應(yīng)用于骨組織工程的海洋來(lái)源天然活性物質(zhì)的研究進(jìn)展

趙啟航 呂娜珺 郭慶圓

【提要】 海洋中蘊(yùn)藏著各種各樣的生物活性物質(zhì)，地球上約有80%的生物活性物質(zhì)存在于海洋，開(kāi)發(fā)來(lái)源于海洋的藥物和材料極具潛力。海洋來(lái)源的活性物質(zhì)主要包括生物信息物質(zhì)、生物生理活性物質(zhì)、海洋生物毒素及生物功能材料等。本文簡(jiǎn)要介紹了在骨組織工程領(lǐng)域有研究開(kāi)發(fā)前景的海洋活性物質(zhì)的若干進(jìn)展。

骨骼是一個(gè)動(dòng)態(tài)的可自我修復(fù)器官，持續(xù)性的骨重塑可確保骨骼結(jié)構(gòu)和功能隨時(shí)間遷移而逐漸恢復(fù)，但骨的自愈性重建無(wú)法修復(fù)大型創(chuàng)傷性損傷。因此，需要手術(shù)干預(yù)和使用骨的替代物。骨組織工程的目的是修復(fù)和再生組織，并將骨移植物作為骨替代物進(jìn)行工程化。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，海洋類的天然或合成聚合物被用于開(kāi)發(fā)具有低毒性和環(huán)保型的生物材料。海洋中蘊(yùn)藏著各種各樣的生物活性物質(zhì)，地球上約有80%的生物活性物質(zhì)存在于海洋，開(kāi)發(fā)來(lái)源于海洋的藥物和材料極具潛力[1-2]。海洋來(lái)源的活性物質(zhì)主要包括生物信息物質(zhì)、生物生理活性物質(zhì)、海洋生物毒素及生物功能材料等[3]。其中，海洋來(lái)源的天然聚合物具有較高的生物相容性、良好的生物降解性和無(wú)毒性[2]。到目前為止，膠原、殼聚糖、海藻酸鹽以及牡蠣殼等活性成分已被單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用于骨組織工程研究中。這些聚合物已被用作支架、水凝膠和微納米球。海洋來(lái)源的聚合物與生長(zhǎng)因子的功能化增加了聚合物骨再生的潛力[4]。

海洋來(lái)源的活性物質(zhì)是一類天然的高分子材料，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。由于海洋來(lái)源的活性物質(zhì)所構(gòu)成的材料與其他普通材料相比具有更突出的優(yōu)勢(shì)，且大量的體內(nèi)外研究均證明了來(lái)自海洋的活性物質(zhì)能夠促進(jìn)骨再生[5]。利用生物活性物質(zhì)的優(yōu)良特性可制造性能優(yōu)于自體骨移植和異體骨移植材料的可再生新型材料[6]。

目前，矯形外科、口腔外科、神經(jīng)外科、頜面外科等都需要應(yīng)用骨植入技術(shù)來(lái)解決臨床問(wèn)題。先前的研究顯示，使用骨移植物替代術(shù)已經(jīng)取得了突破性的進(jìn)展，但大多數(shù)骨粉依然來(lái)源于尸體捐贈(zèng)者[7]，而現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)海洋來(lái)源的活性物質(zhì)植入物引起的排斥反應(yīng)很低，而且很少有并發(fā)癥。本文對(duì)骨組織工程領(lǐng)域有研究開(kāi)發(fā)前景的海洋活性物質(zhì)的若干研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 殼聚糖

1.1 殼聚糖的來(lái)源

從海洋生物中提取的天然物質(zhì)殼聚糖，具有低成本和生態(tài)環(huán)保的效益，是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一與細(xì)胞外基質(zhì)多糖外殼化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的天然陽(yáng)離子多聚糖[8]。殼聚糖憑借其優(yōu)良的生物特性（極好的生物相容性、環(huán)境友好性、優(yōu)良的溶解性、低成本和極高的生物學(xué)活性）被廣泛應(yīng)用于各個(gè)行業(yè)。

海洋材料殼聚糖是甲殼素中的一類去乙酰化多糖成分，而甲殼素是一種主要存在于海洋甲殼類動(dòng)物生物外殼和真菌細(xì)胞壁中的天然活性聚合物。在去乙酰化后，亮聚糖可以很容易地與DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或帶負(fù)電荷的合成聚合物相互作用[9]。殼聚糖的特性不僅可以提高其在機(jī)體內(nèi)的溶解度、生物降解性和生物相容性，而且能直接促進(jìn)殼聚糖材料的黏附、止血和抗菌性能。加上殼聚糖成本低廉，在生物制藥和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛研究和應(yīng)用了數(shù)十年，并且天然化合物比合成化合物有一些顯著的優(yōu)勢(shì)，如愈合更快，與人體親和性更高。由于天然化合物不表現(xiàn)出疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)和免疫排斥反應(yīng)，可以低成本替代肌肉組織和骨組織。因此，殼聚糖在骨組織工程領(lǐng)域顯示出了良好的潛力[10]。

1.2 殼聚糖在骨組織工程的應(yīng)用和優(yōu)勢(shì)

在骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)研究中，骨生物支架能否成功應(yīng)用很大程度上取決于生物支架的性能，包括要求生物材料必須有良好的生物溶解性、高度生物相容性、較高孔隙率，且具備一定的早期機(jī)械穩(wěn)定性和早期骨引導(dǎo)性等，這也是骨組織工程中生物支架應(yīng)該滿足的最基本要求[11]。

殼聚糖生物骨支架已被證明可以促進(jìn)血管壁的發(fā)育和骨基質(zhì)礦化物的沉積[12]。人成骨細(xì)胞可在支架的天然粗孔徑和密集孔隙的引導(dǎo)下，在支架表面甚至內(nèi)部黏附生長(zhǎng)和定殖。實(shí)驗(yàn)證明，殼聚糖支架填充的牙窩牙槽骨密度比未經(jīng)治療的牙窩要高[9]。

大量的體內(nèi)外研究證明，殼聚糖基支架在骨工程方面具有生理惰性和低毒性[13]。此外，以殼聚糖為基礎(chǔ)的材料應(yīng)用于人體后，沒(méi)有產(chǎn)生過(guò)敏和炎癥反應(yīng)。

殼聚糖的生物降解性和生物相容性使其適合作為一種生物材料和硬組織再生的支架。

1.3 殼聚糖在骨組織中應(yīng)用中的局限性

殼聚糖與人體內(nèi)各類細(xì)胞的相互作用，以及這種作用對(duì)成骨細(xì)胞的功能或活性的影響還有待進(jìn)一步的深入研究[15]。盡管殼聚糖及其降解產(chǎn)物完全不具有抗原性，也不會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)抗體，但這種海洋活性物質(zhì)植入人體后可能會(huì)激活人體其他免疫系統(tǒng)（如免疫細(xì)胞）而產(chǎn)生不同程度的排斥反應(yīng)，這些都需要進(jìn)行更深入的研究[16]。

1.4 關(guān)于殼聚糖的未來(lái)展望

將天然活性物質(zhì)殼聚糖與其他天然或合成聚合物混合形成的生物材料，可以有效地控制生物復(fù)合支架的孔隙率和保水性，降低其生物降解率，增強(qiáng)骨支架生物活性和生物相容性，借此提高骨支架的機(jī)械性能。這種骨組織復(fù)合支架不僅沒(méi)有細(xì)胞毒性，更能促進(jìn)細(xì)胞的附著和增殖，從而進(jìn)行組織修復(fù)。相信在不久的未來(lái)會(huì)有更多的學(xué)者進(jìn)行復(fù)合支架的研究，使之更好地應(yīng)用于臨床。

2 海藻酸鹽

2.1 海藻酸鹽的介紹

海藻酸鹽主要是從海洋生物褐藻類中提取出的高分子天然聚合物，分子式是由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic，M）和α-L-古洛糖醛酸（α-L-guluronic，G）連接而成。海藻酸鹽因其優(yōu)越的生物相容性和與水的高黏性，被廣泛用于食品的凝固劑、牙科取模劑、骨再生支架，增稠類仿生材料和影像材料中[17]。近年來(lái)，海洋活性物質(zhì)海藻酸鹽在骨組織工程研究中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)并引起重視，逐漸成為骨組織工程新材料研發(fā)的焦點(diǎn)。

2.2 海藻酸鹽在骨組織工程方面的應(yīng)用和優(yōu)勢(shì)

2.2.1 海藻酸鹽水凝膠

海藻酸鹽成為骨組織工程支架材料，必須先形成水凝膠或生物支架。海藻酸鹽形成水凝膠的方式主要有兩種：離子成膠和光交聯(lián)成膠[18]。海藻酸鹽自身含有大量的羧基，在純水溶液中可以出現(xiàn)聚陽(yáng)離子的行為，因此在較溫和的條件下能與多價(jià)陽(yáng)離子發(fā)生反應(yīng)迅速形成水凝膠；也可以通過(guò)化學(xué)合成的途徑，引入帶有碳碳雙鍵的小分子有機(jī)化合物（如2-氨乙基甲基丙烯酸酯鹽酸鹽），再通過(guò)長(zhǎng)波紫外線光交聯(lián)形成水凝膠[19]。這兩種成水凝膠的方式是目前最常見(jiàn)的，凝膠形成需要的條件溫和，也要避免被一些藥物、蛋白質(zhì)、細(xì)胞和酶等活性物質(zhì)降解造成失活[20]。海藻酸鹽水凝膠由于綠色無(wú)污染，與機(jī)體相容性良好、可塑性高，凝固性能優(yōu)越、來(lái)源廣泛等，可以為細(xì)胞和生長(zhǎng)因子提供完整且優(yōu)良載體，從而被用于骨組織工程的研究[21]。

2.2.2 藻酸鹽成骨再生支架

支架對(duì)于骨組織工程至關(guān)重要，可顯著影響種子細(xì)胞的行為[22]。另外，由先天性畸形、創(chuàng)傷、腫瘤、炎癥引起的頜面骨缺損會(huì)導(dǎo)致明顯的美學(xué)畸形，以及口腔、上頜面肌的功能障礙[15]。骨移植支架作為骨組織工程再生技術(shù)的基礎(chǔ)，因其損傷低、來(lái)源好、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越受歡迎。天然衍生的聚合物，由于其生物相容性和生物降解性，易于在幾何圖形中迅速成型，可以支持細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，具有應(yīng)用于骨組織工程的潛力[23]。

海藻酸鹽是可降解性質(zhì)聚合物，由月桂酸和甘露糖酸組成[24]，廣泛應(yīng)用于生長(zhǎng)因子傳遞、細(xì)胞包封和骨丟失或失效的多孔支架等方面[25]。冷凍干燥法可方便地制備多孔海藻酸鹽支架。

2.3 海藻酸鹽在骨組織工程應(yīng)用中的局限性

海藻酸鹽水凝膠，無(wú)論是陽(yáng)離子成膠法還是光交聯(lián)成膠法，都存在機(jī)械強(qiáng)度低或者成骨誘導(dǎo)能力差的問(wèn)題[17]。研究發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)引入與成骨相關(guān)的陽(yáng)離子，或引入成骨相關(guān)生長(zhǎng)因子，或作為基因傳遞的載體[26]，也可與其他的骨組織工程材料聯(lián)合制備形成新型復(fù)合材料，來(lái)提高海藻酸鹽水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度或成骨性能[19]。

2.4 關(guān)于海藻酸鹽的未來(lái)展望

未來(lái)可以通過(guò)升級(jí)骨再生支架的制作工藝和制造方法，制備出用途更廣泛、臨床實(shí)用性更好的海藻酸鹽成骨支架。海藻酸鹽應(yīng)用于骨組織工程只有十幾年，未來(lái)要對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行更深入研究，成骨支架也有待于深度開(kāi)發(fā)。海洋來(lái)源的海藻酸鹽如果作為藥物載體類材料，相關(guān)研究還需不斷深入和完善[27]。

3 海洋類膠原

3.1 海洋類膠原的介紹

膠原蛋白一直是應(yīng)用最廣泛的生物材料之一，具有多種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。最近，從海洋魚(yú)類的皮膚、鱗片、鰭和廢物中分離出天然的海洋蛋白，在魚(yú)的皮膚和肌肉結(jié)締組織中，獲得Ⅰ型和Ⅴ型膠原蛋白，具有非常好的生物相容性、生物降解性、穩(wěn)定性、安全性，易獲取且無(wú)抗原性。各種各樣的海洋膠原蛋白基支架已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)用于骨組織工程[28]。

研究證明，陸地生物中獲得的膠原蛋白存在傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)，并導(dǎo)致不良的免疫反應(yīng)，如牛海綿狀腦病[29]。海洋膠原蛋白沒(méi)有傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)。海洋來(lái)源的膠原蛋白可以在骨組織工程中作為支架材料[30]。膠原易于加工，又能與其他生物材料結(jié)合，提高成骨性能[31]。膠原蛋白的多肽主干上的功能團(tuán)可以與生長(zhǎng)因子、基因和治療性生物分子相結(jié)合[32]。

3.2 海洋類膠原在骨組織工程的應(yīng)用和優(yōu)勢(shì)

膠原蛋白可以被制成海綿，Ⅰ型膠原蛋白制備的海綿能招募血小板并發(fā)揮物理作用，具有良好的止血作用[32]。膠原蛋白敷料也用于組織修復(fù)；膠原蛋白的生物膜也被證明可以加速皮膚組織的修復(fù)。結(jié)合了藍(lán)鯊膠原蛋白、殼聚糖和HA 的復(fù)合支架可以解決細(xì)胞播種低效率、分解產(chǎn)物具有細(xì)胞毒性等問(wèn)題。海洋類膠原已經(jīng)應(yīng)用于醫(yī)療、食品材料、飼料工業(yè)、化妝品等各個(gè)行業(yè)。

基于海洋膠原蛋白支架的力學(xué)特性，由魚(yú)膠原蛋白制備的復(fù)合支架具有高剛性、低生物降解率、良好的生物相容性和成骨性能[34-35]。此外，膠原蛋白也被證明可以上調(diào)成骨mRNA 和蛋白的表達(dá)[36]。研究發(fā)現(xiàn)，羥基磷灰石與膠原蛋白結(jié)合可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[37]。使用地塞米松膠原支架可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外成骨分化。通過(guò)膠原/羥基磷灰石復(fù)合材料傳遞神經(jīng)生長(zhǎng)因子β（NGF-β）可增加大鼠的新骨生長(zhǎng)[38]。膠原蛋白在骨再生中具有巨大的潛力。在臨床試驗(yàn)中，膠原蛋白是一種用于骨組織修復(fù)和再生的重要聚合物，在新骨形成方面顯示出了良好的結(jié)果[39]。

3.3 海洋類膠原在骨組織應(yīng)用中的局限性

當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)是如何找到合適的膠原，以及膠原的提取和純化。

3.4 關(guān)于海洋類膠原的未來(lái)展望

海洋類膠原蛋白在骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用仍處于起步階段，需要在這一領(lǐng)域進(jìn)行更多的研究，以深入了解細(xì)胞反應(yīng)和海洋膠原支架的動(dòng)態(tài)行為，從而充分發(fā)揮海洋膠原在骨組織工程中的應(yīng)用潛力。

4 牡蠣殼

4.1 牡蠣殼作為生物材料的可行性

牡蠣養(yǎng)殖是最發(fā)達(dá)的水產(chǎn)養(yǎng)殖活動(dòng)之一，研究發(fā)現(xiàn)牡蠣殼可用于骨組織工程研究[40]。牡蠣殼復(fù)合型骨材料橫斷面為同心圓，排列成致密的骨板樣結(jié)構(gòu)，厚度200～300 nm，與人體骨板、哈佛氏管、浮克曼管的數(shù)量、密度、形狀、孔徑及走向規(guī)律相類似[41]。不同種類的牡蠣全世界年產(chǎn)量在80 萬(wàn)噸以上，來(lái)源豐富，含有豐富的微量元素和大量的氨基酸，擁有極高的皮質(zhì)骨替代潛能[42]。

4.2 牡蠣殼在骨組織工程中的應(yīng)用和優(yōu)勢(shì)

牡蠣殼納米顆粒的形成過(guò)程與人類骨沉積過(guò)程基本類似[43]，同時(shí)，牡蠣殼具有良好的生物相容性、生物降解性、優(yōu)良骨傳導(dǎo)性及良好的成骨性能[44]。研究證明，復(fù)方牡蠣殼鈣劑在動(dòng)物體內(nèi)吸收速率，利用率比普通西藥和陸地生物鈣劑要高得多。實(shí)驗(yàn)用排液法測(cè)得的牡蠣殼材料孔隙率高達(dá)40%～50%，牡蠣殼的多孔結(jié)構(gòu)形成的三維通道增大了自身與受植區(qū)組織器官的接觸面積，有利于加速界面的結(jié)合過(guò)程[45]，為新骨組織長(zhǎng)入提供足夠的通道和容納區(qū)域，并為骨誘導(dǎo)所需物質(zhì)提供空間，加之孔隙相通使新生成的骨組織從材料的表面進(jìn)入材料內(nèi)部更容易，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定[46]。該材料可根據(jù)需要，通過(guò)預(yù)先定制或注塑等方式來(lái)成形[47]，方便操作，植入后可為缺損區(qū)組織提供足夠的硬組織保護(hù)[48]。

4.3 牡蠣殼在骨組織應(yīng)用中的局限性

當(dāng)前，專門針對(duì)牡蠣殼分離培養(yǎng)的新技術(shù)比較有限[49]，牡蠣離開(kāi)海洋后的成活率也比較低，能提取的生物類型比較少[50]。

4.4 關(guān)于牡蠣殼未來(lái)展望

牡蠣殼來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，成本幾乎是零。對(duì)牡蠣殼進(jìn)行醫(yī)學(xué)類研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣殼中含有大量的活性鈣，是骨骼、牙齒發(fā)育必不可少的組成成分，未來(lái)可將其開(kāi)發(fā)成補(bǔ)鈣劑和骨支架，解決骨缺損和骨質(zhì)疏松的問(wèn)題。

5 海洋來(lái)源的活性物質(zhì)的優(yōu)勢(shì)和局限性

目前，已被研究利用的海洋生物種類有兩千多種，其數(shù)量雖不敵傳統(tǒng)的陸地生物，但就成骨活性來(lái)說(shuō)，海洋來(lái)源的活性物質(zhì)具有明顯的活性穩(wěn)定性和成骨分化高效性。其次，海洋活性物質(zhì)毒副作用也低于人工合成的傳統(tǒng)活性物質(zhì)。另有文獻(xiàn)證明，在極端惡劣環(huán)境下，海洋生物群具有極強(qiáng)的適應(yīng)環(huán)境的能力，能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)特異、性質(zhì)特殊的寶貴的海洋生物活性物質(zhì)。海洋來(lái)源的活性物質(zhì)具有生物相容性更高、毒性更小、分布廣泛、造價(jià)便宜等優(yōu)勢(shì)。但是，海洋活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)也存在一些亟待解決的問(wèn)題：①海洋天然生物中的活性物質(zhì)的相關(guān)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制依然需深入研究，來(lái)確保絕對(duì)安全性[52]；②許多海洋活性物質(zhì)在海洋生物體內(nèi)的含量較低，提取不易，需要大量的人力物力，且難以工業(yè)化生產(chǎn)。

6 總結(jié)

本文對(duì)近幾年來(lái)不同的海洋活性物質(zhì)構(gòu)成的材料、處理工藝以及成骨效能進(jìn)行了較為全面的總結(jié)[53]。殼聚糖生物材料機(jī)械效能低、彈性模量差和引發(fā)的炎癥問(wèn)題仍需進(jìn)行改善[54]；以此制備的骨再生支架也存在力學(xué)性能不佳的問(wèn)題[57]。海藻酸鹽生物支架及水凝膜的遠(yuǎn)期效果仍需臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用觀察和驗(yàn)證，該類骨支架脆性大、易斷裂，硬度又不足，因此今后的研究應(yīng)主要聚焦于對(duì)其性能的優(yōu)化[58]。牡蠣殼生物材料與骨組織的沉積方式最為接近，但其機(jī)械強(qiáng)度和成骨機(jī)制仍需進(jìn)一步研究[59]。海洋來(lái)源的膠原物質(zhì)材料提取率低，通過(guò)改良新的提取技術(shù)和辦法，將多種處理方法有機(jī)結(jié)合起來(lái)[60]，開(kāi)發(fā)新型的復(fù)合結(jié)構(gòu)的骨組織工程支架才是更有實(shí)用價(jià)值的研究方向。