體外轉(zhuǎn)錄 mRNA 藥物及其在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

譚珍 向莉 江高峰

體外轉(zhuǎn)錄（in vitro transcribed，IVT）mRNA通常指的是在體外以DNA為模板轉(zhuǎn)錄獲得的一種信使RNA（messenger RNA，mRNA）結(jié)構(gòu)上類似于天然mRNA，可在體內(nèi)細(xì)胞中傳遞遺傳信息。Buckstein等［1］于2005年發(fā)現(xiàn)，將mRNA直接注射到小鼠肌肉或皮膚中，可以產(chǎn)生特異性抗體反應(yīng)，這說明IVT mRNA可以在體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄成蛋白質(zhì)，從而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。同樣地，當(dāng)特定的IVT mRNA藥物被注射到人體內(nèi)時(shí)，也可以進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞并被翻譯成特定蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生治療效果。隨后的多項(xiàng)研究將IVT mRNA作為一種潛在新型藥物逐步應(yīng)用于各種臨床前實(shí)驗(yàn)，旨在驗(yàn)證IVT mRNA藥物的有效性和安全性，以便未來將其應(yīng)用于人體臨床試驗(yàn)。例如腫瘤免疫治療、傳染病與過敏反應(yīng)疫苗研發(fā)、蛋白質(zhì)替代療法、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域［2-4］。mRNA藥物最初的應(yīng)用領(lǐng)域是在腫瘤治療領(lǐng)域，隨著mRNA技術(shù)的不斷優(yōu)化，引發(fā)的不良反應(yīng)得以降低，mRNA逐漸進(jìn)入了預(yù)防性疫苗領(lǐng)域。近年來，mRNA工程技術(shù)取得了迅速發(fā)展，這為mRNA藥物合成、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及長時(shí)間高表達(dá)提供了有力的技術(shù)支持。目前，mRNA藥物受到越來越多的關(guān)注，特別是在腫瘤免疫治療領(lǐng)域，甚至進(jìn)入了臨床開發(fā)階段［5］。本文將回顧mRNA藥物的特征以及其在腫瘤免疫治療領(lǐng)域的相關(guān)研究進(jìn)展。

1 mRNA 藥物概況

1.1 mRNA藥物的療法及研究進(jìn)展 mRNA療法是一種具有巨大應(yīng)用前景的新型基因療法，它可以通過表達(dá)功能性蛋白來治療基因缺陷性疾病或進(jìn)行組織修復(fù)，也可以通過表達(dá)抗原、抗體或受體來應(yīng)用于免疫治療。目前mRNA藥物的應(yīng)用主要集中在3個(gè)方向上：免疫療法、蛋白質(zhì)替代療法和再生醫(yī)學(xué)療法［6-8］。在免疫療法中，腫瘤免疫療法和預(yù)防傳染病的疫苗是最為成功和成熟的。在腫瘤免疫治療中，利用體外合成的IVT mRNA分子將編碼相關(guān)抗原、特異性抗原、抗體或受體的mRNA輸送到細(xì)胞內(nèi)。這些mRNA分子在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)翻譯成蛋白質(zhì)，刺激特定的免疫反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)預(yù)防和治療疾病的目的。作為一個(gè)突破性的技術(shù)平臺(tái)，mRNA具有預(yù)防和治療多種疾病的潛力，有可能在一定程度上取代傳統(tǒng)藥物和疫苗，開辟新的治療前沿并革新新的治療方法［9］。

使用IVT mRNA藥物的最基本理念是將預(yù)先設(shè)計(jì)好的基因信息傳遞到患者細(xì)胞內(nèi)，從而預(yù)防或治療特定的疾病。mRNA藥物發(fā)展迅速，mRNA疫苗商業(yè)化的成功推動(dòng)了核酸藥物開發(fā)發(fā)展的新階段。目前，全球mRNA藥物適應(yīng)證主要包括遺傳病、新冠肺炎和其他傳染病，而國內(nèi)mRNA研究領(lǐng)域以新冠疫苗為主。目前正在研發(fā)的mRNA藥物可以根據(jù)其用途和藥物類型分為3大類：預(yù)防性疫苗、治療性疫苗和治療性藥物［10-12］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球有56種mRNA藥物正在臨床開發(fā)中，研發(fā)主要集中在疫苗，約占84%，而治療藥物約占16%。除了急需上市的RNA新冠肺炎疫苗外，大多數(shù)疫苗都處于早期階段［13］。

1.2 mRNA 藥物的制備及遞送方式 目前IVT mRNA的制備方法主要有2種，利用環(huán)狀質(zhì)粒脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物或合成的雙鏈寡核苷酸作為模板進(jìn)行體外合成，轉(zhuǎn)錄過程由T7、T3或SP6噬菌體RNA聚合酶在核糖核苷三磷酸鹽存在下進(jìn)行［3］。體外轉(zhuǎn)錄后，須經(jīng)過濃縮、沉淀、提取、層析等一系列純化過程才能得到mRNA。傳統(tǒng)的純化方法，如陰離子交換色譜法和高效液相色譜法，雖然能夠去除雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）污染物，降低mRNA的毒性并改善mRNA的翻譯能力，但不易擴(kuò)展，限制了大規(guī)模生產(chǎn)［14］。Baiersdorfer等［15］發(fā)現(xiàn)一種簡單方法，即通過使用纖維素吸附雙鏈RNA污染物來純化mRNA。這種方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于mRNA制備，尤其是在mRNA疫苗的制備中。近年來，該方法已經(jīng)得到了改進(jìn)和優(yōu)化，以進(jìn)一步提高其純化效率和產(chǎn)量，例如結(jié)合其他技術(shù)如超聲波和離心等，總體而言，該方法已經(jīng)成為了mRNA藥物制備中的一種重要的技術(shù)，具有操作簡單、純化效果好、損失小等優(yōu)點(diǎn)。

遞送系統(tǒng)技術(shù)對(duì)于確保mRNA藥物的有效性和安全性至關(guān)重要，它在保護(hù)RNA結(jié)構(gòu)、提高靶向能力、減少藥物遞送劑量和減少毒副作用方面發(fā)揮著重要作用。改進(jìn)傳遞方式可顯著改善細(xì)胞對(duì)mRNA藥物的攝取率，同時(shí)也可保護(hù)藥物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不易被分解。目前，mRNA的主要遞送方式分3種：物理傳送方式、載體遞送方式、直接遞送方式。然而，這幾種方法都仍存在缺點(diǎn)。體外負(fù)載DCs費(fèi)用昂貴，方法復(fù)雜，結(jié)內(nèi)注射及電穿孔等難以在人體身上實(shí)施。因此，將mRNA藥物共調(diào)配脂質(zhì)納米粒（lipid nanoparticles，LNPs）是目前最成熟的遞送方式之一［16］，保護(hù)mRNA不受降解的同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞攝取效率［17-19］。

1.3 mRNA 藥物優(yōu)勢 1972年，F(xiàn)riedmann與Robtin首次提出基因治療概念，隨后在一段時(shí)間內(nèi)，DNA治療的研究大量興起，相較于DNA，mRNA藥物在半衰期短、穩(wěn)定性、體內(nèi)傳遞效率及其固有免疫原性［5，14］等方面存在一些問題，未能受到重視，而這些問題已經(jīng)逐漸被攻克，近十余年的大量研究證明，與DNA治療方法相比，mRNA藥物已呈現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢［20-23］：①mRNA藥物進(jìn)入細(xì)胞漿后可以立即翻譯大量蛋白質(zhì)，不需要進(jìn)入細(xì)胞核就能發(fā)揮作用。而DNA藥物則需要進(jìn)入細(xì)胞核才能轉(zhuǎn)錄出mRNA，且需要在細(xì)胞分裂核膜破裂時(shí)發(fā)揮作用，然后再運(yùn)輸至細(xì)胞漿中表達(dá)蛋白質(zhì)?？梢?，mRNA藥物進(jìn)入體內(nèi)后發(fā)揮作用所需時(shí)間短，效率更高。②mRNA藥物不會(huì)融入到宿主基因組，不存在插入突變的風(fēng)險(xiǎn)。而病毒DNA則可能通過整合作用導(dǎo)致基因組發(fā)生突變。③mRNA藥物只是瞬時(shí)翻譯蛋白質(zhì)發(fā)揮活性，隨后會(huì)被徹底降解，副作用容易控制。相反，DNA藥物殘留時(shí)間較長。④生產(chǎn)mRNA藥物相對(duì)簡單、經(jīng)濟(jì)。因此，mRNA這種特性更適合應(yīng)用于藥物，其藥物研究與應(yīng)用日益受到重視。

2 mRNA疫苗在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

在腫瘤免疫治療中，mRNA疫苗作為一種新型的治療手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。mRNA疫苗通過遞送編碼腫瘤抗原的mRNA進(jìn)入機(jī)體，刺激機(jī)體免疫細(xì)胞來攻擊腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療腫瘤的效果。近年來，mRNA疫苗已經(jīng)在多種腫瘤治療中展示出了良好的療效，例如惡性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌等［24］。同時(shí)，mRNA疫苗還可以與其他腫瘤治療如化療、放療等進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，提高治療效果。此外，mRNA疫苗具有快速、靈活、高效、低成本等優(yōu)勢［25］，這些特性也使得mRNA疫苗成為一個(gè)備受關(guān)注的研究領(lǐng)域。

mRNA疫苗被分為兩種類型，基于非擴(kuò)增mRNA的疫苗和自擴(kuò)增mRNA，它們均能進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)翻譯產(chǎn)生靶向抗原，并誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答［20］。非擴(kuò)增的mRNA 疫苗只包含mRNA的基本結(jié)構(gòu)，其優(yōu)勢在于分子量較小，沒有額外的蛋白質(zhì)，減少了與宿主產(chǎn)生其他免疫刺激的可能性，且容易大規(guī)模制造，而最大障礙是細(xì)胞內(nèi)傳遞［26-27］。由陽離子脂質(zhì)和聚合物作為載體的mRNA疫苗已經(jīng)被證明可增強(qiáng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答［28］。自擴(kuò)增mRNA（self-amplified mRNA，SAM）衍生于自擴(kuò)展 a 病毒，不僅包含編碼抗原的序，且含有促進(jìn)RNA封蓋和復(fù)制的非結(jié)構(gòu)蛋白，可延長持續(xù)時(shí)間和表達(dá)量，但其分子量大，可能限制細(xì)胞的內(nèi)化效率，且與抗原不相關(guān)的蛋白質(zhì)可能誘導(dǎo)其他的宿主反應(yīng)［29］。研究［5］證明脂質(zhì)納米包封的SAM疫苗可引起針對(duì)HIV、H7N9等多種傳染病的功能性免疫反應(yīng)。最近的研究表明［30］，脂質(zhì)或聚合物載體可誘導(dǎo)1型IFN激活，改善整體疫苗免疫應(yīng)答。此外，編碼免疫調(diào)節(jié)因子的mRNA，如CD40L、CD70、OX40L、GM-CSF等，也可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的激活［3］。事實(shí)上，科學(xué)家們幾十年來一直在研究和使用mRNA疫苗來針對(duì)各種疾病，mRNA疫苗并不是一項(xiàng)新的生物技術(shù)，而這一技術(shù)開發(fā)的初衷是為了研發(fā)抗癌疫苗。利用mRNA技術(shù)開發(fā)腫瘤疫苗的優(yōu)勢在于它可以輕松表達(dá)20個(gè)以上的腫瘤抗原，特別適用于癌癥的個(gè)體化治療，即使只有很少的腫瘤組織樣本，也可以獲取到所有抗原信息，從而制定個(gè)性化的腫瘤疫苗。

不同于傳統(tǒng)疫苗直接注射抗原蛋白來激發(fā)宿主的免疫反應(yīng)，mRNA疫苗則是通過引入編碼特定疾病抗原的mRNA，使得宿主細(xì)胞能夠自行產(chǎn)生抗原，并進(jìn)而引發(fā)免疫反應(yīng)［31］。近年，Moderna公司宣布正在開發(fā)一種名為mRNA-4359針對(duì)癌癥的疫苗。這種mRNA疫苗能表達(dá)吲哚胺二氧酶和細(xì)胞程序性死亡配體-1（programmed cell death ligand-1，PD-L1）兩種抗原，目的是刺激效應(yīng)T細(xì)胞，使T細(xì)胞靶向定位并殺死表達(dá)這些抗原的細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞和免疫抑制性的細(xì)胞。有研究證明mRNA疫苗上調(diào)了效應(yīng)T細(xì)胞上的檢查點(diǎn)分子程序性死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-1）及其配體PD-L1在腫瘤細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞上的表達(dá)［32-33］，由于PD-1∕PD-L1檢查點(diǎn)通路主要由干擾素r （Interferon Gamma，INF-r）介導(dǎo)，也可由1型IFN反應(yīng)誘導(dǎo)，這為 mRNA疫苗與PD-1檢查點(diǎn)抑制劑治療相結(jié)合提供了可能。越來越多的研究表明，mRNA疫苗與檢查點(diǎn)抑制劑結(jié)合，所誘發(fā)的T細(xì)胞反應(yīng)和抗腫瘤效應(yīng)明顯增強(qiáng)［14，34］。BioNTech公司基于mRNA的個(gè)體化新生抗原特異性癌癥疫苗（individualized neoantigen-specific immunotherapy，iNeST）autogene cevumeran與PD-L1抗體Atezolizuab和mFOLFIRINOX化療連用，在接受手術(shù)切除治療胰腺癌患者的1期臨床試驗(yàn)中取得了安全性和耐受性研究成果，在臨床相關(guān)的時(shí)間框架內(nèi)，通過分析每個(gè)患者的腫瘤來指導(dǎo)個(gè)體化疫苗設(shè)計(jì)和按需生產(chǎn)iNeST的可行性得到了證實(shí)。該試驗(yàn)的初步結(jié)果顯示了autogene cevumeran良好的安全性及臨床獲益。

在腫瘤免疫領(lǐng)域，特別是以mRNA為基礎(chǔ)的DC疫苗。目前，將mRNA轉(zhuǎn)染到DC中進(jìn)行過繼轉(zhuǎn)移是第一個(gè)基于mRNA的治療性癌癥疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)［35］。盡管在臨床試驗(yàn)中，基于DC的mRNA疫苗療法仍然占大多數(shù)mRNA癌癥疫苗。有研究將編碼抗原的 IVT mRNA區(qū)域與雙鏈siRNA組合雜交，稱為ChriST mRNA，ChriST mRNA可以同時(shí)表達(dá)腫瘤抗原和誘導(dǎo)免疫抑制蛋白STAT3基因沉默，以增強(qiáng)抗腫瘤免疫作用，研究結(jié)果證明ChrisT mRNA可以促進(jìn)DC成熟，增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫應(yīng)答［22］。

此外，mRNA藥物可根據(jù)個(gè)人突變基因檢測，構(gòu)建個(gè)性化IVT mRNA疫苗，一項(xiàng)人體實(shí)驗(yàn)證明了這種方法治療晚期黑色素瘤的可行性和安全性，即所有接種疫苗的患者都產(chǎn)生了所選抗原的CD4和CD8 T細(xì)胞應(yīng)答，且有客觀的抗腫瘤反應(yīng)［36］。而且可通過多種方式增強(qiáng)抗腫瘤免疫，增加編碼細(xì)胞因子或共刺激因子mRNA，提高IVTmRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，以優(yōu)化樹突狀細(xì)胞對(duì)其在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染能力，增強(qiáng)主要組織相容性復(fù)合體I類（major histocompatibility complex class I，MHCI）和主要組織相容性復(fù)合體II類（major histocompatibility complex class II，MHCII）分子對(duì)mRNA編碼抗原的呈遞能力［37］。IVT mRNA疫苗需要充分的免疫刺激來調(diào)節(jié)抗原表達(dá)，多種研究證明給予額外的佐劑可發(fā)揮免疫刺激作用［38-39］，然而，由于IVT mRNA的特性及向細(xì)胞內(nèi)傳遞過程的影響，已經(jīng)有幾項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)IVT mRNA的免疫刺激在人類的作用正在消退［40］。

當(dāng)前，RNA在疫苗開發(fā)中的初步應(yīng)用仍存在一些局限性。一方面，裸mRNA被細(xì)胞外RNA酶快速降解，并且不能被抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）有效轉(zhuǎn)化。其次，mRNA具有三聯(lián)體免疫原性，可以激活下游干擾素相關(guān)通路，誘導(dǎo)天然免疫。固有免疫反應(yīng)通常由宿主免疫系統(tǒng)通過模式識(shí)別受體檢測外源性基序病原體相關(guān)分子模式激活［41］，盡管這種固有的免疫原性可以輔佐來增強(qiáng)免疫反應(yīng)，但它矛盾地促進(jìn)了mRNA降解，減少了抗原表達(dá)。另一方面，IVT過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)主要是dsRNA，將增強(qiáng)固有免疫的激活，進(jìn)一步限制mRNA翻譯。因此，提高mRNA翻譯效率以及克服固有免疫原性還需要進(jìn)一步探究。

到目前為止，mRNA疫苗已被應(yīng)用于治療侵襲性、不易獲得性和轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤。在大多數(shù)臨床試驗(yàn)中，mRNA癌癥疫苗與檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子進(jìn)一步結(jié)合，以增強(qiáng)抗腫瘤療效。盡管SAMs由于其固有的自擴(kuò)增特性是一種有吸引力的基于mRNA的替代疫苗，但癌癥應(yīng)用的臨床研究僅限于病毒復(fù)制選擇性病毒的早期評(píng)估。隨著癌癥免疫治療的最新進(jìn)展，特別是新抗原的發(fā)現(xiàn)、個(gè)性化疫苗的開發(fā)和檢查點(diǎn)阻斷調(diào)節(jié)器的開發(fā)，已經(jīng)進(jìn)行了許多改進(jìn)，以提高mRNA疫苗對(duì)抗癌癥的可行性［42］。自美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)六種檢查點(diǎn)阻斷調(diào)節(jié)劑和兩種嵌合抗原受體-T細(xì)胞免疫療法以來，癌癥免疫療法受到了極大關(guān)注［43］。除了在癌癥疫苗中的這些初步成功嘗試以外，目前有四種針對(duì)個(gè)體特異性的癌癥疫苗，分別是腫瘤或免疫細(xì)胞疫苗、肽疫苗、病毒載體疫苗和核酸疫苗正在臨床試驗(yàn)中被評(píng)估與檢查點(diǎn)阻斷調(diào)節(jié)劑或細(xì)胞因子療法相結(jié)合，在多發(fā)性實(shí)體瘤或浸潤性腫瘤中具有一些有希望的臨床反應(yīng)［44］。

3 展望

mRNA藥物的優(yōu)勢越來越明顯，制備過程不斷優(yōu)化，傳遞方式的不斷改進(jìn)，不僅顯著增強(qiáng)了mRNA藥物的翻譯效率，同時(shí)避免降低了免疫原性，不引起過度的免疫刺激。以mRNA為基礎(chǔ)的疫苗在腫瘤、傳染病及過敏性疾病的研究中取得的結(jié)果顯示出廣闊的前景，尤其是在腫瘤免疫治療領(lǐng)域，mRNA疫苗與檢查點(diǎn)抑制劑結(jié)合的效果可顯著增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)。目前已有多項(xiàng)研究將體外轉(zhuǎn)錄mRNA注射入實(shí)體腫瘤，使其能在腫瘤細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子，在腫瘤局部形成持久高濃度細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤-免疫循環(huán)的發(fā)生，增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)在抗腫瘤免疫能力。然而，目前mRNA藥物最大的挑戰(zhàn)仍在于進(jìn)一步提高體內(nèi)傳遞效率及降低免疫原性，mRNA藥物從基礎(chǔ)向臨床轉(zhuǎn)化仍需不斷研究進(jìn)步。