速滅威對花翅搖蚊幼蟲的毒性效應

王宏偉，袁善奎，侯玉霞，宋偉華

(1.農業(yè)農村部農藥檢定所，北京 100125；2.農業(yè)農村部農藥評價重點實驗室，北京 100125；3.中國農業(yè)大學理學院，北京 100193)

搖蚊是一類重要的水生昆蟲，目前發(fā)現的種類超過5 000種，其在水生生態(tài)環(huán)境中的重要作用已被大量研究證實[1-2]。搖蚊幼蟲又稱紅蟲，是種類最多，分布最廣，密度和生物量最大的淡水底棲動物類群，其生物量約占底棲生物量的70%～80%[3]。搖蚊幼蟲是水生食物鏈中重要的營養(yǎng)層級，是魚類和水鳥的重要食物來源，也是污染物在營養(yǎng)層級間傳遞的重要媒介[4]。由于搖蚊具有對污染物敏感、生命周期短、易于實驗室培養(yǎng)等諸多優(yōu)勢，使其成為水環(huán)境監(jiān)測的優(yōu)良指示生物[5]。

速滅威是我國使用較多的氨基甲酸酯類殺蟲劑之一，具有觸殺、熏蒸作用和一定的內吸活性，主要用于防治水稻上的飛虱、葉蟬[6]。速滅威微溶于水，如果施用不當或者施藥后管理不善，極易導致周邊水體污染，從而對水生生態(tài)系統造成影響。目前，有關速滅威的研究主要圍繞檢測方法、生物活性、殘留和降解特性等方面，但在速滅威對水生生物毒理效應方面的研究報道甚少[7]。本文以我國南方地區(qū)優(yōu)勢物種花翅搖蚊為受試生物[8]，研究速滅威對底棲生物搖蚊幼蟲的急慢性毒性，旨在為系統評價速滅威的生態(tài)環(huán)境風險提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試昆蟲 花翅搖蚊(Chironomuskiiensis)引種于北京市疾病預防與控制中心，用曝氣除氯3 d以上的自來水(pH 8.24，溶解氧8.16 mg/L，總硬度290 mg/L)飼養(yǎng)于玻璃缸中，水溫(24±1)℃，每7 d換1次水，每2 d投喂0.5～1 g熱帶魚飼料，自然光照，并用氧氣泵供氧，使用50目紗布罩住玻璃缸防止搖蚊成蟲逃逸。

1.1.2 供試農藥 93%速滅威原藥。

1.1.3 沉積物 依據《化學品 沉積物-水系統中搖蚊毒性試驗加標于水法》[9](GB/T 27858-2011)中附錄B配制均勻的沉積物，其中石英砂干重占比75%，高嶺石粘土(高嶺石含量≥30%)干重占比20%，泥炭(顆粒尺寸≤1 mm)干重占比5%。

1.2 急性毒性試驗 參照OECD方法測定速滅威對搖蚊幼蟲的急性毒性[10]。根據預試驗結果，設置1齡幼蟲組和4齡幼蟲組，分別將速滅威用曝氣水配成2.50、3.00、3.60、4.32、5.18 mg/L和5.00、6.50、8.45、10.99、14.28 mg/L 2個系列濃度梯度，以曝氣水為空白對照，分別選取生理活動能力正常且一致的1齡期和4齡期搖蚊幼蟲置于盛有75 mL藥液的小燒杯中，每個處理5頭幼蟲，4個重復。試驗期間不投喂食物，溫度(24±1)℃，光暗時間比=16 h∶8 h，于試驗開始后的24和48 h統計搖蚊幼蟲生存狀況，輕晃燒杯，幼蟲在15 s內無法改變姿勢(爬行或者“8”字擺動)視為活動抑制。

1.3 慢性毒性試驗

1.3.1 加標于上覆水法 參照《化學品 沉積物-水系統中搖蚊毒性試驗加標于水法》(GB/T 27858-2011)[9]的方法，在每個試驗容器中加入250 g沉積物(濕重)和700 mL蒸餾水配制成水-沉積物系統，調節(jié)pH至7.4。待水-沉積物系統沉降完全后，選取1齡搖蚊幼蟲(搖蚊卵孵化后3 d，體長約0.2 cm)加入試驗容器中，每個處理20頭，4個重復。加入搖蚊幼蟲后，關停曝氣泵24 h，待幼蟲全部沉入容器底部沉積物后繼續(xù)曝氣。加入搖蚊幼蟲48 h后，使用吸管取出相應體積的上覆水，并輕微加入新配制的相應濃度藥液。試驗期間，控制環(huán)境中溫度為(24±1)℃，濕度≥60%，光暗時間比16 h∶8 h。每2 d喂食1次，每只幼蟲每次的飼喂量為0.5 mg，3齡期后可適當增加喂食量。

1.3.2 加標于沉積物法 參照《化學品 沉積物-水系統中搖蚊毒性試驗加標于沉積物法》(GB/T 27859-2011)[11]的方法，將速滅威溶于少量丙酮中制備成儲備液，吸取相應量的儲備液加入10 g石英砂混勻，待丙酮從石英砂中揮發(fā)后，再與190 g沉積物(干重)混勻，并加入700 mL蒸餾水配制成水-沉積物系統。搖蚊的引入和試驗條件的控制同1.3.1。

1.3.3 結果調查 搖蚊染毒時記為第0 d，隨后每24 h觀察1次，記錄搖蚊的羽化個數和性別，在連續(xù)7 d未觀察到新的搖蚊羽化時為試驗終點。

1.4 數據處理 利用SPSS22.0中概率回歸法求得速滅威對搖蚊幼蟲急性毒性試驗和慢性毒性試驗的毒力回歸方程y=a+bx，計算半數效應濃度EC50，決定系數R2及95%置信區(qū)間；利用SPSS22.0對慢性毒性試驗組間各指標進行單因素分析，數據用平均值±標準偏差(Mean±SD)表示，采用Bonferroni方法分析組間顯著性差異(P<0.05)；運用SigmaPlot14.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 速滅威對花翅搖蚊幼蟲的急性毒性 花翅搖蚊幼蟲在低濃度速滅威處理下，與對照組在試驗初期相似，無明顯中毒癥狀，但在染毒12 h后開始少量出現中毒癥狀和死亡；高濃度處理組花翅搖蚊幼蟲在暴露2 h后就開始出現劇烈反應，身軀呈“C”字型不停的翻動，并隨著暴露時間的延長，幼蟲活動逐漸減緩，體色變淡，死亡數不斷增加。

速滅威對花翅搖蚊幼蟲的急性毒性試驗結果(表1、2)。由兩表可知，試驗48 h內，速滅威對花翅搖蚊幼蟲的毒性作用隨著處理濃度的增加和暴露時間的延長會逐漸增強；四齡搖蚊幼蟲的24 h EC50、48 h EC50是一齡搖蚊幼蟲的2.5倍以上，一齡幼蟲的敏感性高于四齡幼蟲。

表1 速滅威對花翅搖蚊一齡幼蟲的急性毒性

表2 速滅威對花翅搖蚊四齡幼蟲的急性毒性

2.2 速滅威對花翅搖蚊幼蟲的慢性毒性

2.2.1 速滅威對花翅搖蚊羽化的影響 慢性毒性試驗中搖蚊幼蟲存活個數為發(fā)生羽化的搖蚊數量與試驗結束后沉積物中存活的幼蟲數量之和。試驗結束后，在所有試驗容器的沉積物中均未發(fā)現存活的搖蚊幼蟲，這表明存活的搖蚊幼蟲都羽化為成蚊，所以搖蚊存活率等于其羽化率。由圖1、圖2可以看出，幼蟲的羽化普遍在初次出現羽化2 d后出現高峰期，持續(xù)2 d左右。在高濃度處理組中，初次出現羽化時間比對照組推遲1～3 d。這表明隨著速滅威濃度的增高，搖蚊幼蟲的羽化率降低，羽化時間延后，平均發(fā)育時間延長。

圖1 速滅威對花翅搖蚊幼蟲羽化率的影響(加標于上覆水法)

圖2 速滅威對花翅搖蚊幼蟲羽化率的影響(加標于沉積物法)

由表3、表4可知，在加標于上覆水法中，當速滅威濃度高于3.72 mg/L時，試驗組搖蚊幼蟲的羽化率和化蛹率與對照組存在顯著差異(P<0.05)。當速滅威濃度低于3.72 mg/L時，試驗組間搖蚊幼蟲的羽化率和化蛹率無顯著差異(P<0.05)；在加標于沉積物法中，當速滅威濃度高于10.00 mg/kg時，試驗組搖蚊幼蟲的羽化率和化蛹率與對照組存在顯著差異(P<0.05)。中等濃度處理組中的羽化率要略高于化蛹率，但無顯著性差異。推測這可能是中等濃度處理組中部分搖蚊幼蟲羽化失敗造成的。根據慢性毒性實驗結束后的化蛹數量和羽化數量計算不同濃度處理搖蚊幼蟲化蛹率和羽化率，最終得到加標于上覆水法中速滅威對搖蚊幼蟲的化蛹率半數效應濃度(EC50)值為3.72 mg/L，對搖蚊幼蟲的羽化率半數效應濃度(EC50)值為3.63 mg/L；加標于沉積物法中速滅威對搖蚊幼蟲的化蛹率半數效應濃度(EC50)值為23.71 mg/kg，對搖蚊幼蟲的羽化率半數效應濃度(EC50)值為20.60 mg/kg。

表3 不同速滅威濃度處理組花翅搖蚊的存活及羽化狀況(加標于上覆水法)

表4 不同速滅威濃度處理組花翅搖蚊的存活及羽化狀況(加標于沉積物法)

除化蛹率和羽化率之外，本研究還對不同濃度速滅威對搖蚊羽化時間的影響進行了記錄(表3、4)。整體來看，速滅威在一定程度上抑制了搖蚊幼蟲的羽化，使其羽化時間有了不同程度的延滯，延滯時間與速滅威濃度成正比。影響搖蚊幼蟲羽化時間的因素很多，除不同的污染物通過促進或者抑制搖蚊幼蟲體內的激素分泌影響搖蚊幼蟲的羽化時間之外，營養(yǎng)物質含量、飼料、攝食習慣、生存環(huán)境[12，13，14]等外界因素的差異都可影響搖蚊幼蟲的羽化時間。因此還需要進一步深入的研究。

在記錄羽化時間和羽化率的同時，通過觀察速滅威對羽化搖蚊性別的影響。結果發(fā)現對照組及低濃度組羽化的搖蚊個體比例接近為1∶1，而當速滅威濃度達到2.20 mg/L或19.60 mg/kg時，速滅威對羽化搖蚊的性別比產生嚴重影響，但是其影響無明顯規(guī)律可循。之前也有一些關于污染物對羽化搖蚊性別影響的研究，但是結果各不相同。比如劉麗等曾研究了六氯苯乙烯對搖蚊幼蟲(Chironomuskiiensis)羽化性別比的影響，發(fā)現六氯苯使得羽化搖蚊雄性數量明顯減少[15]。鐘文玨等研究發(fā)現沉積物中五氯酚對雌性搖蚊的羽化抑制作用要顯著大于雄性搖蚊[16]。由此可見，速滅威對羽化搖蚊性別比影響的機制還需要更深入探討。

試驗過程中觀察到，搖蚊幼蟲在蛹期即將羽化為成蚊時容易發(fā)生死亡，部分個體羽化中途時死亡。同時還發(fā)現，中高濃度速滅威處理組與對照組以及低濃度速滅威處理組相比，多出現翅膀畸形搖蚊，羽化成蚊的個體出現身體和翅膀疲軟，飛行無力等特征。試驗過程中存活的搖蚊都成功羽化為成蚊，但中高濃度速滅威處理組對蛹期搖蚊致死作用更明顯。速滅威屬于速效性氨基甲酸酯類殺蟲劑，推測其可能在加標早期對搖蚊幼蟲的身體機能造成不可逆的損傷，最終干擾其羽化。

2.2.2 速滅威對花翅搖蚊活動行為的影響 大多數搖蚊有筑巢的習性。巢是搖蚊幼蟲利用唾液腺分泌物粘附的淤泥或砂粒筑建的，多筑于沉積物表面或埋于淤泥中。搖蚊幼蟲棲居在巢中，頭部伸出取食，隨著搖蚊幼蟲體長增長，所筑的巢也會增長。比較幾個不同處理組中搖蚊幼蟲在沉積物表面的筑巢數量發(fā)現，沉積物中速滅威加標濃度為10.00、14.00和19.60 mg/kg時，搖蚊幼蟲的筑巢行為較溶劑對照(圖3K)明顯增強(圖3)，這表明速滅威對搖蚊幼蟲的筑巢行為有促進作用。

圖3 花翅搖蚊幼蟲在沉積物表面筑巢行為變化情況

3 結論與討論

本研究結果表明，速滅威對花翅搖蚊一齡幼蟲24、48 h的EC50分別為4.52、3.14 mg/L，與IUPAC數據中速滅威對魚的急性毒性結果相比，花翅搖蚊對速滅威的敏感性比魚更高。試驗中發(fā)現一齡幼蟲對速滅威的敏感性遠高于四齡幼蟲，因此在測定水環(huán)境中外源污染物對搖蚊幼蟲半數效應濃度時，選用一齡搖蚊幼蟲作為受試生物更為嚴謹。

慢性毒性實驗中，加標上覆水中速滅威對搖蚊幼蟲的羽化率半數效應濃度EC50及化蛹率半數效應濃度EC50分別為3.63和3.72 mg/L，加標沉積物中速滅威對搖蚊幼蟲的羽化率半數效應濃度EC50及化蛹率半數效應濃度EC50分別為20.60和23.71 mg/kg。2種慢性毒性試驗方法均顯示出，隨著處理組速滅威濃度的增加，搖蚊幼蟲的化蛹率、羽化率及存活率降低，羽化時間延滯。這與多數污染物影響效果一致，但也存在少數污染物促進搖蚊的羽化，例如一些內分泌干擾物如六氯苯[15]、三氯苯酚[12]、多殺霉素[17]等。本研究中并沒有發(fā)現處理組速滅威濃度與羽化搖蚊雄雌比之間存在相關性，這可能是因為速滅威對搖蚊性別分化相關的激素影響較小。

本研究發(fā)現與多數污染物抑制搖蚊幼蟲筑巢行為不同，在速滅威處理組羽化搖蚊數量少于對照組羽化搖蚊數量時，速滅威處理組沉積物表面的筑巢數量反而多于對照組，這表明速滅威對搖蚊幼蟲的筑巢行為可能存在促進作用。目前研究中發(fā)現多數污染物對搖蚊幼蟲的筑巢行為有抑制作用，Taylor等發(fā)現搖蚊幼蟲(Chironomusriparius)暴露于林丹后，其筑巢行為明顯受到抑制[18]。Macdonald等發(fā)現全氟辛烷磺酸(PFOS)對搖蚊幼蟲(Chironomustentans)筑巢行為有明顯的抑制作用，并且發(fā)現搖蚊幼蟲多聚集在沉積物表面[19]。關于污染物對搖蚊幼蟲筑巢行為活動有促進作用的報道甚少，具體的機理還需進一步研究確認。