抗VEGF輔助治療增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變對(duì)眼內(nèi)炎癥因子水平的影響

羅金秀,胡仔仲,劉慶淮,方 圓

0 引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的主要并發(fā)癥之一。目前,全球約4.63億成年人患有糖尿病[1],而DR總體患病率接近糖尿病患病人群的35%[2]。DR早期階段為非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR),以眼底微動(dòng)脈瘤為主要特征,繼而發(fā)展為增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)。PDR的主要特征為眼底硬性及軟性滲出、新生血管和出血[3]。其中持續(xù)性玻璃體出血、廣泛性纖維血管增生或牽拉性視網(wǎng)膜脫離是玻璃體切除術(shù)(pars-plana vitrectomy,PPV)的適應(yīng)證。

高血糖代謝作用導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管損傷,引起血管通透性增加,視網(wǎng)膜缺血缺氧,促血管生成和炎癥因子隨之上調(diào),如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管生成素、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)和白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6等[4]。其中VEGF作為PDR的主要血管生成因子,其水平已被證明與PPV手術(shù)難度[5]以及PPV術(shù)后早期[6]或晚期玻璃體積血[7]的復(fù)發(fā)有關(guān)?？筕EGF治療可有效降低玻璃體腔VEGF水平,減少視網(wǎng)膜血管滲漏,促進(jìn)新生血管消退,從而減少PPV術(shù)中出血風(fēng)險(xiǎn),降低手術(shù)難度,有利于手術(shù)預(yù)后[8]。炎癥與視網(wǎng)膜新生血管亦密切相關(guān)。炎癥細(xì)胞在高糖環(huán)境中分泌生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及蛋白酶等,以介導(dǎo)新生血管形成[9]。激活的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)促炎因子,介導(dǎo)激活白細(xì)胞[10-11]。促炎細(xì)胞因子包括IL-6、IL-1α、IL-1β、TNF-α等可通過(guò)作用于內(nèi)皮細(xì)胞直接激活血管生成,還可通過(guò)激活白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生更多的促血管生成因子間接促進(jìn)血管生成。此外,PDR患者玻璃體中促炎細(xì)胞因子和趨化因子濃度顯著升高[12]。研究表明,PPV術(shù)前聯(lián)合抗VEGF注射后,眼內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)水平顯著快速下降[13]。然而,隨著VEGF-A水平的下降和新生血管的退化,炎癥因子在眼微環(huán)境中的變化仍不清楚。既往研究通常檢測(cè)抗VEGF治療后數(shù)周或數(shù)月眼內(nèi)炎癥因子的變化,但研究結(jié)果仍存在爭(zhēng)議[14-17]。本研究通過(guò)檢測(cè)玻璃體液炎癥因子水平,探討PPV術(shù)前聯(lián)合玻璃體腔注射康柏西普(intravitreal injection of Conbercept, IVC)早期對(duì)視網(wǎng)膜炎癥狀態(tài)的作用,為臨床治療提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究。收集2017-06/2018-01于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科就診并確診的PDR患者49例49眼為研究對(duì)象,隨機(jī)分為兩組,no-IVC組患者25例25眼PPV術(shù)前未接受玻璃體腔注射治療,IVC組患者24例24眼PPV術(shù)前接受玻璃體腔注射康柏西普治療。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡18歲以上;(2)根據(jù)2014年中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科學(xué)分會(huì)眼底病學(xué)組提出的DR分期方法[18]確診為PDR(Ⅳ～Ⅴ期);(3)符合PPV和玻璃體腔注射康柏西普治療適應(yīng)證。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)既往有內(nèi)眼手術(shù)史;(2)合并其他玻璃體視網(wǎng)膜疾病或合并眼前節(jié)新生血管;(3)臨床資料不全者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》,符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則并獲得南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.2017-SR-283)。所有患者均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)方法IVC組患者于PPV術(shù)前5～7d接受玻璃體腔注射康柏西普治療(其中PPV術(shù)前5、6、7d接受玻璃體腔注射治療者均為8例8眼)。IVC手術(shù)方法:常規(guī)內(nèi)眼手術(shù)消毒鋪單,表面麻醉后,將27G 1mL一次性無(wú)菌注射器于顳上方角鞏膜緣后4mm處穿刺入玻璃體腔注射康柏西普0.5mg/0.05mL(成都康弘生物科技有限公司,10mg/mL),拔出注射器后用棉簽按壓30～60s,觀察有無(wú)出血、切口滲漏,注藥后予左氧氟沙星滴眼液預(yù)防感染。PPV手術(shù)方法:由同一名資深眼科醫(yī)生完成所有患者的PPV手術(shù)。常規(guī)距角膜緣3.5～4.0mm扁平部行三通道23G穿刺,顳下方穿刺套管放置灌注。行23G閉合式后入路全玻璃體切除,如果出血?jiǎng)t采用玻切頭壓迫、提高灌注壓、眼內(nèi)電凝等方法, 對(duì)未處理的視網(wǎng)膜區(qū)域進(jìn)行激光光凝,以完成全視網(wǎng)膜光凝。如果出現(xiàn)視網(wǎng)膜裂孔,選擇硅油行眼內(nèi)填充,無(wú)視網(wǎng)膜裂孔則灌注液填充。術(shù)閉,可吸收縫線縫合鞏膜切口。

1.2.2 玻璃體液收集及細(xì)胞因子檢測(cè)納入患者均于PPV手術(shù)開始時(shí),即眼內(nèi)灌注開始前用玻璃體切割器收集0.5～0.8mL未稀釋的玻璃體液樣本。將樣品收集至無(wú)菌試管中,立即置于冰上,離心(4℃,1500r/min,5min)以去除細(xì)胞和碎片,然后于-80℃保存?zhèn)溆?。本研究檢測(cè)的細(xì)胞因子包括VEGF-A和炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17A、IL-18、TNF-α、單核細(xì)胞趨化因子(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)。利用Luminex液相懸浮芯片技術(shù),在Wayen生物技術(shù)公司(上海)的協(xié)助下完成以上細(xì)胞因子水平的檢測(cè)。所有步驟嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書操作,在96孔微孔板每孔上加50μL玻璃體液樣品或標(biāo)準(zhǔn)品,室溫孵育后用稀釋后的生物素抗體與樣品孵育,加入PE標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)一步孵育,再加入洗滌緩沖液,最后將平板送入Bio-Plex MAGPIX系統(tǒng)讀值。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基線資料比較no-IVC組和IVC組患者年齡、性別構(gòu)成、PDR類型、視力下降持續(xù)時(shí)間、糖尿病病程、術(shù)前視力、糖化血紅蛋白(HbA1c)水平和既往行全視網(wǎng)膜激光光凝情況比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 兩組患者基線資料比較

2.2 兩組患者玻璃體液細(xì)胞因子水平比較與no-IVC組相比,IVC組患者玻璃體液中VEGF-A水平顯著降低(P<0.001),炎癥細(xì)胞因子IL-6(P=0.004)、IL-8(P=0.002)、IL-18(P=0.04)、TNF-α(P=0.03)水平顯著升高,見表2。IVC組康柏西普注射后5、6、7d的患者玻璃體液中炎癥細(xì)胞因子水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表2 納入患者玻璃體液中細(xì)胞因子水平比較 pg/mL

表3 IVC組康柏西普注射后5～7d患者玻璃體液中細(xì)胞因子水平比較 pg/mL

3 討論

康柏西普是VEGF受體與人免疫球蛋白Fc段基因重組的融合蛋白,對(duì)VEGF-A、VEGF-B及胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)具有高度親和力,競(jìng)爭(zhēng)性抑制VEGF與其受體結(jié)合,從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖及新生血管生成[19]。PPV治療PDR術(shù)前抗VEGF治療的目的是誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管消退,減少術(shù)中出血,使纖維血管膜更易被剝離,減少醫(yī)源性視網(wǎng)膜裂孔,使PPV手術(shù)更順利[20]。本研究發(fā)現(xiàn),玻璃體腔注射康柏西普后玻璃體液中VEGF-A水平快速下降,但抗VEGF治療早期對(duì)多數(shù)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)影響甚微。

在DR中,視網(wǎng)膜缺血缺氧通過(guò)激活缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)誘導(dǎo)VEGF表達(dá)上調(diào)[21]。糖尿病患者外周血中磷脂酶A2(PLA2)升高也會(huì)引起VEGF表達(dá)上調(diào)[22]。VEGF通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞間緊密連接蛋白磷酸化,增加毛細(xì)血管通透性[23]。VEGF激活VEGFR-1和VEGFR-2兩種酪氨酸激酶受體,刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移,促進(jìn)新生血管形成[24]。這些血管分布不規(guī)則,血管結(jié)構(gòu)不良,易發(fā)生滲漏,導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)液體積聚。血管滲漏增加是糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)的嚴(yán)重危險(xiǎn)因素。因此,抗VEGF治療已成為DME的一線治療方案[25]。盡管如此,仍有部分DME患者對(duì)抗VEGF治療反應(yīng)不佳,這也說(shuō)明除VEGF外還有其他機(jī)制參與DR及DME的發(fā)生發(fā)展。慢性低度炎癥被證實(shí)存在于DR的各個(gè)階段[26]。炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A和TNF-α水平與DR的嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)[27]。PDR患者玻璃體中炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-17A和TNF-α等水平顯著升高,誘導(dǎo)白細(xì)胞的活化和遷移,并引起白細(xì)胞淤積,進(jìn)而導(dǎo)致毛細(xì)血管閉塞、視網(wǎng)膜缺氧和內(nèi)皮細(xì)胞損傷[28]。上調(diào)的TNF-α導(dǎo)致細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞黏附和內(nèi)皮功能障礙,增加血-視網(wǎng)膜屏障的滲透性,加速DME的發(fā)生發(fā)展[29]。此外,炎癥因子高表達(dá)亦能促進(jìn)VEGF表達(dá)。高血糖介導(dǎo)IL-17A表達(dá),促進(jìn)視網(wǎng)膜炎癥及血管通透性增高,同時(shí)還能增強(qiáng)VEGF表達(dá),間接促進(jìn)視網(wǎng)膜血管增殖和新生血管形成[30]。

VEGFR-1主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá),參與白細(xì)胞在炎癥部位的募集[24]。VEGFR-2僅在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。VEGF與VEGFR-2的結(jié)合啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo),不僅增加血管通透性,而且通過(guò)核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子(NF-κB)上調(diào)炎癥細(xì)胞因子(如MCP-1、ICAM-1)的表達(dá)[31-32]。在DME中,可溶性VEGFR-2的水平與IL和MCP-1等炎癥因子的水平顯著相關(guān),這些炎癥因子誘導(dǎo)白細(xì)胞趨化,促進(jìn)炎癥細(xì)胞黏附到血管內(nèi)皮,導(dǎo)致血管通透性進(jìn)一步增加[33]。因此,VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的受體結(jié)合進(jìn)一步促進(jìn)黃斑水腫。VEGF對(duì)炎癥細(xì)胞具有趨化性[34],VEGF除了增加血管通透性外,還可能促進(jìn)炎癥。Yoshimura等[35]研究發(fā)現(xiàn)PDR患者玻璃體中VEGF、MCP-1、IL-8、IL-6水平顯著升高,且VEGF水平與MCP-1、IL-8、IL-6水平呈正相關(guān)。此外,抑制Müller細(xì)胞來(lái)源的VEGF可顯著降低糖尿病小鼠TNF-α、ICAM-1和NF-κB的表達(dá)[36]。

抗VEGF治療抑制VEGFR-1和VEGFR-2的信號(hào)傳導(dǎo),是否能夠抑制炎癥因子,下調(diào)眼內(nèi)炎癥因子水平有待進(jìn)一步研究。本研究主要觀察康柏西普注射5～7d后,即抗VEGF治療早期玻璃體液中細(xì)胞因子的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),玻璃體腔注射康柏西普5～7d后,玻璃體液中IL-6、IL-8、IL-18及TNF-α水平顯著增高,其余炎癥因子(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17A和MCP-1)水平無(wú)顯著變化?？蛋匚髌仗禺愋越Y(jié)合VEGF-A,競(jìng)爭(zhēng)性抑制VEGF與其受體結(jié)合,但在治療早期對(duì)炎癥細(xì)胞因子水平無(wú)明顯抑制作用。IL-18作為促炎細(xì)胞因子,最初被描述為干擾素-γ誘導(dǎo)因子,表達(dá)于活化的自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞等[37]。VEGF與IL-18相互抑制[38]。隨著DR病程的進(jìn)展,血清IL-18水平呈逐漸下降趨勢(shì),對(duì)VEGF抑制作用減弱,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞增生,新生血管形成。本研究發(fā)現(xiàn)康柏西普抑制VEGF表達(dá),玻璃體液中IL-18水平升高。這與視網(wǎng)膜新生血管模型中,VEGF和IL-18水平呈負(fù)相關(guān)的觀察結(jié)果一致[39]。既往研究發(fā)現(xiàn)注射雷珠單抗7d后玻璃體內(nèi)IL-6、IL-8水平顯著升高[40],玻璃體內(nèi)注射貝伐單抗3～7d后房水中IL-8水平顯著升高,IL-6及MCP-1水平高于治療前,但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[41]。相似地,本研究發(fā)現(xiàn)玻璃體腔注射康柏西普5～7d,玻璃體液中IL-6及IL-8水平較未注藥組顯著升高。IL-6作為一種多功能促炎因子,廣泛作用于炎癥的各級(jí)反應(yīng),可以誘導(dǎo)炎癥急性期反應(yīng),增加血管通透性[42]。慢性高糖刺激可顯著促進(jìn)缺血的視網(wǎng)膜、血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞分泌IL-6[42],這可能是本研究中應(yīng)用康柏西普抑制VEGF表達(dá)后,IL-6水平升高的原因之一。IL-8則是由缺血視網(wǎng)膜的內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的促炎和血管生成細(xì)胞因子[43],其分泌受IL-6調(diào)節(jié),并進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)[44]。IL-6及 IL-8眼內(nèi)水平均與黃斑水腫的嚴(yán)重程度相關(guān)[45-46]。此外,Roh等[47]研究發(fā)現(xiàn)抗VEGF治療DME后,DME復(fù)發(fā)與房水中IL-6升高有關(guān),而與VEGF無(wú)關(guān),這可能也是部分DME患者抗VEGF治療后應(yīng)答不佳的原因之一。TNF-α作為非糖基化蛋白,由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞合成和分泌,可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增生,趨化并活化中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放炎性介質(zhì),誘發(fā)炎癥反應(yīng)。既往研究發(fā)現(xiàn)雷珠單抗注射1d后眼內(nèi)IL-6、IL-8水平驟升,IL-2、TNF-α水平升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[48]。本研究比較了玻璃體腔注藥后5、6、7d玻璃體液中炎癥細(xì)胞因子水平,發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞因子水平無(wú)明顯波動(dòng)。推測(cè)本研究中IL-6、IL-8、IL-18及TNF-α升高的過(guò)程短暫而急劇,可能發(fā)生于注射后1～4d。這些炎癥因子水平的升高也可能與注射穿刺或藥物作用過(guò)程中的急性反應(yīng)或視網(wǎng)膜缺血缺氧[48]有關(guān)。上述研究結(jié)果表明,抗VEGF治療早期對(duì)眼內(nèi)炎癥因子水平影響甚微。

本研究采用患者玻璃體液作為標(biāo)本以檢測(cè)各因子水平,玻璃體液較房水能夠更好地反映視網(wǎng)膜病變情況[49]。本研究為前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究,隨機(jī)分組可減少一定的選擇偏倚,所有患者均嚴(yán)格按照納入標(biāo)準(zhǔn)選擇。但本研究仍具有一定的局限性,如納入樣本量有限,納入患者的PDR類型較復(fù)雜,且本研究未在隨機(jī)研究中評(píng)估假處理對(duì)照組,這可能會(huì)影響研究結(jié)果。

抗VEGF藥物作為PDR及DME的一線治療方法已被廣泛研究,但仍有相當(dāng)一部分患者對(duì)抗VEGF治療反應(yīng)不佳。DR的病因是多因素的,DR的發(fā)病機(jī)制涉及多種細(xì)胞因子,如炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等[50],通過(guò)拮抗單一細(xì)胞因子治療DR存在一定困難。本研究證實(shí),玻璃體腔注藥后視網(wǎng)膜仍處于炎癥狀態(tài)。既往研究表明,眼內(nèi)炎癥細(xì)胞因子水平與PPV術(shù)后遠(yuǎn)期視力具有相關(guān)性[51]。玻璃體注射曲安奈德聯(lián)合PPV對(duì)PDR患者術(shù)后炎癥有顯著抑制作用,可減少術(shù)后早期黃斑水腫的發(fā)生[52]。緩釋地塞米松植入物、氟輕松玻璃體內(nèi)植入物也能有效降低PPV術(shù)后DME的發(fā)生[53-54]。因此,我們認(rèn)為PPV術(shù)前抗VEGF治療聯(lián)合PPV術(shù)后抗炎治療對(duì)PDR的預(yù)后具有重要臨床意義。未來(lái)可進(jìn)一步研究DR的免疫炎癥機(jī)制,為深入了解DR相關(guān)靶向治療提供思路。本研究結(jié)果也提示針對(duì)炎癥機(jī)制治療及聯(lián)合治療(如抗VEGF治療聯(lián)合抗炎治療)的開發(fā),將為DR患者的綜合和個(gè)性化治療提供希望。