中藥材組培脫毒技術(shù)研究進(jìn)展

高文敬，董景湘，劉靈娣*

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所/河北省藥用植物工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050051；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院，河北 石家莊 050051）

中藥材為具有道地性和中國(guó)特色的原生藥材，是藥用植物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，其種類繁多，開發(fā)潛力大，蘊(yùn)藏量較為豐富，在長(zhǎng)期發(fā)展和使用中獲得了醫(yī)生和患者的高度認(rèn)可[1]。隨著醫(yī)藥學(xué)和農(nóng)業(yè)的發(fā)展以及新冠疫情的出現(xiàn)，人們對(duì)中藥材的重視程度加大，中藥材市場(chǎng)需求量越來(lái)越大，導(dǎo)致大量中藥材野生資源被過度采挖，其野生環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，蘊(yùn)藏量急劇下降。近年來(lái)，為解決中藥材市場(chǎng)需求和資源供應(yīng)不足等問題，中藥材種植業(yè)得到了快速發(fā)展，但在種植過程中由于植物病毒在其體內(nèi)不斷積累，致使中藥材產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響，甚至造成絕產(chǎn)和種質(zhì)退化等多種問題[2]。而目前，中藥材病毒病還沒有行之有效的辦法根治。為了更好地保護(hù)、開發(fā)和利用中藥材種質(zhì)資源，利用組織培養(yǎng)的方式培養(yǎng)脫毒苗是有效控制和消除中藥材病毒病的關(guān)鍵所在，也是中藥材達(dá)到商品化、產(chǎn)業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化生產(chǎn)需要解決的首要問題?，F(xiàn)已有報(bào)道的中藥材脫毒方法多種多樣，主要包括熱處理、莖尖組培、熱處理+莖尖組培脫毒、化學(xué)法、物理法、基因編輯法等。對(duì)近年來(lái)中藥材組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)研究進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)綜述，以期為中藥材組培脫毒技術(shù)的更深入研究提供參考。

1 中藥材常見病毒病的種類

中藥材種類繁多，其病毒種類也多種多樣，中藥材感染的病毒主要包括黃瓜花葉病毒（CMV）、煙草花葉病毒（TMV）、大蒜潛隱病毒（GLV）、韭蔥黃條病毒（LYSV）、馬鈴薯A 病毒（PVA）、馬鈴薯M 病毒 （PVM）、馬鈴薯 S 病毒 （PVS）、馬鈴薯 Y ?。≒VY）、百合無(wú)癥病毒 （LSV） 和番茄不孕病毒（TAV）等[3]。不同中藥材病毒病的研究程度不一致，有些中藥材會(huì)遭到多種病毒侵染，并具有傳播迅速、病癥復(fù)雜、病毒在植株內(nèi)分布不均、初侵染與再侵染特征不一致等特點(diǎn)[4]。綜合來(lái)看，前人對(duì)出現(xiàn)花葉、皺葉、條紋、斑駁、壞死、畸形等表型明顯的病毒研究較多，對(duì)表型不明顯的病毒研究較少。

2 中藥材組培脫毒技術(shù)研究現(xiàn)狀

2.1 熱處理脫毒技術(shù)

植物脫毒技術(shù)是近幾十年來(lái)才逐漸發(fā)展起來(lái)的，熱處理脫毒是最早應(yīng)用的一種脫毒方法，解決了部分病毒病害造成的減產(chǎn)問題[5]。熱處理是利用某些病毒較寄主植物對(duì)溫度敏感、對(duì)高溫忍耐度較差的特性，通過高溫處理，使病毒失活發(fā)生鈍化，病毒的繁殖和擴(kuò)散速度得到控制的一種處理方式。經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間高溫處理后，由于寄主植物的生長(zhǎng)速度快于病毒的傳播速度，因此病毒含量會(huì)慢慢減少，隨后將生長(zhǎng)較快、不含病毒的組織切取后進(jìn)行組織培養(yǎng)，最終可得到脫毒苗。世界上已知脫除病毒最早的例子是用熱處理脫除馬鈴薯卷葉病毒（PLVR）[6]。早在1889 年印度尼西亞爪吐人就用50 ℃左右的熱水浸泡用于繁殖的甘蔗莖段來(lái)防止病毒病的發(fā)生，現(xiàn)在許多國(guó)家在種植甘蔗前仍使用這種處理方法[5]。熱處理技術(shù)也被廣泛應(yīng)用到各種中藥材的脫毒過程中。一般采用35～55 ℃的熱水或高溫蒸汽、高溫空氣，根據(jù)外界溫度和外植體的不同決定熱處理的時(shí)長(zhǎng)[7]。吳群英等[8]對(duì)羅漢果組培苗進(jìn)行38.5 ℃高溫處理10 d，得到了完全脫毒的羅漢果健康種苗。肖穎等[9]分別在 20、25、30、35、40、45 ℃高溫條件下對(duì)息半夏組培苗進(jìn)行脫毒處理，利用顯微鏡檢測(cè)法檢測(cè)脫毒情況，結(jié)果顯示，在一定溫度范圍內(nèi)，脫毒率隨著溫度的升高而明顯提高。隨著研究的深入和技術(shù)的不斷進(jìn)步，目前常采用熱處理與其他脫毒技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)中藥材進(jìn)行脫毒。

2.2 莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)

病毒在植株體內(nèi)的分布并不均勻，其中莖尖分生組織生長(zhǎng)較快且無(wú)維管束，病毒感染程度較低，莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)區(qū)域幾乎沒有病毒[10]。莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)最早是1952 年法國(guó)學(xué)者M(jìn)orel 等[11]在大麗菊上應(yīng)用成功；之后，隨著植物組培技術(shù)的進(jìn)步和完善，該方法得到了廣泛應(yīng)用，目前在中藥材上已經(jīng)應(yīng)用于貢菊、滁菊、地黃、太子參、丹參、半夏等的脫毒，并獲得了脫毒組培苗[12，13]。莖尖脫毒既能夠在很大程度上保持遺傳性狀的穩(wěn)定，又能夠脫除一些具有潛在威脅的真菌和細(xì)菌，因此深受研究人員的重視。莖尖脫毒技術(shù)的重點(diǎn)是切取莖尖的大小和培養(yǎng)基的篩選。莖尖太小會(huì)大大降低成活率，莖尖太大則會(huì)影響脫毒效果，研究表明，切取長(zhǎng)0.2～0.5 mm 的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)既可以保證一定的成活率，又可以最大程度地提高脫毒效率[14～16]。在馬鈴薯上，切取長(zhǎng)0.2 mm 左右的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，成活率和脫毒率分別達(dá)到68%和56%[14]。在百合上，剝?nèi)￠L(zhǎng)0.2～0.5 mm 的莖尖分生組織進(jìn)行培養(yǎng)，脫毒效果和成活率均較好[15，16]。王寶霞等[17]對(duì)半夏莖尖愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基為 MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+瓊脂 7 g/L+蔗糖30 g/L，并可一次性成苗，經(jīng)檢測(cè)TMV、CMV 和SMV 脫毒率均達(dá)到100%。張淑娟等[18]篩選出唐菖蒲莖尖叢生芽的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為6-BA 0.5～2 mg/L+NAA 0.05～0.2 mg/L，叢生芽增殖初期效果最好的培養(yǎng)基為 2/3MS+6-BA 1.0～1.5 mg/L+NAA 0.10～0.15 mg/L，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.3 mg/L，經(jīng)檢測(cè)，供試的5 個(gè)品種均不帶菜豆黃花葉病毒、黃瓜花葉病毒、煙草環(huán)斑病毒和蠶豆萎蔫病毒。

2.3 熱處理＋莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)

采用莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)，通常需切取非常短的莖尖，且還需在顯微鏡下進(jìn)行，因此實(shí)際操作起來(lái)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且脫毒效果也不特別理想。研究發(fā)現(xiàn)，將熱處理與莖尖脫毒培養(yǎng)結(jié)合起來(lái)，可使脫毒率得到一定幅度的提升[5]。曹有龍等[19]切取枸杞莖尖置于38 ℃高溫環(huán)境培養(yǎng)28～30 d，之后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，恢復(fù)生長(zhǎng)后得到組培苗，移栽后經(jīng)檢測(cè)均未攜帶病毒，采用熱處理+莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)在很大程度上提升了脫毒效果。江洪如等[20]將外植體置于溫箱中先58 ℃處理10～20 min，再 38 ℃處理 72 h 后，切取長(zhǎng) 0.2～0.4 mm的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，可獲得完全脫去4 種主要病毒的百合脫毒苗。濕春秀等[21]以3 個(gè)種類的丹參為試材，將其試管苗置于光照培養(yǎng)箱中37～38 ℃恒溫培養(yǎng)38 d后，利用雙目體視顯微鏡在無(wú)菌條件下切取長(zhǎng)0.2～0.4 mm的莖尖，隨后放到配制好的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，最后得到組培苗，檢測(cè)結(jié)果顯示，3 個(gè)種類的丹參均已脫除CMV 病毒；但不同類型丹參的脫除率存在較大差異，其中皺葉丹參脫毒率高達(dá)80%，大葉丹參脫毒率為40%，而狹葉丹參脫毒率僅為20%。說明在不同種類的中藥材上，熱處理+莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)的使用效果不同，需要進(jìn)一步探索其他方法。外植體的成活率直接影響脫毒效率，隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，成活率逐漸降低。近幾年，很多研究人員傾向于利用變溫處理與莖尖脫毒培養(yǎng)相結(jié)合的方式進(jìn)行脫毒處理。顧沛雯[22]研究發(fā)現(xiàn)，脫毒過程中采用熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的方法可使葡萄組培苗的成活率和脫毒率均較單純莖尖培養(yǎng)有所提高，其中，白天38 ℃/夜晚32 ℃變溫處理的成活率較38 ℃恒溫處理提高15.6%，而脫毒率無(wú)明顯差別。石貴玉等[23]在毛葡萄上進(jìn)行了組培脫毒技術(shù)研究，發(fā)現(xiàn)白天37 ℃時(shí)長(zhǎng)8 h/夜晚22 ℃時(shí)長(zhǎng)16 h 處理10～15 d，莖尖成活率可達(dá)80%以上，脫毒率高達(dá)100%。

2.4 愈傷組織誘導(dǎo)脫毒技術(shù)

愈傷組織誘導(dǎo)脫病毒技術(shù)是通過對(duì)植株或部分組織進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，分化出芽后形成植株，經(jīng)病毒檢測(cè)篩選出無(wú)毒苗的方法。該方法可行性強(qiáng)，適用于實(shí)驗(yàn)室研究，具有周期較短、一次性成苗數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在很多中藥材脫毒中應(yīng)用。愈傷組織誘導(dǎo)通常選擇嫩葉、花藥、株芽、莖尖等作為外植體。謝紅娥等[24]對(duì)半夏葉片、葉柄、株芽進(jìn)行消毒處理后置于附加不同外源激素的培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)6-BA 2.0 mg/L 附加適量的NAA、GA3對(duì)珠芽增殖有促進(jìn)作用，還可促進(jìn)試管苗的生長(zhǎng)速度；IAA 0.2～0.5 mg/L 可促進(jìn)半夏根系生長(zhǎng)；6-BA 2.0 mg/L、GA30.2 mg/L 配合適當(dāng)濃度的2，4-D 和NAA，可促進(jìn)半夏葉片愈傷形成，促使其直接長(zhǎng)出根和葉片；利用6-BA 1.0～2.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L 可誘導(dǎo)莖尖一次性成苗，病毒脫除率達(dá)到80%。彭向前等[25]對(duì)半夏株芽進(jìn)行處理，篩選出適宜半夏脫毒苗繁殖的培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，在MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KT 0.10 mg/L 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)效果較好，脫毒率可達(dá)100%。王寶霞等[17]成功建立了能夠一次性成苗的再生體系，可以快速、高效地通過莖尖誘導(dǎo)半夏無(wú)毒苗，篩選出最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L，并可一次性成苗，經(jīng)檢測(cè)TMV、CMV 和SMV 脫毒率均達(dá)到100%。

2.5 超低溫保存脫毒技術(shù)

長(zhǎng)期以來(lái)，超低溫技術(shù)用于大多數(shù)植物種質(zhì)資源的保存。近幾年，研究人員發(fā)現(xiàn)超低溫可以殺死病毒，超低溫脫毒技術(shù)逐漸發(fā)展和應(yīng)用到植物脫毒中來(lái)，并成為一項(xiàng)對(duì)多種植物病毒脫除效率較高的理想方法。其具體操作方法是將植物試材在超低溫保護(hù)劑的保護(hù)下放入-196 ℃的液氮中處理，然后再解凍，通過組培的方法使其分化成完整植株[26]。超低溫脫毒的最佳試材是植株莖尖頂端分生組織，其細(xì)胞體積小、含水量較低，抗低溫能力較強(qiáng)，可以在低溫條件下存活，進(jìn)而達(dá)到脫除病毒的效果。試材經(jīng)超低溫處理后，即使切取較大的莖尖，也能確保形成的再生植株為脫毒苗。該技術(shù)操作較為容易，且節(jié)省成本，脫毒苗成苗速度更快。Brison 等[27]采用超低溫脫毒的方法首次成功脫去了李樹痘病毒（PPV），脫毒率達(dá)到50%，較傳統(tǒng)莖尖脫毒技術(shù)獲得的無(wú)菌苗脫毒率提升了30%。Wang 等[28，29]采用超低溫法去除了葡萄病毒A（GVA）、馬鈴薯Y 病毒（PVY） 和馬鈴薯卷葉病毒（PLRV），脫毒率較高，其中對(duì)GVA 的脫毒率達(dá)到了97%，明顯高于傳統(tǒng)的莖尖脫毒技術(shù)的脫毒率（僅12%）。白建明等[26]分別采用超低溫保存法和3 種常規(guī)方法（莖尖分生組織培養(yǎng)、熱處理、熱處理+莖尖分生組織培養(yǎng)）對(duì)馬鈴薯試管苗的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）和馬鈴薯X 病毒（PVX）進(jìn)行脫毒，結(jié)果表明，馬鈴薯莖尖經(jīng)超低溫保存后存活率和成苗率均高于常規(guī)方法處理。靳慧潔[30]通過超低溫脫毒+莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的方法成功獲得了百合脫毒苗。戴軍等[31]將太子參超低溫處理1 h，在適宜生長(zhǎng)發(fā)育的條件下培養(yǎng)，可使脫毒率達(dá)到90%，生產(chǎn)的脫毒苗可以滿足規(guī)?；N植需求。有研究發(fā)現(xiàn)，超低溫脫毒還可以脫除一些傳統(tǒng)脫毒方法不能脫除的病毒。

2.6 其他脫毒技術(shù)

除以上脫毒技術(shù)外，還有很多其他方法應(yīng)用到中藥材的脫毒中來(lái)，如花藥和花粉培養(yǎng)、珠胚心培養(yǎng)、莖尖微嫁接技術(shù)、病毒抑制劑處理以及多種方法結(jié)合的形式，但由于中藥材種類繁多，因此不同種類、不同品種甚至不同株系的脫毒效果存在較大差異。

綜合來(lái)看，在中藥材脫病毒研究中，熱處理+莖尖培養(yǎng)脫病毒技術(shù)最成熟，使用最多；超低溫脫毒技術(shù)脫毒效果最好，但應(yīng)用和報(bào)道較少，還需要進(jìn)一步探索，該方法具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

3 病毒檢測(cè)技術(shù)

通過各種脫毒技術(shù)獲得的脫毒苗要想在生產(chǎn)中推廣，還需要經(jīng)過嚴(yán)格的檢測(cè)，確定植株脫毒成功后才能應(yīng)用。目前常用的病毒檢測(cè)方法仍以傳統(tǒng)方法為主，主要包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、電鏡檢測(cè)和指示植物法。

ELISA 法是目前應(yīng)用最多的病毒檢測(cè)方法，通過抗原與抗體免疫反應(yīng)利用酶的高效催化反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定，具靈敏度較高、測(cè)定迅速、能同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品的特點(diǎn)，但植物病毒抗原性較差，可能會(huì)發(fā)生假陽(yáng)性反應(yīng)，在一定程度上造成檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確[3]。

RT-PCR 檢測(cè)方法是指通過體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA 序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析的方法。該方法靈敏性很高、結(jié)果精確，還可與其他檢測(cè)方法搭配使用，廣泛應(yīng)用于各個(gè)學(xué)科。

電鏡檢測(cè)是一種非常重要的病毒檢測(cè)手段，通過觀察病毒的形態(tài)、大小和組織結(jié)構(gòu)，確定脫毒苗是否完全脫毒。該方法對(duì)技術(shù)和儀器要求很高，所需顯微鏡非常昂貴，因此未得到廣泛推廣。

指示植物法是病毒檢測(cè)中應(yīng)用較早的一種方法，其原理是指示植物對(duì)某些病毒很敏感，葉片受到病毒侵染后會(huì)產(chǎn)生明顯的癥狀。操作上一般是蘸取待測(cè)植株汁液摩擦指示植物的葉片，觀察一段時(shí)間后看是否出現(xiàn)明顯的病癥。該方法操作簡(jiǎn)單、方便觀察，但癥狀顯示速度慢，觀察周期長(zhǎng)，受季節(jié)和環(huán)境變化影響大，因此無(wú)法廣泛應(yīng)用。

4 問題與展望

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，組培脫毒技術(shù)在多種作物上得到應(yīng)用，經(jīng)過組培脫毒得到的脫毒苗也逐漸在規(guī)?；?、商業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用，提升了作物產(chǎn)量和品質(zhì)，脫毒技術(shù)研究和應(yīng)用逐步從單一脫毒方法向2 種或多種方法相結(jié)合發(fā)展，不斷提高了成活率和脫毒率。由于中藥材研究起步較晚，研究經(jīng)費(fèi)和經(jīng)驗(yàn)不足，目前可應(yīng)用到規(guī)?；?、商業(yè)化生產(chǎn)中的中藥材脫毒苗較少，且脫毒技術(shù)還需要進(jìn)一步研究。

目前中藥材研究中較為成熟的脫毒技術(shù)是熱處理+莖尖培養(yǎng)脫毒，雖然應(yīng)用廣泛，且取得了較好效果，但還有較大的提升空間。另外，超低溫脫毒技術(shù)較傳統(tǒng)脫毒技術(shù)效率高、脫毒效果好，是一個(gè)非常具有應(yīng)用前景和研究?jī)r(jià)值的技術(shù)，但目前在中藥材脫毒上還未得到充分應(yīng)用。以往中藥材脫毒研究?jī)?nèi)容大多集中在脫毒技術(shù)和培養(yǎng)條件的優(yōu)化上，對(duì)病毒檢測(cè)方法的研究較少，而現(xiàn)有的檢測(cè)方法尚存在一些不足和弊端，如需要多種檢測(cè)方式反復(fù)檢測(cè)最終才能得到確切結(jié)果，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此，發(fā)展和優(yōu)化病毒檢測(cè)方法是今后研究的一個(gè)重要方向。通過現(xiàn)有技術(shù)和農(nóng)作物成功經(jīng)驗(yàn)，加大中藥材脫毒研究投入，不斷優(yōu)化和發(fā)展脫毒技術(shù)和檢測(cè)方法仍然是提高成活率和脫毒率，實(shí)現(xiàn)脫毒苗商業(yè)化種植應(yīng)用的重點(diǎn)。將基礎(chǔ)研究成果早日應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中，加速成果轉(zhuǎn)化進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；?、商業(yè)化應(yīng)用和推廣，促進(jìn)中藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。