錦鯉皮膚中類胡蘿卜素和蝶啶色素總量的測(cè)定方法

王春波，田 雪＊

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007）

體色是長(zhǎng)期自然選擇的結(jié)果，并在動(dòng)物的集群行為、繁殖、獲利、回避和識(shí)別等方面發(fā)揮重要作用[1]。隨著研究的不斷深入，人們對(duì)體色合成的主要調(diào)控機(jī)制及其相關(guān)信號(hào)通路有了更加深刻的認(rèn)識(shí)。在脊椎動(dòng)物中，除黑色素合成信號(hào)通路和蝶啶通路的研究外，類胡蘿卜素對(duì)動(dòng)物體色的影響也受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注[2]。家蠶、鳥(niǎo)類和爬行動(dòng)物的研究證實(shí)，動(dòng)物體表的紅色（包括橙色、黃色等漸變色）主要由類胡蘿卜素、蝶啶色素單獨(dú)或共同決定。魚(yú)類體表的紅色色素主要包括類胡蘿卜素和蝶啶色素，二者均可產(chǎn)生紅色、粉色、橙色、黃色和白色等一系列顏色[3]。類胡蘿卜素普遍存在于水產(chǎn)動(dòng)物皮膚、鰭條、鱗片、肌肉以及肝臟中，是魚(yú)類體色和肌肉顏色的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，在動(dòng)物的擇偶、交流、抗氧化等過(guò)程中具有重要作用[4]。蝶啶代謝通路調(diào)控蝶啶色素合成，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要作用。魚(yú)類中，蝶啶代謝通路以三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP) 為底物，通過(guò)GTP環(huán)化水解酶(GTP cyclohydrolase，GCH)、6-丙酮酰四氫蝶呤合酶（6-PTPS）和墨蝶呤還原酶（SPR）等一系列酶促反應(yīng)，最終合成黃色或橙紅的蝶啶類色素，從而參與魚(yú)類體色的形成[5]。

錦鯉 （Cyprinus carpio L.）屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科（Cyprinidae）、鯉屬（Cyprinus），是風(fēng)靡當(dāng)今世界的一種體型較大的觀賞魚(yú)類，有“水中活寶石”“會(huì)游泳的藝術(shù)品”的美稱，具有很高的經(jīng)濟(jì)和飼養(yǎng)價(jià)值。錦鯉現(xiàn)有純紅、純白、紅白、大正三色和昭和三色等十三大品系，體色豐富，圖案千變?nèi)f化，是魚(yú)類體色研究的良好材料[6]。現(xiàn)今，關(guān)于鯉科魚(yú)類種屬間系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和錦鯉遺傳多樣性的研究較多，但對(duì)于錦鯉皮膚色素成分的研究較少[7]。因此，本文以純紅和純白錦鯉為材料，對(duì)錦鯉皮膚色素成分進(jìn)行鑒定與分析，旨在探討錦鯉色素組成與體色的關(guān)系，為錦鯉體色的遺傳變異研究提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用錦鯉來(lái)自河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院培育的F3純紅和純白錦鯉家系。丁香酚麻醉后，對(duì)純紅和純白錦鯉側(cè)線鱗上方和下方帶鱗片的皮膚組織進(jìn)行取樣，隨后放入液氮中速凍，放于-80℃冰箱保存。

1.2 錦鯉體表組織中類胡蘿卜素和蝶啶色素的提取

總類胡蘿卜素和蝶啶色素提取方法如下：取1 g左右錦鯉帶鱗片的皮膚組織，放入2 ml EP管中，充分剪碎后加入1 ml丙酮。研磨均勻后，4℃8000 rpm/min離心5 min收集上清，重復(fù)上述過(guò)程三次，收集上清，氮吹儀吹干后，1 ml正己烷溶液重新溶解后測(cè)定吸光值?？傤惡}卜素的測(cè)定波長(zhǎng)為447 nm，空白對(duì)照組為正己烷溶液，消光系數(shù)為2500。向提取后的皮膚殘留物中加入1.5 ml pH=2.0的30%酸化乙醇，間歇研磨1 h，4℃8000 rpm/min離心5 min收集上清測(cè)定吸光值。該方法提取的蝶啶色素為蝶呤色素1。蝶啶色素的測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm，空白對(duì)照組為pH=2.0的30%酸化乙醇溶液，消光系數(shù)為25100。

葉黃素和蝶啶色素提取方法如下：取1 g左右錦鯉帶鱗片的皮膚組織，放入2 ml EP管中，充分剪碎后加入1 ml甲基叔丁基醚（MTBE），研磨均勻后4 ℃8000 rpm/min離心5 min，重復(fù)上述步驟四次。收集上清，氮吹儀吹干后，加入1 ml MTBE重新溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值，該方法提取的類胡蘿卜素主要是葉黃素。葉黃素的測(cè)定波長(zhǎng)為447 nm，空白對(duì)照組為MTBE，消光系數(shù)為2550。向提取后的皮膚殘留物中加 入1 ml 1%的NH4OH 溶 液，研 磨2 min，4℃，8000 rpm/min離心5 min，重復(fù)該步驟一次。收集上清測(cè)定吸光值。該方法提取的蝶啶色素主要為蝶呤色素2，測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm，空白對(duì)照組為1%的NH4OH溶液，消光系數(shù)為10000。

按如下公式計(jì)算提取的相關(guān)色素含量：C (mg/kg) =A×K×V /(E×G)

其中C為類胡蘿卜素或蝶啶色素含量（mg/kg），A為吸光值，K為常數(shù)，V為提取液體積 （ml），E為摩爾消光系數(shù)，G為樣品重量（g）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

SPSS 16.0進(jìn)行One-Way ANOVA方法的LSD和Duncan氏比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean ± SE)表示，P＜0.05代表顯著相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 純紅、純白錦鯉側(cè)線鱗上方皮膚組織中類胡蘿卜素和蝶啶色素含量

如圖1所示，純紅錦鯉側(cè)線鱗上方體表組織中總類胡蘿卜素（0.264±0.073 mg/kg）和葉黃素（0.494±0.073 mg/kg）的含量均顯著高于純白錦鯉側(cè)線鱗上方體表組織的總類胡蘿卜素（0.130±0.015 mg/kg）和葉黃素（0.161±0.014 mg/kg）的含量（P＜0.05）。果蠅蝶呤1在純紅和純白錦鯉側(cè)線鱗下方皮膚組織的含量分別為（0.015±0.002 mg/kg）和（0.015±0.002 mg/kg），果蠅蝶呤2在純紅和純白錦鯉側(cè)線鱗下方皮膚組織的 含 量 分 別 為 （0.091±0.002）mg/kg 和 （0.087±0.006 mg/kg），這兩種方法提取的蝶啶色素在兩種體色間沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

圖1 純紅和純白錦鯉側(cè)線鱗上方皮膚組織總類胡蘿卜素、葉黃素和蝶啶色素的含量比較

2.2 純紅、純白錦鯉側(cè)線鱗下方皮膚組織中類胡蘿卜素和蝶啶色素含量

如圖2所示，純紅錦鯉側(cè)線鱗下方皮膚組織中總類胡蘿卜素 （0.354±0.075 mg/kg）、葉黃素 （0.596±0.131 mg/kg）和果蠅蝶呤2（0.126±0.004mg/kg）的含量均顯著高于純白錦鯉側(cè)線鱗下方皮膚組織的總類胡蘿卜素（0.088±0.004 mg/kg）、葉黃素（0.172±0.050 mg/kg）和果蠅蝶呤2（0.076±0.010 mg/kg）的含量（P＜0.05）。果蠅蝶呤1在純紅和純白錦鯉側(cè)線鱗下方皮膚組織的含量分別為（0.026±0.007 mg/kg）和（0.024±0.003 mg/kg），在兩種體色間沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

圖2 純紅和純白錦鯉側(cè)線鱗下方皮膚組織總類胡蘿卜素、葉黃素和蝶啶色素的含量比較

3 討論

蝶啶是一種動(dòng)物色素的總稱，是由嘧啶和吡嗪環(huán)組成的芳香化合物[8]。蝶啶色素可由動(dòng)物自身合成，可分為有色蝶啶與無(wú)色蝶啶。有色蝶啶包括墨蝶呤和果蠅蝶呤，其中墨蝶呤顯黃色，果蠅蝶呤顯紅色；而無(wú)色蝶啶為生物蝶呤[5]。正常黑腹果蠅眼色為紅褐色，由紅色的果蠅蝶呤和褐色的眼黃素2種色素構(gòu)成[10]。大多數(shù)蜥蜴的橙色/紅色體色也來(lái)自蝶啶色素[11]。

相對(duì)于蜥蜴等物種，大多數(shù)養(yǎng)殖魚(yú)類的體色主要源于類胡蘿卜素[3]。與蝶啶色素不同，魚(yú)類自身不能合成類胡蘿卜素，必須通過(guò)外源攝取。由于不同魚(yú)類對(duì)類胡蘿卜素的代謝能力不同，體內(nèi)起主要作用的類胡蘿卜素種類也具有一定的差異。錦鯉、金魚(yú)和紅鯉等大多數(shù)淡水魚(yú)，可將類胡蘿卜素（黃體素、玉米黃質(zhì)等）轉(zhuǎn)化形成蝦青素；而鮭鱒魚(yú)類缺乏對(duì)黃體素和玉米黃質(zhì)等類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化能力，可直接將類胡蘿卜素儲(chǔ)存在體內(nèi)[12]。目前，飼料添加含天然或人工合成的類胡蘿卜素改善魚(yú)類體色已成為水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。在飼料中添加富含紅色類胡蘿卜素的紅辣椒粉，可增強(qiáng)錦鯉體表著色、促進(jìn)生長(zhǎng)[13]。此外，光照條件也能夠影響錦鯉體內(nèi)類胡蘿卜素的分布，暗光條件下錦鯉皮膚和肌肉的類胡蘿卜素含量顯著低于亮光條件[14]。

目前，對(duì)魚(yú)類體表組織色素成分和含量的鑒定方法主要為分光光度計(jì)法、薄層色譜法和高效液相色譜法。關(guān)于蝶啶色素含量鑒定的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分光光度計(jì)法分別對(duì)純紅和純白錦鯉皮膚組織中不同區(qū)域的類胡蘿卜素和蝶啶色素含量進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純紅和純白錦鯉側(cè)線鱗上、下方皮膚組織中的色素差異主要以類胡蘿卜素為主，蝶啶色素在純紅和純白錦鯉側(cè)線鱗上方皮膚組織中無(wú)明顯差異，只有果蠅蝶呤2在純紅錦鯉側(cè)線鱗下方皮膚組織顯著高于純白錦鯉。以上結(jié)果可能說(shuō)明類胡蘿卜素和果蠅蝶呤2可能是造成錦鯉紅、白體色差異的關(guān)鍵色素成分。但具體是哪些類胡蘿卜素參與錦鯉體色的形成仍有待更加深入的研究和探索。