鈣黏蛋白家族基因CDH3通過PI3K/AKT通路影響宮頸癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)

涂韻之,傅 芬,陳秋連

(1.新余市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,江西 新余 338000; 2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,南昌 330006)

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤,指的是起源于子宮頸的惡性腫瘤。在女性惡性腫瘤中,宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌,占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率的75%～90%左右[1]。在我國(guó),宮頸癌的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢(shì),特別是在欠發(fā)達(dá)國(guó)家,宮頸癌的發(fā)病率和病死率均高于發(fā)達(dá)國(guó)家[2-3]。目前,宮頸癌的臨床治療主要采用手術(shù)、放療、化療等綜合治療方式,其中化療主要以鉑類藥物為主[4]。盡管目前的治療方法一定程度上改善了患者的生存率,但仍存在術(shù)后復(fù)發(fā)和耐藥性等問題,因此尋找有效治療宮頸癌的方法和手段仍是當(dāng)前臨床面臨的難題。

鈣黏蛋白(cadherin,CDH)是一種跨膜糖蛋白,位于細(xì)胞表面,對(duì)細(xì)胞間的黏附功能發(fā)揮著重要作用。其中CDH3是鈣黏蛋白家族的一員[5]。有研究[6]表明,CDH3在癌癥發(fā)展中具有雙向作用。例如,在胃癌、胰腺癌和乳腺癌等腫瘤中,CDH3可以促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散,而在肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌和黑色素瘤中,CDH3則抑制了腫瘤的發(fā)生。目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道CDH3在宮頸癌中的作用機(jī)制。

磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(protein serine threonine kinase,Akt)信號(hào)通路是促進(jìn)存活、抗凋亡的經(jīng)典信號(hào)傳遞途徑,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及放療抵抗密切相關(guān),是近年來腫瘤分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[7]。有研究[8-9]表明,PI3K/Akt信號(hào)傳遞通路在多種人類惡性腫瘤中異?；罨?如宮頸癌、卵巢癌和胰腺癌等。本研究旨在探究CDH3基因表達(dá)變化對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,以及是否通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路來發(fā)揮作用。這將為揭示宮頸癌的分子機(jī)制和臨床治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)及樣本來源

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov/)獲取宮頸癌患者的基因表達(dá)和相關(guān)臨床數(shù)據(jù)。

從2019年至2021年間于江西省新余市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科接受治療的10例宮頸癌患者手術(shù)中獲取活檢樣本(宮頸癌及癌旁組織)。樣本清洗后放入編號(hào)的離心管中,于液氮罐中儲(chǔ)存。人宮頸癌HeLa和C33A細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心,進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2 基因差異表達(dá)、生存和KEGG通路分析

使用R軟件的“l(fā)imma”包對(duì)宮頸癌患者的CDH家族基因的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行貝葉斯差異分析,得到差異表達(dá)基因,通過R軟件的“ggplot2”包繪制基因表達(dá)情況的箱式圖。將表達(dá)上調(diào)的CDH基因與生存相關(guān)的基因取交集,通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)(http://kmplot.com),用best cutoff算法分析交集基因表達(dá)對(duì)患者總生存期(OS)的影響。根據(jù)交集基因表達(dá)的中位數(shù)將宮頸癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,通過R軟件的“CluserProfiler”包對(duì)篩選出的基因進(jìn)行KEGG通路分析。

1.3 qPCR

用Trizol試劑提取樣本總RNA。使用TransScript?Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)合成cDNA。使用PerfectStart?Green qPCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行qPCR。目的基因引物序列為CDH3-F:5′-CAGGTGCTGAACATCACGGACA-3′;CDH3-R:5′-CTTCAGGGACAAGACCACTGTG-3′。內(nèi)參基因引物序列為GAPDH-F:5′-TCCACTGGCGTCTTCACC-3′;GAPDH-R:5′-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3′。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人宮頸癌HeLa和C33A細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心,均培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清的Eagle最低必需培養(yǎng)基(北京普邁精醫(yī)科技有限公司)中,在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

構(gòu)建sh-CDH3#1、sh-CDH3#2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,干擾CDH3表達(dá);構(gòu)建CDH3-OE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,增強(qiáng)CDH3表達(dá);用sh-NC空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,作為對(duì)照。

1.5 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染了sh-NC、sh-CDH3#1和sh-CDH3#2質(zhì)粒的細(xì)胞以相同的密度接種到新培養(yǎng)孔,培養(yǎng)0、1、2、3、4 d后加入CCK8工作液(CCK8溶液：培養(yǎng)基=1：10),37 ℃培養(yǎng)箱中孵育3 h后,測(cè)定450 nm 處的吸光值。

1.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲

將轉(zhuǎn)染了sh-NC、sh-CDH3#1和sh-CDH3#2質(zhì)粒的細(xì)胞接種到含有RPMI1640培養(yǎng)基(2%胎牛血清)的Transwell上室中,下室中加入胎牛血清濃度為20%的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后,加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。擦去膜上側(cè)細(xì)胞,下側(cè)細(xì)胞用1%結(jié)晶紫溶液染色,用PBS洗去染色液后在顯微鏡下拍照分析細(xì)胞遷移。

侵襲實(shí)驗(yàn)方法與遷移實(shí)驗(yàn)基本相同,接種細(xì)胞前在Transwell上室中加入100 μL濃度為1 mg·mL-1的Matrigel,37 ℃孵育3～5 h使其凝固。

1.7 Western blot檢測(cè)

在轉(zhuǎn)染72 h收獲細(xì)胞,通過10% SDS/PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封閉后,將膜在4 ℃下與一抗孵育過夜。洗膜后,再次將蛋白與二抗在室溫下孵育1 h,再次洗膜。最后,使用ChemiDocTMXRS顯影系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)檢測(cè)目標(biāo)蛋白。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CDH家族基因在宮頸癌患者中的表達(dá)情況

共從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲取547例宮頸癌患者和35例健康女性的基因表達(dá)數(shù)據(jù),分析結(jié)果顯示CDH15、CDH18、CDH24和CDH3在宮頸癌患者中表達(dá)上調(diào),CDH11、CDH4、CDH23、CDH5、CDH19、CDH12、CDH22、CDH8和CDH2表達(dá)下調(diào)(圖1)。把差異上調(diào)的CDH基因和生存相關(guān)的CDH基因取交集,得到2個(gè)基因:CDH3和CDH18(圖2)。而CDH3的表達(dá)量顯著高于CDH18(圖3),因此選擇CDH3作為目的基因進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 CDH家族基因在宮頸癌患者中的表達(dá)火山圖

圖2 表達(dá)上調(diào)與生存相關(guān)的CDH基因的韋恩圖 圖3 差異表達(dá)上調(diào)基因的表達(dá)量箱式圖

2.2 CDH3表達(dá)對(duì)宮頸癌患者OS的影響

生存分析結(jié)果顯示,與CDH3低表達(dá)組相比,CDH3高表達(dá)組患者的預(yù)后生存情況顯著較差(P=0.029)。見圖4。

2.3 CDH3在宮頸癌組織中高表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示,宮頸癌組織中的CDH3表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織(P<0.000 1)。見圖5。

2.4 CDH3敲低抑制宮頸癌細(xì)胞增殖

CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HeLa和C33A的sh-CDH3#1組和sh-CDH3#2組的增殖能力均顯著低于NC組(P<0.01或P<0.001),CDH3敲低明顯降低了宮頸癌細(xì)胞的增殖能力。見圖6。

2.5 CDH3敲低對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與sh-NC組相比,sh-CDH3#1和sh-CDH3#2組的HeLa和C33A細(xì)胞的遷移能力顯著降低(P<0.001或P<0.000 1,圖7A)。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,sh-CDH3#1和sh-CDH3#2組細(xì)胞侵襲能力較sh-NC組顯著降低(P<0.001或P<0.000 1,圖7B)。以上結(jié)果表明,敲低CDH3基因會(huì)抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

A:敲低CDH3降低HeLa和C33A細(xì)胞的遷移能力;B:敲低CDH3降低HeLa和C33A細(xì)胞的侵襲能力。*P<0.001,**P<0.000 1。

2.6 CDH3通過PI3K/AKT通路影響宮頸癌細(xì)胞活動(dòng)

KEGG分析結(jié)果顯示,CDH3在PI3K/AKT通路顯著富集(圖8A),提示CDH3通過調(diào)控PI3K/AKT通路影響宮頸癌細(xì)胞活動(dòng)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了KEGG分析的結(jié)論:與NC組相比,sh-CDH3組CDH3表達(dá)水平降低,CDH3-OE組CDH3表達(dá)水平增加,表明HeLa和C33A細(xì)胞轉(zhuǎn)染均有效(圖8B);與NC組相比,shCDH3組P-PI3K和P-AKT表達(dá)量降低,PI3K和AKT表達(dá)無明顯變化,而CDH3-OE組P-PI3K和P-AKT表達(dá)量升高,PI3K和AKT表達(dá)無明顯變化(圖8C)。上述結(jié)果表明CDH3通過促進(jìn)PI3K和AKT的磷酸化調(diào)控PI3K/AKT通路,進(jìn)而影響宮頸癌細(xì)胞的活動(dòng)。

A:CDH3的KEGG通路分析;B:CDH3敲低和過表達(dá)后,HeLa和C33A細(xì)胞中CDH3的表達(dá)水平;C:CDH3的敲低和過表達(dá)對(duì)PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白的影響。

3 討論

宮頸癌是一種高發(fā)病率的癌癥,其中人乳頭瘤病毒是主要致病因素。盡管宮頸癌的治療已經(jīng)在多個(gè)方面取得了突破性進(jìn)展,但大多數(shù)患者的預(yù)后仍然不理想,治療方案常常存在嚴(yán)重的副作用[10]。因此,探究影響宮頸癌預(yù)后的因素和機(jī)制顯得十分必要。CDH3屬于鈣素家族的一員,最初于1986年由國(guó)外學(xué)者NOSE等在小鼠胚胎發(fā)育中發(fā)現(xiàn)。該家族是一類重要的細(xì)胞間黏附分子,參與細(xì)胞極性和細(xì)胞分化的調(diào)節(jié),有助于維持組織內(nèi)的穩(wěn)態(tài)[11-13]。在人類正常組織中,只有胸腺和胎兒大腦中檢測(cè)到CDH3的低表達(dá)水平,然而在多種人類腫瘤組織中檢測(cè)到CDH3高表達(dá)[14]。已有研究[15]明確表明,CDH3參與胚胎發(fā)育和成體組織結(jié)構(gòu)中細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持過程,對(duì)細(xì)胞分化、形態(tài)、極性、生長(zhǎng)和遷移等過程具有重要意義。

本研究通過差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),CDH3和CDH18是與宮頸癌患者生存相關(guān)的2個(gè)基因。盡管這兩個(gè)基因都與生存相關(guān),但CDH3的表達(dá)量更高,因此可以考慮CDH3對(duì)宮頸癌生存影響更大。此前的研究表明,CDH3在高分化胃癌組織中高表達(dá),并被認(rèn)為是胃癌患者預(yù)后的一個(gè)標(biāo)志物[16-17]。本研究的預(yù)后生存分析也顯示,CDH3高表達(dá)組的患者預(yù)后明顯更差(P=0.029),這進(jìn)一步證實(shí)了CDH3的表達(dá)差異會(huì)影響患者預(yù)后。因此,筆者收集了宮頸癌臨床患者的10對(duì)癌及癌旁組織,并檢測(cè)了CDH3的基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示,CDH3在宮頸癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織,這與筆者的生信分析結(jié)果一致。此外,其他研究[18-19]也表明CDH3在結(jié)直腸癌組織和患者血漿中高表達(dá),并且CDH3的過表達(dá)會(huì)促進(jìn)多種癌細(xì)胞的遷移和侵襲[20-21],包括胰腺導(dǎo)管癌[22]。針對(duì)CDH3在宮頸癌中的作用,本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示,敲低CDH3表達(dá)可以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。這些結(jié)果表明CDH3在宮頸癌中具有促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展的作用。因此,CDH3有望成為宮頸癌診斷和治療的重要靶點(diǎn)。

PI3K/Akt信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞周期的各個(gè)進(jìn)程,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并且在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色[23]。當(dāng)PI3K受到上游信號(hào)(如生長(zhǎng)因子)等刺激后,能夠激活A(yù)kt。激活的Akt會(huì)進(jìn)一步激活下游信號(hào)分子,發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞多生物學(xué)活性的調(diào)控作用[24]。根據(jù)CDH3的表達(dá)中位數(shù)將患者分為高表達(dá)和低表達(dá)組,進(jìn)行KEGG通路分析,發(fā)現(xiàn)CDH3與PI3K/Akt信號(hào)通路密切相關(guān)。隨后,筆者通過Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí),敲低CDH3后,P-PI3K和P-AKT表達(dá)量降低。過表達(dá)CDH3后,P-PI3K和P-AKT表達(dá)量升高。這些結(jié)果說明CDH3的表達(dá)變化會(huì)影響PI3K/Akt信號(hào)通路的激活。

本研究證實(shí)CDH3在宮頸癌組織中顯著高表達(dá),并且與患者不良預(yù)后相關(guān)。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)CDH3在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá),敲低CDH3表達(dá)會(huì)抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,這種調(diào)控作用與PI3K/Akt信號(hào)通路的激活有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)可能為未來的宮頸癌臨床治療提供重要的理論基礎(chǔ)。然而,CDH3的具體作用機(jī)制尚不明確,需要進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。