig.6 SbTH expression trend in K35-Y5 and 1383 stems

莖稈高度由節(jié)數(shù)、節(jié)間長和穗柄長構(gòu)成,那么SbTH基因是調(diào)控了節(jié)數(shù)與節(jié)間長度還是穗柄長,通過分別比較K35-Y5與1383主莖和分蘗的節(jié)間長度、節(jié)數(shù)與穗柄長,結(jié)果發(fā)現(xiàn),K35-Y5主莖株高105 cm,分蘗株高104 cm;1383主莖株高145 cm,分蘗株高176 cm;K35-Y5分蘗數(shù)2～3個,1383分蘗數(shù)0.6～1.0個。無論是株高整齊一致的K35-Y5還是分蘗高于主莖的1383,穗柄長度基本一致,株高整齊一致的K35-Y5分蘗和主莖節(jié)數(shù)均為7個,節(jié)間長基本一致(圖7-A、B),分蘗高于主莖的1383主莖節(jié)數(shù)13節(jié),分蘗節(jié)數(shù)12節(jié),分蘗比主莖少1節(jié),但節(jié)間長度明顯長于主莖(圖7-C、D)。因此,分蘗高于主莖的原因主要是分蘗節(jié)間比主莖增長,從這一結(jié)果看,SbTH基因基本不影響穗柄長度,而是與節(jié)間的伸長有關(guān)。另外,1383分蘗比主莖少1節(jié),說明其分蘗時期偏晚,晚分蘗是否會造成分蘗高于主莖仍需進一步研究。

A、C.K35-Y5和1383全株;B、D.K35-Y5和1383節(jié)間與穗柄長(標(biāo)尺為5 cm)。A,C.Whole plant of K35-Y5 and 1383;B,D.Internodes and panicle handle of K35-Y5 and 1383 (Ruler is 5 cm).圖7 K35-Y5和1383主莖和分蘗Fig.7 The length of main stem and tillers of K35-Y5 and 1383

3 結(jié)論與討論

高粱的4個株高基因有3個已完成了克隆,Dwl基因(Sobic.009G229800)編碼參與細胞增殖調(diào)節(jié)的高度保守蛋白質(zhì)[22-23],Dw2基因(Sobic.006G067700)編碼蛋白激酶[24],Dw3基因同源于玉米的Br2基因,編碼ABCB1生長素轉(zhuǎn)運體[19-20]。本研究驗證了SNP3位點調(diào)控分蘗高度,所屬基因為Sobic.009G213300.1.v3.2,命名為SbTH,位于水解酶_4保守區(qū)域,有別于其他株高基因。Johnson[28]和Bononi等[29]研究認為,α/β水解酶參與脂質(zhì)信號、代謝和調(diào)節(jié),包括生長和休眠等。但SbTH是如何調(diào)控高粱分蘗生長尚需深入研究。

從SbTH基因在不同組織的表達量來看,不同發(fā)育時期表達量有巨大差異,枝梗分化期和主莖孕穗期時葉片中表達量高,分蘗孕穗期時根中表達量高,到主莖開花期和分蘗開花期時莖中表達量高,SbTH基因的表達峰值依次在葉、根和莖中高表達,可以看出,SbTH基因影響高粱植株的生長并且基因的表達是從葉移動到根、再移動到莖,這與高粱生長的源庫平衡基本一致[30]。

從SbTH基因在葉、根、莖的表達量來看,在葉和根中雖然表達量有差異,但趨勢基本一致;在莖中,分蘗高于主莖的1383表達量和趨勢也基本一致,只有K35-Y5(分蘗高度與主莖一致)在主莖開花期時呈反向表達,主莖表達量達到最高,同期的分蘗表達量降到最低。分析認為,SbTH在K35-Y5分蘗中表達量低,控制了分蘗的過度生長,形成主莖與分蘗高度一致的株型,SbTH在1383分蘗中表達量高,促進分蘗的生長,使得分蘗比主莖高,因此,SbTH基因在主莖開花期差異表達是影響分蘗株高生長的關(guān)鍵。

本研究中,從SbTH基因在1383與K35-Y5這2個材料的表達來看,在葉片中表達量出現(xiàn)較大差異,表達時期也明顯不同,1383在枝梗分化期表達量最高,且主莖表達量比分蘗高;K35-Y5中SbTH基因的表達延后至主莖孕穗期,且分蘗的表達量比主莖高,這可能是由于該基因在1383中表達時期較早,主莖葉片正值發(fā)育時期,主莖比分蘗有更強的活力,導(dǎo)致SbTH基因主莖比分蘗表達量高,而K35-Y5表達量峰值在主莖孕穗期,此時,主莖的葉片數(shù)已經(jīng)固定,葉面積生長達到最大,而分蘗的葉還處于生長時期,從而導(dǎo)致分蘗的表達量比主莖高。SbTH基因高表達會促進高粱植株的生長發(fā)育,K35-Y5分蘗莖在主莖開花期SbTH基因表達量低,抑制了莖的生長,形成表型整齊一致的株型。 Kim等[31]研究認為,高分蘗雜交種比低分蘗雜交種具有更高的早期分蘗出現(xiàn)頻率。本研究中,K35-Y5比1383分蘗力強,K35-Y5比1383的分蘗時間早,1383的分蘗時期偏晚導(dǎo)致1383分蘗比主莖少1節(jié),晚分蘗是否會造成分蘗高于主莖仍需進一步研究。

Chen等[32]從BTx623 EMS誘變?nèi)后w中鑒定了一個NAB1(non-dormantaxillarybud1)基因突變體,nab1突變體增加了分蘗,降低了株高。利用nab1突變體與ShangZhuang掃帚高粱構(gòu)建的F2群體將NAB1定位于6號染色體Sobic.006G170300基因上。NAB1編碼一個類胡蘿卜素裂解雙加氧酶7(CCD7),主要表達在節(jié)和分蘗基部。Govindarajulu等[33]用擬高粱和高粱Tx7000(S.propinquum×S.bicolorTx7000)種間雜交衍生的重組自交系(RIL)群體,將QTL分析與轉(zhuǎn)錄組學(xué)相結(jié)合解析分蘗的遺傳基礎(chǔ),發(fā)現(xiàn)6 189個基因在分蘗伸長過程中有差異表達,如DRM1等,表明這些基因是分蘗伸長的關(guān)鍵調(diào)控因子。本研究結(jié)果表明,SbTH基因在高粱不同組織中均有表達,只有在莖中K35-Y5(分蘗高度與主莖一致)主莖開花期時呈反向表達,主莖表達量達到最高,同期的分蘗表達量降到最低,分析認為,SbTH在K35-Y5分蘗中表達量低,控制了分蘗的過度生長,SbTH基因在高粱分蘗生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

Quinby等[7]在4個確定的Dw1、Dw2、Dw3、Dw4的基因座上鑒定了等位基因變異,認為這些基因座通過改變莖節(jié)間長度來調(diào)節(jié)植株高度。Yamaguchi等[23]研究認為,Dw1降低了節(jié)間的細胞增殖活性,Dw1和Dw3的協(xié)同效應(yīng)有助于提高抗倒伏性和機械收獲。 Brown等[21]對378個高粱自交系使用關(guān)聯(lián)作圖描述dw3突變的表型效應(yīng),表明dw3突變與節(jié)間長度縮短和頂端伸長有關(guān)。Li等[34]研究認為,Dw3影響旗葉以下的莖高度。本研究發(fā)現(xiàn),調(diào)控高粱分蘗高度的基因SbTH在主莖開花期差異表達是影響分蘗節(jié)間伸長的關(guān)鍵,這對提高品種整齊度、適宜機械化生產(chǎn)具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn),調(diào)控高粱分蘗高度的基因SbTH,所屬基因為Sobic.009G213300.1.v3.2,位于水解酶_4保守區(qū)域。SbTH基因在主莖開花期差異表達是影響分蘗株高生長的關(guān)鍵,分蘗莖中表達量低,控制了分蘗節(jié)間的過度生長,形成株高整齊一致的株型。該基因的發(fā)現(xiàn)為研究高粱分蘗高度調(diào)控分子機制奠定了基礎(chǔ),對提高高粱品種整齊度、選育適宜機械化生產(chǎn)高粱品種具有重要的意義。