河北省石家莊市番茄黃化曲葉病毒及其伴隨DNAβ 的分子鑒定及序列分析

韓旭良，康忱，田哲娟，王鵬，李亞棟，趙雪芳，閆洪波，劉美霞，吳志明*

（1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)，河北 石家莊 050051；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，河北 石家莊 050051；3.山東省壽光市圣城街道辦事處，山東 壽光 262700）

雙生病毒（geminivirus）是一種具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈DNA 植物病毒[1]，在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生[2]，感病植株主要表現(xiàn)為葉片卷曲窄小、皺縮，葉片和葉脈黃化，莖彎曲，植株生長(zhǎng)緩慢、矮化等[3，4]。該病毒已在我國(guó)云南、廣西、廣東、海南、河南、山東、河北等地區(qū)的番茄、煙草、番木瓜等多種經(jīng)濟(jì)作物上侵染，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[5，6]。雙生病毒具有長(zhǎng)度為2.5～3.2 kb（單組分病毒，只含有DNA-A）和4.8～5.6 kb（雙組分病毒，同時(shí)含有DNA-A 和DNA-B）的環(huán)狀基因組，根據(jù)昆蟲載體和基因組特征的不同，這些病毒可分為7 個(gè)屬——貝庫(kù)特病毒屬（Becurtovirus）、貝戈莫病毒屬 （Begomoviru）、曲頂病毒屬 （Curtovirus）、埃農(nóng)病毒屬（Eragrovirus）、馬斯特里韋病毒屬（Mastrevirus）、拓?fù)洳《緦伲═opocuvirus）和特恩庫(kù)特病毒屬 （Turncurtovirus）[7，8]。其中貝庫(kù)特病毒屬病毒（Begomovirus）可以通過(guò)煙粉虱進(jìn)行大范圍傳播，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9，10]。菜豆金色花葉病毒屬病毒大多數(shù)包含2 條大小相近的組分DNA-A 和DNA-B，其基因組長(zhǎng)度為2.5～3.0 kb，無(wú)包膜；少數(shù)為單組分，只含有DNA-A，長(zhǎng)度約為2.8 kb[11]。番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）是單組分菜豆金色花葉病毒的典型代表，被其侵染的番茄植株會(huì)出現(xiàn)葉片卷曲窄小且葉脈泛黃、植株矮小、發(fā)育緩慢等癥狀，嚴(yán)重影響番茄生產(chǎn)[12]。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外[13]均發(fā)現(xiàn)一些單組分雙生病毒伴隨有衛(wèi)星 DNA（DNA Betasatellite，又稱 DNAβ），而DNAβ 只有在DNA-A 存在的情況才可以進(jìn)行復(fù)制和在植物細(xì)胞組織間移動(dòng)[14]。不同雙生病毒伴隨的DNAβ存在較大差異，目前尚無(wú)合適的方法對(duì)其進(jìn)行歸類[15]。伴隨TYLCV 的DNAβ 是一種大小約為1.3 kb 的亞病毒單鏈環(huán)狀DNA 分子，該DNAβ 可編碼BC1 蛋白[16]，而這種蛋白對(duì)菜豆金色花葉病毒屬部分病毒的致病性具有重要影響[17，18]。

TYLCV 及其DNAβ 對(duì)番茄生產(chǎn)有重大影響，對(duì)石家莊TYLCV 及其DNAβ 混合侵染情況進(jìn)行調(diào)查并對(duì)其傳播途徑和遺傳變異情況進(jìn)行分析，對(duì)指導(dǎo)石家莊番茄生產(chǎn)工作具有重要意義。為了明確TYLCV 及其DNAβ 在河北省石家莊市番茄上的侵染狀況與進(jìn)化起源，對(duì)采自石家莊市的感病番茄植株樣品進(jìn)行病毒檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)引起石家莊市番茄發(fā)生病變的病毒為TYLCV，其中部分TYLCV 分離物伴隨有DNAβ。對(duì)TYLCV 病毒分離物及其DNAβ 分子進(jìn)行遺傳變異分析，并明確其傳播途徑，旨為雙生病毒及其DNAβ 在河北省的傳播和防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021～2022 年在河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所的石家莊市大河實(shí)驗(yàn)基地，選擇出現(xiàn)葉片卷曲皺縮、生長(zhǎng)緩慢、黃化、莖彎曲、植株矮化等癥狀的番茄植株采集4 份葉片，依次編號(hào)為1～4。以健康植株葉片為陰性對(duì)照；以TYLCV 侵染性克隆浸潤(rùn)法接種的發(fā)病番茄植株葉片為陽(yáng)性對(duì)照。

試劑主要有植物基因組提取試劑盒（Plant DNA Isolation Kit，成都福際生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)） 和pEASY-T1 試劑盒（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉片總DNA 提取 將葉片經(jīng)液氮速凍研磨后，按照植物基因組提取試劑盒說(shuō)明書上的具體操作，提取番茄葉片基因組DNA；然后，將DNA 溶解于無(wú)菌去離子水中，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存，備用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 使用彭燕等[19]設(shè)計(jì)的TYLCV檢測(cè)引物（表1）擴(kuò)增TYLCV 的DNA-A 部分區(qū)域后進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物擴(kuò)增DNA-A 全長(zhǎng)序列，以總DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

表1 引物信息Table 1 Primer information

使用謝艷等[20]設(shè)計(jì)的DNAβ 擴(kuò)增引物擴(kuò)增DNAβ，以總DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，65 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min 15 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸 10 min。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收。將膠回收產(chǎn)物連接至pEASY-T1 載體上，轉(zhuǎn)化到DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)12～16 h 后挑取單克隆，并將3 個(gè)鑒定為陽(yáng)性的單克隆交由華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)反向引物進(jìn)行TYLCV 病毒擴(kuò)增，得到TYLCV 石家莊分離物的DNA-A 近全長(zhǎng)序列。

1.2.3 序列分析 在NCBI 上選取國(guó)內(nèi)外有代表性的TYLCV DNA-A 序列 （表 2） 和 DNAβ 序列 （表 3），使用MEGA 6.0 軟件中的Compute pairwise distance法進(jìn)行成對(duì)序列距離分析，使用MEGA 6.0 軟件中的Clustal W 法進(jìn)行多序列比較分析，然后進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建。使用DNAMAN 軟件將本次得到的分離物與2015 年TYLCV 石家莊分離物進(jìn)行序列比對(duì)，進(jìn)一步分析石家莊TYLCV 的變異情況。

表2 不同年份各地區(qū)TYLCV 分離物及其在國(guó)際收錄庫(kù)的收錄情況Table 2 TYLCV isolates and their inclusion in international databases in different years and regions

表3 不同年份各地區(qū)雙生病毒屬DNAβ及其在國(guó)際收錄庫(kù)的收錄情況Table 3 DNA Betasatellite of geminivirus in different years and regions and their inclusion in the international database

2 結(jié)果與分析

2.1 TYLCV 石家莊分離物基因組DNA-A 結(jié)構(gòu)特征

使用TYLCV 檢測(cè)引物對(duì)4 個(gè)樣品基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，均得到長(zhǎng)度約為500 bp 的條帶（圖1）；測(cè)序結(jié)果表明，4 個(gè)樣品感染的TYLCV 序列完全一致。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物，得到TYLCV 石家莊分離物的全長(zhǎng)序列，將其命名為TYLCV-SJZ2021。該序列全長(zhǎng)為2 781 bp，與已報(bào)道的TYLCV 具有相同的結(jié)構(gòu)特征，共有6 個(gè)ORFs——編碼外殼蛋白的AV1（308 ～1 084 bp），編碼移動(dòng)相關(guān)蛋白的 AV2（148～498 bp），編碼復(fù)制蛋白的 AC1（1 542～2 615 bp），編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的AC2（1 226～1 633 bp），編碼復(fù)制增強(qiáng)因子的AC3（1 081～1 485 bp），編碼復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的AC4（2 171～2 464 bp）。除此之外，在非編碼區(qū)（2 616～147 bp）上含有與雙生病毒復(fù)制起始相關(guān)的保守序列TAATATTAC（2 775～2 bp）。

圖1 番茄TYLCV 石家莊分離物基因組全長(zhǎng)擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Full-length amplification of TYLCV Shijiazhuang isolate

2.2 TYLCV 石家莊分離物基因組DNA-A 相似性比較分析

為了解TYLCV-SJZ2021 在病毒上的分類地位和可能來(lái)源，對(duì)得到的TYLCV 分離物進(jìn)行成對(duì)序列距離分析（圖2）和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖3）。根據(jù)成對(duì)序列距離分析結(jié)果，可以將本研究選用的TYLCV 病原分離物分為5 個(gè)株系——伊朗株系、科威特株系、阿曼株系、以色列株系和葡萄牙株系，TYLCVSJZ2021 與伊朗株系、科威特株系和阿曼株系的相似度均在94%以下，與以色列株系的相似度在97%以上，因此認(rèn)為TYLCV-SJZ2021 屬于以色列株系。

圖2 石家莊TYLCV-SJZ2021 與其他TYLCV 分離物成對(duì)序列距離分析Fig.2 Pairwise sequence distance analysis of TYLCV-SJZ2021 and other TYLCV isolates

圖3 石家莊TYLCV-SJZ2021 與其他TYLCV 分離物的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of TYLCV-SJZ2021 and other TYLCV isolates

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，TYLCV-SJZ2021 與國(guó)內(nèi)17 個(gè)地區(qū)分離物以及澳大利亞和墨西哥TYLCV 分離物聚集在一個(gè)分支上，進(jìn)一步與美國(guó)TYLCV 分離物形成一個(gè)較大的分支；與新喀里多尼亞分離物、西班牙分離物、以色列分離物、韓國(guó)分離物、埃及分離物、科威特分離物和荷蘭分離物親緣關(guān)系較近，與伊朗分離物、科威特分離物、阿曼分離物、日本分離物和葡萄牙分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

將TYLCV-SJZ2021 與2015 年本實(shí)驗(yàn)室得到的TYLCV 石家莊分離物[21]進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果（圖4）顯示，二者相似度為98.67%，有37 處堿基不同，分別位于13、17、27、28、38、40、42、57、136、146、190、348、393、499、532、595、745、790、880、1 248、1311、1359、1458、1506、1627、1800、1806、1827、1941、2241、2255、2377、2402、2421、2493、2689和2 728 bp。其中，AV1 編碼區(qū)有8 處堿基不同，AV2 編碼區(qū)有1 處堿基不同，AC1 編碼區(qū)有11 處堿基不同，AC2 編碼區(qū)有6 處堿基不同，AC3 編碼區(qū)有4 處堿基不同，AC4 編碼區(qū)有5 處堿基不同；非編碼區(qū)有2 處堿基不同。

圖4 2021 年與2015 年得到的石家莊番茄TYLCV 分離物序列比對(duì)Fig.4 Sequence alignment of Shijiazhuang TYLCV isolates in 2015 and 2021

2.3 TYLCV-SJZ2021 伴隨的DNAβ分子結(jié)構(gòu)及同源性比較

使用DNAβ 擴(kuò)增引物擴(kuò)增DNAβ 的全長(zhǎng)序列（圖5），將其命名為Betasatellite SJZ2021。測(cè)序結(jié)果表明，4個(gè)感染TYLCV 樣品所攜帶的DNAβ 序列也完全相同。Betasatellite SJZ2021 全長(zhǎng)為1 343 bp，其上有編碼病毒在細(xì)胞間移動(dòng)相關(guān)蛋白的BC1 編碼區(qū)（279～629 bp）；有 1 個(gè)腺嘌呤 （A） 富集區(qū) （A-rich，798～1 058 bp），A 最高重復(fù)數(shù)為13（962～974 bp），該區(qū)域?qū)ΡＷCDNAβ 分子大小有重要作用；有1 個(gè)DNAβ 保守區(qū)域（SCR） 和 1 個(gè)雙生病毒科病毒共有的莖環(huán)結(jié)構(gòu)TAATATTAC （60～68 bp）。

圖5 TYLCV-SJZ2021 伴隨DNAβ的全長(zhǎng)擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 The DNAβfull-length amplification result of TYLCV-SJZ2021

對(duì)得到的DNAβ 進(jìn)行成對(duì)序列距離分析，結(jié)果（圖6）表明，Betasatellite SJZ2021 與山東分離物和河南分離物相似度（98%）最高，與其他地區(qū)雙生病毒DNAβ 分離物相似度均在78%以下。

圖6 TYLCV-SJZ2021 伴隨DNAβ與其他雙生病毒屬伴隨DNAβ成對(duì)序列距離分析Fig.6 Pairwise sequence distance analysis between TYLCV-SJZ2021associated DNA betasatellite and other DNA betasatellite of geminivirus

從系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖7）上來(lái)看，TYLCV-SJZ2021伴隨DNAβ 與山東地區(qū)和河南地區(qū)分離物形成一個(gè)分支；印度尼西亞與云南地區(qū)2 個(gè)不同年份的分離物形成一個(gè)分支，進(jìn)而與石家莊、山東和河南地區(qū)分離物形成一個(gè)較大分支。由此推測(cè)，TYLCV-SJZ2021 伴隨DNAβ 很有可能由印度尼西亞傳入我國(guó)云南地區(qū)，再由云南地區(qū)傳入石家莊市。

圖7 TYLCV-SJZ2021 伴隨DNAβ與其他雙生病毒屬伴隨DNAβ的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of TYLCV-SJZ2021 associated DNA betasatellite and other DNA betasatellite of geminivirus

3 結(jié)論與討論

本研究從分子水平上明確了近幾年河北省石家莊市為害番茄的TYLCV-SJZ2021 分離物在geminivirus中的分類地位，并將其歸類為以色列株系。雙生病毒科病毒在相似度＞94%時(shí)被認(rèn)為是同一株系的不同變種，相似度為89%～94%時(shí)被認(rèn)為是不同株系，相似度＜89%時(shí)則被認(rèn)為是不同的病毒[22]。本文中的TYLCVSJZ2021 與2015 年山東TYLCV 分離物相似度在99%以上，二者親緣關(guān)系最近，推測(cè)可能是通過(guò)煙粉虱傳播或者在引進(jìn)山東植物品種時(shí)傳入；且與本實(shí)驗(yàn)室白曉娟等[21]和河北科技大學(xué)田鵬等[23]關(guān)于河北TYLCV 株系鑒定結(jié)果一致，與以色列株系相似度為99%，說(shuō)明近幾年為害河北省的TYLCV 病毒株系主要是TYLCV以色列株系。但是與上述TYLCV 株系鑒定不同的是，上述兩者的報(bào)道中均明確提出TYLCV 分離物只含有DNA-A 部分，不含有TYLCV 伴隨DNAβ 分子，而本研究首次從石家莊番茄病區(qū)檢測(cè)到TYLCV-SJZ2021的伴隨DNAβ 分子。本研究得到的TYLCV-SJZ2021與2015 年本實(shí)驗(yàn)白曉娟等[21]得到的分離物相比編碼區(qū)和非編碼區(qū)都產(chǎn)生了較多變異，這種變異可能與TYLCV DNA-A 分子與其伴隨DNAβ 分子的進(jìn)化及其致病性有關(guān)系，伴隨DNAβ 促進(jìn)了感染TYLCV 病毒癥狀發(fā)生的嚴(yán)重程度。

本雙生病毒的伴隨DNAβ 的變異速度較快。DNAβ 在第一次被報(bào)到時(shí)只有682 bp，且為無(wú)可預(yù)測(cè)的ORF，且不會(huì)對(duì)TYLCV 的癥狀和感染速度產(chǎn)生影響[24]。在2008 年全世界已被報(bào)道的雙生病毒伴隨DNAβ變種超過(guò)了50 種且長(zhǎng)度達(dá)到1 kb 以上[25]，2020 年全世界已被報(bào)道的伴隨DNAβ 變種更是超過(guò)了60 種[16]。以本文選取的云南地區(qū)TYLCV 分離物伴隨DNAβ 分子為例，2012 年長(zhǎng)度為1 218 bp[26]，2013 年長(zhǎng)度為1 349 bp，2015 年長(zhǎng)度為 1 360 bp ，2016 年長(zhǎng)度為 1 353 bp，DNAβ 因其特性常以78%的相似度作為物種界限，云南分離物除2013 年分離物與2016 年分離物相似度為97%外，其他年份分離物兩兩對(duì)比的相似度遠(yuǎn)小于78%。在2021 年以前，河北省未有關(guān)于TYLCV 伴隨衛(wèi)星DNAβ 分子的報(bào)道，結(jié)合本文TYLCV-SJZ2021伴隨DNAβ 與河南報(bào)道的TYLCV 伴隨DNAβ 分子相似度（98%）最高，推測(cè)該病毒是較近時(shí)間內(nèi)通過(guò)煙粉虱由河南省傳播至河北省。DNAβ 與不同雙生病毒復(fù)合侵染不同植物時(shí)會(huì)產(chǎn)生的作用不同，例如，DNAβ 分子與棉花曲葉熱茲拉病毒（cotton leaf curl Gezira virus，CLCuGV）復(fù)合侵染棉花時(shí)會(huì)參與病癥的誘導(dǎo)[27]，與中國(guó)番茄黃化曲葉?。╰omato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）或TYLCV 復(fù)合侵染番茄時(shí)和與秋葵黃皺病毒（okra yellow crinkle virus，OYCrV）復(fù)合侵染秋葵時(shí)，DNAβ 會(huì)引起特定的癥狀[12，28]。隨著DNAβ 的變異，其可能會(huì)對(duì)番茄及其他農(nóng)作物產(chǎn)生不確定的為害，因此，定期對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和分子鑒定，對(duì)番茄及其他農(nóng)作物的生產(chǎn)具有重要意義。

本研究中，根據(jù)國(guó)內(nèi)報(bào)道的TYLCCNV 和中國(guó)番木瓜曲葉病毒（papaya leaf curl China virus，PaLCuCNV）及其伴隨DNAβ 進(jìn)行了檢測(cè)，但并未檢測(cè)到TYLCCNV 和PaLCuCNV，說(shuō)明當(dāng)前為害河北省石家莊市番茄作物的TYLCV-SJZ2021 主要是TYLCV 以色列株系及其伴隨DNAβ 分子共同作用引起的，這為開展河北省番茄抗病材料種質(zhì)資源鑒定和培育抗TYLCV品種奠定了基礎(chǔ)。TYLCV 是導(dǎo)致番茄及其他部分作物減產(chǎn)的重要病毒之一，而伴隨DNAβ 可以增加其致病性，隨著DNAβ 的變異還會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)測(cè)的影響，本文從分子水平上明確了TYLCV-SJZ2021 及其伴隨DNAβ 的基因組序列特征和分類地位，為進(jìn)一步利用其全長(zhǎng)序列構(gòu)建病毒侵染性克隆奠定了材料基礎(chǔ)，對(duì)于開展抗病毒育種材料接種和加快培育出適合當(dāng)?shù)胤N植的番茄抗病新品種具有重要理論和應(yīng)用價(jià)值。