過表達(dá)CTRP9抑制ApoE基因敲除小鼠肝臟脂肪病變

李向宇,艾樂樂,劉玉琪,梁國朵,相奧琪,陳曉暢,余 琦,關(guān) 華,2

(1.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所,陜西省缺血性心血管疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710021;2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心,西安 710067)

C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9(C1q/tumor necrosis factor-related protein 9,CTRP9)是一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子,是脂聯(lián)素最接近的同源物[1-2]。CTRP9蛋白水解釋放其球狀結(jié)構(gòu)域(global CTRP9,gCTRP9),作為主要循環(huán)亞型和功能單位存在于生物個體內(nèi)[3]。在與脂聯(lián)素受體1(adiponectin receptor 1,AdipoR1)和N-鈣黏蛋白結(jié)合(N-cadherin)后,CTRP9激活各種信號通路以調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝[4]、血管舒張和細(xì)胞分化[5]。以往研究證明CTRP9可有效地抵抗心肌缺血再灌注后模型動物的炎癥反應(yīng)[6],以及其對2型糖尿病[7]、胰島素抵抗和肥胖[8]、肺動脈高壓[9]、心力衰竭[6]、心肌梗死和動脈粥樣硬化[10]等也具有有益作用,抑制CTRP9表達(dá)能夠顯著加劇野生型C57BL/7J小鼠肝臟脂肪病變[11]。載脂蛋白E(ApoE)是所有血漿脂蛋白的重要組成部分,ApoE基因突變與脂肪變性和肝損傷密切相關(guān)[12-13]。本研究探討CTRP9對高脂血癥模型ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠肝臟脂肪病變形成的影響及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

雄性SPF級ApoE-/-小鼠30只,8周齡,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[北京百善SCXK(京)2016-0006]。將30只小鼠隨機(jī)分為觀察組與對照組,每組15只,對照組小鼠給予尾靜脈注射腺病毒空載綠色熒光蛋白(adenovirus green florence protein,Ad-GFP),觀察組小鼠給予尾靜脈注射腺病毒Ad-CTRP9。2組小鼠注射病毒后均飼喂高脂高膽固醇飲食(HF/HC)12周,飼料成分為21%脂肪+0.15%膽固醇,飼喂至20周齡,采集尾靜脈血,再給予150 mg·kg-1戊巴比妥腹腔注射處死小鼠收集肝臟組織。實(shí)驗(yàn)在西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心屏障動物房[SYXK(陜)2012-005進(jìn)行],動物飼養(yǎng)室溫度、光照、噪聲和換氣次數(shù)均符合國際要求,自由飲水和采食,所有動物處理程序符合美國NIH實(shí)驗(yàn)動物管理法。

1.2 主要試劑和儀器

伊紅染色液、蘇木素染色劑、酒精購自北京雷根生物技術(shù)有限公司;水性封片劑購自廣州凱秀貿(mào)易有限公司;總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒(HDL-C)購自中生北控生物科技股份有限公司。冰凍切片機(jī)(德國Leika公司,型號:RM2235),圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus 6.0),電子天平(瑞士Mettler Toledo公司,型號:AB104-S)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腺病毒CTRP9載體構(gòu)建與細(xì)胞感染

根據(jù)文獻(xiàn)[12]方法構(gòu)建編碼CTRP9重組腺病毒載體(Ad-CTRP9)。將CTRP9 cDNA亞克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack CMV中。序列確認(rèn)后,將重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中。將重組腺病毒包裝并在HEK293A細(xì)胞中擴(kuò)增。純化后,通過TCID50檢測病毒滴度。構(gòu)建空腺病毒載體(Ad-GFP)作為對照。

1.3.2 血脂水平檢測

HF/HC飲食飼喂12周后,禁食16 h,尾靜脈采血置于EDTA抗凝劑處理的Ep管中,3000 r·min-1,4 ℃離心15 min,取血漿,用商品化檢測試劑盒檢測TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。根據(jù)中生北控檢測試劑盒產(chǎn)品說明書,TC采用CHOD-PAP法,TG采用GPO-PAP法,HDL-C采用直接法-過氧化氫酶清除法,LDL-C采用直接法-表面活性劑清除法進(jìn)行檢測。

1.3.3 油紅O(ORO)染色

從-80 ℃冰箱中取出肝臟組織冰凍切片在室溫復(fù)溫30 min,用4%多聚甲醛中固定30 min,蒸餾水沖洗3次,每次1 min;用60%異丙醇溶液預(yù)處理15 min,隨后加入0.5%的ORO工作液室溫染色30 min,隨后用60%異丙醇溶液浸洗1 min,蒸餾水輕輕沖洗3次,用水溶性封片劑封片、照相。

1.3.4 蘇木素-伊紅(HE)染色

從-80 ℃冰箱中取出肝臟組織冰凍切片在室溫復(fù)溫30 min,用4%多聚甲醛固定30 min,蒸餾水沖洗3次,每次1 min;蘇木素染色10 min;流動水沖洗,1%鹽酸酒精分化10 s,伊紅染色2 min,流動水沖洗3 min,95%乙醇浸洗2 min;100%乙醇浸洗2 min,二甲苯浸洗10 min,中性樹脂封片、照相。

1.3.5 實(shí)時PCR(real-time PCR)分析

使用TRIzol Plus(美國Invitrogen公司)提取小鼠肝臟的總RNA,并使用SuperScript?Ⅲ第一鏈合成系統(tǒng)(美國Invitrogen公司)合成cDNA。使用TaKaRa TP800(日本TaKaRa Biology Inc)進(jìn)行real-time PCR分析。定量轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量,并根據(jù)其β-actin含量對每個樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。PCR引物序列如表1所示。

表1 靶基因的引物序列

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡(western blotting)

從肝組織提取蛋白質(zhì),并通過BCA法測定濃度。從每組中隨機(jī)選擇總共6個樣品進(jìn)行western blotting。分離蛋白質(zhì),然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上(美國Thermo Fisher Scientific Inc)。將膜與每種一級抗體(Ab)孵育如下:抗-CTRP9和抗-b-actin,按照制造商所用說明,在4 ℃下培養(yǎng)過夜,洗滌3次后,將膜與辣根過氧化物酶綴合的二級Ab(1：5000)孵育2 h,使用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(美國Millipore公司)建立印跡。

1.3.7 肝脂質(zhì)分析

將100 mg新鮮肝臟勻漿組織用1.9 mL氯仿-甲醇(2：1)混合物(v/v)稀釋至2 mL,將勻漿提取過夜(4 ℃)并離心(3000 r·min-1,20 min)。用移液管取下相液體100 μL,并轉(zhuǎn)移至玻璃管中,用氮?dú)飧稍镏|(zhì)以使氯仿擴(kuò)散,用50 μL乙醇溶解Ep管底部的脂質(zhì)并使用商業(yè)分析試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)測量肝臟TC和TG。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CTRP9在肝臟組織中的表達(dá)水平

Real-time PCR和western blotting檢測結(jié)果顯示,觀察組肝臟組織中CTRP9 mRNA和蛋白表達(dá)均較對照組明顯上調(diào)(P<0.05或P<0.001),其中基因表達(dá)上調(diào)約20倍,蛋白表達(dá)上調(diào)約2倍(P<0.05),見圖1。

A:CTRP9 mRNA表達(dá)比較;B:western blotting檢測;C:CTRP9蛋白表達(dá)比較;

2.2 體重和血脂水平分析

與對照組相比,觀察組小鼠體重及血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、葡萄糖水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖2。

A:體重;B:血清TC水平;C:血清TG水平;D:血清HDL-C水平;E:血清LDL-C水平;F:血清葡萄糖水平。

2.3 肝臟脂肪病變及相關(guān)基因表達(dá)

肝臟組織HE、ORO染色顯示,與對照組相比,觀察組肝臟組織中脂質(zhì)蓄積顯著降低(圖3A)。另外,與對照組相比,觀察組肝臟組織中脂質(zhì)含量顯著降低(P<0.05),其中TC和TG含量分別下降45%和20%(圖3B—C)。

A:肝臟組織HE和ORO染色;B:肝臟組織TC含量;C:肝臟組織TG含量;*P<0.05與對照組(Ad-GFP)相比。

為了進(jìn)一步確定CTRP9抑制肝臟脂肪病變的機(jī)制,利用real-time PCR檢測肝臟組織中相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果顯示:與對照組相比,觀察組肝臟新生脂肪生成相關(guān)基因FAS、SCD1,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SREBP1c,炎癥相關(guān)基因MCP-1、MIP1α、IL-1β表達(dá)水平顯著下降(P<0.01或P<0.001);脂代謝相關(guān)基因PPARα、PPARγ、LXRα、LXRβ,脂肪酸氧化和氧化磷酸化相關(guān)基因CPT1、CPT2、COX4、Cytoc、Acadl、Acadm表達(dá)水平顯著升高(P<0.05或P<0.01),見圖4。表明過表達(dá)CTRP9能夠通過促進(jìn)脂肪酸氧化磷酸化抑制肝臟組織中脂肪生成以及炎癥反應(yīng),增加線粒體能量消耗,從而降低肝臟組織中脂質(zhì)蓄積。

3 討論

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)病率逐年升高,其危害不僅限于肝臟組織,對周身其他器官的代謝功能也產(chǎn)生劇烈影響[14]。NAFLD早期,肝細(xì)胞中脂質(zhì)蓄積導(dǎo)致脂肪樣變,多種細(xì)胞因子表達(dá)紊亂,線粒體功能障礙以及肝細(xì)胞炎癥反應(yīng),促使NAFLD發(fā)展為非酒精性脂肪肝肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)[15]。在本研究中,給雄性ApoE-/-小鼠飼喂高脂高膽固醇飲食,同時通過尾靜脈注射腺病毒以確保CTRP9表達(dá)升高。結(jié)果顯示,與對照組相比,盡管過表達(dá)CTRP9對小鼠的血脂水平和體重沒有顯著影響,但是肝脂肪病變顯著減少,同時,肝臟組織中TC和TG水平顯著降低。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),肝組織線粒體氧化磷酸化相關(guān)基因表達(dá)顯著升高,而新生脂肪生成以及炎癥因子相關(guān)基因表達(dá)顯著下降。表明過表達(dá)CTRP9可通過促進(jìn)肝細(xì)胞線粒體氧化磷酸化顯著降低ApoE-/-小鼠脂肪肝形成。

ApoE是所有血漿脂蛋白的重要組成部分,并作為細(xì)胞表面脂蛋白受體,如LDL受體的配體。當(dāng)喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料時,ApoE-/-小鼠自發(fā)地發(fā)生高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化,而HF/HC可進(jìn)一步加重這些損傷并加速該過程,喂食HF/HC的ApoE-/-小鼠可以作為一種快速且有價值的NAFLD模型[16]。外顯子微陣列分析協(xié)同計(jì)算機(jī)斷層掃描發(fā)現(xiàn),ApoE基因突變與脂肪肝形成顯著關(guān)聯(lián)[12];基因突變序列分析結(jié)果顯示,ApoE基因突變與脂肪變性和肝損傷密切相關(guān)[13]。因此,本研究通過檢測喂食HF/HC的ApoE-/-小鼠肝臟中CTRP9的表達(dá),探索CTRP9對脂肪肝形成的潛在機(jī)制。

SREBPs屬于bHLH LZ轉(zhuǎn)錄因子家族,作為二聚體與脂質(zhì)代謝靶基因SRE,5′-TCACCC-3′結(jié)合[17]。作為一個調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成的主控基因,SREBPs包含3種異構(gòu)體,SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2,在脂質(zhì)合成中發(fā)揮不同的作用[18]。SREBP-1c肝臟過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠證實(shí),其在生脂基因轉(zhuǎn)錄激活中具有關(guān)鍵作用,導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)累積和胰島素抵抗增加[19]。盡管已知SREBP通過結(jié)合SRE發(fā)揮功能,但由于非典型酪氨酸殘基取代了存在于堿性區(qū)域的保守精氨酸,SREBP也可以與E-box域結(jié)合[20]。FAS(脂肪酸合酶)作為脂肪酸合成的關(guān)鍵基因,-CAT啟動子區(qū)包含SRE和E-box結(jié)構(gòu)域[20]。ChIP檢測發(fā)現(xiàn),SREBP1c與FAS啟動子區(qū)結(jié)合,從而激活FAS基因的表達(dá)[21]。本研究中,過表達(dá)CTRP9抑制SREBP1c和FAS基因表達(dá),油紅O染色結(jié)果顯示肝臟脂肪病變顯著減少,與先前的研究結(jié)果相一致。

PPARα(過氧化物酶體增殖物激活受體α)是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,與PPARγ和PPARβ/δ均屬于NR1C核受體亞家族,許多PPARα靶基因參與肌肉、心臟和肝臟等高氧化率組織中的脂肪酸代謝[22]。PPARα激活可改善NAFLD臨床前模型中的脂肪變性、炎癥和纖維化,確定了一個新的潛在治療領(lǐng)域[23]。先前的研究[24-25]證實(shí),PPARα是涉及過氧化物酶體和線粒體β氧化、FA反式轉(zhuǎn)運(yùn)和肝葡萄糖生成基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,通過蛋白-蛋白相互作用負(fù)調(diào)控促炎信號通路,配體激活的PPARα通過干擾AP-1和NFκB信號通路抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的IL-6基因表達(dá),如全身炎癥、動脈粥樣硬化或NAFLD等動物模型中所見。本研究證實(shí),過表達(dá)CTRP9促進(jìn)PPARα基因表達(dá)上調(diào),減輕肝臟脂肪變性,繼而上調(diào)線粒體氧化磷酸化的基因表達(dá),而炎癥相關(guān)基因表達(dá)被抑制,與先前的研究結(jié)果相一致。

線粒體是參與能量生產(chǎn)和許多代謝過程的關(guān)鍵細(xì)胞器,在結(jié)構(gòu)上,它們具有包圍膜空間的內(nèi)、外膜[26]。內(nèi)膜內(nèi)是線粒體基質(zhì),其中發(fā)生重要代謝過程,如三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)[27]。在肝臟脂肪病變過程中,線粒體功能障礙,活性氧生成增加和氧化磷酸化受損。本研究顯示,過表達(dá)CTRP9促進(jìn)氧化磷酸化相關(guān)基因表達(dá)升高,說明CTRP9激活線粒體氧化磷酸化過程,加快線粒體能量代謝,這一分子機(jī)制與肝細(xì)胞中脂質(zhì)蓄積減少相一致。

綜上所述,過表達(dá)CTRP9可顯著抑制ApoE-/-小鼠脂肪肝形成,肝臟中TC、TG含量顯著減少。同時,過表達(dá)CTRP9可顯著抑制肝臟脂質(zhì)合成轉(zhuǎn)錄因子SREBP1c的表達(dá),同時促進(jìn)線粒體氧化磷酸化相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào),表明CTRP9能夠通過改善線粒體氧化磷酸化促進(jìn)能量代謝、抑制脂質(zhì)生成2個方面緩解高脂血癥模型中肝臟脂肪病變的形成。