外排泵抑制劑對(duì)耐藥痤瘡丙酸桿菌的體外作用

毛海嬋,鄭武娟,曾文軍,楊麗玲,李明,阮建波

痤瘡是一種毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性皮膚病,好發(fā)于青春期,且具有損容性[1]。2021年,中國(guó)一項(xiàng)對(duì)中學(xué)生的流行病學(xué)調(diào)查顯示痤瘡現(xiàn)患率高達(dá)60.21%[2]。痤瘡丙酸桿菌(Cutibacteriumacnes,C.acnes)是痤瘡重要發(fā)病機(jī)制之一,以抗生素治療來降低皮損中C.acnes種群密度,從而達(dá)到治療效果,獲得《中國(guó)痤瘡治療指南》推薦[1]。自1960年由美國(guó)首次報(bào)道分離出C.acnes至抗生素被廣泛應(yīng)用于痤瘡治療,其耐藥性問題日益顯著。C.acnes的抗生素耐藥現(xiàn)象,以大環(huán)內(nèi)酯類和林可酰胺類耐藥問題較為突出,且這兩類藥物抗菌作用機(jī)制相似,二者交叉耐藥現(xiàn)象較為普遍[3]。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)Meta分析[4]顯示,痤瘡丙酸桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的紅霉素、克拉霉素和阿奇霉素耐藥率分別為45%、74%和59%,林可酰胺類的克林霉素耐藥率高達(dá)88%。既往文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥可能與外排泵相關(guān),使用外排泵抑制劑可降低細(xì)菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物紅霉素、克拉霉素和泰利霉素的耐藥性[5]。為此,本研究收集臨床分離的痤瘡丙酸桿菌,使用外排泵抑制劑羰基氰氯苯腙(Carbonyl cyanide-3-chlorophenylhydrazone,CCCP)和(苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺(phenylalanine-arginine β-naphthylamide,PAβN)聯(lián)合大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類抗菌藥物進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn),測(cè)定最小抑菌濃度,觀察外排泵抑制劑是否影響?zhàn)畀彵釛U菌的耐藥性,以期通過外排泵抑制劑降低C.acnes對(duì)大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類抗生素的耐藥性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株C.acnes標(biāo)準(zhǔn)株:ATCC11827,購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心。C.acnes臨床分離株39株:2015年6月—2016年10月來自暨南大學(xué)附屬東莞醫(yī)院痤瘡患者皮損處收集樣本。

1.1.2試劑與儀器 紅霉素(ERY)、阿奇霉素(AZM)、林可霉素(LIN)和克拉霉素(CLA)(中國(guó)食品藥品檢定研究院),鹽酸克林霉素(CLI)(美國(guó)洛杉磯PANPHY化學(xué)公司),CCCP和PAβN(美國(guó)Sigma公司)。VITEK MS plus質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃公司),細(xì)菌多點(diǎn)接種儀(MIT-P型)(日本株式會(huì)社佐久間制所),厭氧培養(yǎng)罐(AJ9050型)和多功能微生物培養(yǎng)系統(tǒng)(Multi-Purpose Incubator型)(廣州市尤德生物科技有限公司),標(biāo)準(zhǔn)混合氣體裝置(CO2:10%,H2:10%,N2:80%)(大連大特氣體有限公司),麥?zhǔn)媳葷岫葍x(BIOMERIEUX DensiCHEK Plus)。

1.2方法

1.2.1菌株復(fù)蘇鑒定 從-70 ℃冰箱中取出菌種,復(fù)蘇后進(jìn)行厭氧血瓊脂平板培養(yǎng)、菌落形態(tài)判斷、革蘭染色鏡檢、純化培養(yǎng)及VITEK MS plus質(zhì)譜分析[6],質(zhì)譜評(píng)分大于2.0為鑒定至種水平。

1.2.2藥敏試驗(yàn) 按照瓊脂稀釋法[7],對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素)和林可酰胺類(克林霉素、林可霉素)設(shè)置0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL濃度梯度布氏血瓊脂平板進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.2.3外排泵抑制試驗(yàn) 根據(jù)藥敏結(jié)果分多重耐藥組、單一耐藥組進(jìn)行外排泵抑制試驗(yàn)。按照瓊脂稀釋法[7],以外排泵抑制劑聯(lián)合抗菌藥物:CCCP+紅霉素,PAβN+紅霉素,CCCP+阿奇霉素,PAβN+阿奇霉素,CCCP+克拉霉素,PAβN+克拉霉素,CCCP+克林霉素,PAβN+克林霉素,CCCP+林可霉素,PAβN+林可霉素。每種抗生素濃度設(shè)置0.062 5、0.125、0.25 、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL (共13個(gè)濃度)制備布氏血瓊脂平板。外排泵抑制劑濃度使用10 μg/mL參考文獻(xiàn)[8]。

1.2.4MIC值 調(diào)節(jié)菌液濁度為0.5麥?zhǔn)蠞岫?相當(dāng)于105CFU/點(diǎn)),使用多點(diǎn)接種儀從低濃度到高濃度依次接種含抗菌藥物系列稀釋濃度平板,接種前后各需接種兩個(gè)空白對(duì)照平板。待平板吸收接種物后,置于厭氧培養(yǎng)罐內(nèi),放入?yún)捬踔甘緞┖痛呋瘎?密閉罐體,使之連接多功能微生物培養(yǎng)系統(tǒng),待罐內(nèi)達(dá)到厭氧環(huán)境,置于36 ℃恒溫箱孵育48 h,測(cè)定藥物MIC值。

1.2.5結(jié)果判讀 藥敏試驗(yàn):抗菌藥物解釋標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI《Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria, approved standard seventh edition》[7]。多重耐藥菌株指對(duì)兩種或以上大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類抗生素耐藥;單一耐藥菌株指僅對(duì)一種大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類抗生素耐藥;敏感菌株指對(duì)大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類抗生素(紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素、林可霉素)均敏感;外排泵抑制試驗(yàn):先觀察只含外排泵抑制劑的平板中細(xì)菌的生長(zhǎng)是否有抑制作用。再觀察外排泵抑制劑聯(lián)合抗菌藥物的平板,藥物MIC值是否降低。外排泵抑制劑聯(lián)合抗菌藥物的MIC結(jié)果判讀參照藥敏試驗(yàn)的步驟。以聯(lián)合外排泵抑制劑后,抗菌藥物MIC值降低≥4倍為外排泵表型陽(yáng)性菌[8-9],即MIC值至少降低兩個(gè)濃度梯度。

2 結(jié)果

2.1鑒定結(jié)果 39株前期收集的凍存菌株,經(jīng)復(fù)蘇、培養(yǎng)、純化、革蘭染色鏡檢、質(zhì)譜鑒定,結(jié)果均為C.acnes(質(zhì)譜鑒定得分均>2.0,細(xì)菌均鑒定至種水平)。

2.2藥敏試驗(yàn)結(jié)果 39株C.acnes的大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果,MIC值詳見表1。耐藥菌29株(74.36%),包括多重耐藥菌株27株(69.23%)和單一耐藥菌株2株(5.13%);敏感菌株10株(25.64%)。

表1 痤瘡丙酸桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類抗生素的MIC值分布情況 (μg/mL,n=39)

2.3外排泵抑制試驗(yàn)結(jié)果 多重耐藥組:CCCP+阿奇霉素篩選出5株外排泵表型陽(yáng)性菌株,CCCP+克拉霉素篩選出2株外排泵表型陽(yáng)性菌株(菌株編號(hào)為27號(hào)、38號(hào),這兩株菌株包含在前述以阿奇霉素為外排底物的外排泵陽(yáng)性的5株菌中),CCCP+紅霉素、克林霉素、林可霉素時(shí),菌株外排泵表型均為陰性;PAβN+克拉霉素篩選出2株外排泵表型陽(yáng)性菌株(菌株編號(hào)為38號(hào)、91號(hào),此38號(hào)菌株與CCCP+克拉霉素外排泵陽(yáng)性菌株38號(hào)菌株一致),PAβN+紅霉素、阿奇霉素、克林霉素、林可霉素時(shí),菌株外排泵表型均為陰性。外排泵表型陽(yáng)性菌株其MIC值變化見表2～3。其中38號(hào)菌以克拉霉素為底物時(shí),聯(lián)合CCCP或PAβN的MIC值均由128 μg/mL降至16 μg/mL。另外,存在部分菌株MIC值僅降低2倍,CCCP+紅霉素有3株菌(MIC值由>256 μg/mL降至256 μg/mL)、CCCP+克拉霉素有1株菌(>256 μg/mL降至256 μg/mL)、PAβN+紅霉素有1株菌(256 μg/mL降至128 μg/mL)、PAβN+克林霉素有7株菌(128 μg/mL降至64 μg/mL)。CCCP或PAβN+林可霉素,藥物MIC未發(fā)生變化。單一耐藥組:以兩種外排泵抑制劑分別聯(lián)合5種抗生素后MIC值未發(fā)生變化,菌株外排泵表型均為陰性。

表2 使用CCCP前后外排泵表型陽(yáng)性菌株MIC (μg/mL)

表3 使用PAβN前后外排泵表型陽(yáng)性菌株MIC (μg/mL)

3 討論

痤瘡是皮膚科常見病,C.acnes通過天然免疫和獲得性免疫參與了痤瘡的發(fā)生發(fā)展,是痤瘡重要發(fā)病機(jī)制之一[1]。然而,近十年來,國(guó)內(nèi)不斷有C.acnes的耐藥報(bào)道[4]。本研究中39株臨床分離的痤瘡丙酸桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺耐藥率為74.36%(29/39),與2019年國(guó)內(nèi)一項(xiàng)痤瘡患者皮損中痤瘡丙酸桿菌對(duì)抗生素耐藥性的Meta分析報(bào)道高耐藥率結(jié)果相似[4]。C.acnes高耐藥性的產(chǎn)生,可導(dǎo)致痤瘡治療失敗、皮膚微生物菌群紊亂、局部和系統(tǒng)條件致病菌感染和耐藥株傳播等不良影響[10]。因此,降低C.acnes耐藥性對(duì)痤瘡治療具有重要意義。

細(xì)菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類耐藥的機(jī)制主要有三種:①外排泵;②滅活酶;③基因變異或攜帶耐藥基因。既往關(guān)于痤瘡丙酸桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類耐藥的機(jī)制主要集中于耐藥基因ermX和23S rRNA點(diǎn)突變[11]。然而,罕見C.acnes外排泵相關(guān)耐藥機(jī)制報(bào)道。外排泵是在細(xì)菌細(xì)胞膜上的一些轉(zhuǎn)運(yùn)膜蛋白,這些膜蛋白通過主動(dòng)耗能改變自身構(gòu)象,將藥物選擇性或非選擇性地泵出細(xì)菌細(xì)胞外,使達(dá)到作用靶位的抗菌藥物濃度顯著降低而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥[12]。通過使用外排泵抑制劑可抑制外排泵的活性,達(dá)到降低耐藥菌株耐藥性的效果,CCCP與PAβN是目前使用較多的外排泵抑制劑。CCCP是一種氧化磷酸化抑制劑,是線粒體質(zhì)子載體解偶聯(lián)劑,可增加線粒體膜對(duì)質(zhì)子的通透性,從而破壞線粒體膜電位,使外排轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)因能量缺乏而主動(dòng)外排作用受限,導(dǎo)致抗菌藥物在菌體內(nèi)蓄積,從而提高細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性[13]。PAβN則通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上的結(jié)合位點(diǎn),以阻止進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)的抗菌藥物及其他底物與該位點(diǎn)的結(jié)合,減少藥物的外排,使細(xì)菌內(nèi)藥物濃度不受外排泵的影響,提高抗菌藥物的效果[14]。

本研究采用CCCP和PAβN兩種外排泵抑制劑,分別聯(lián)合大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素)及林可酰胺類(克林霉素、林可霉素)進(jìn)行外排泵抑制試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在多重耐藥組C.acnes中存在外排泵表型陽(yáng)性菌株:以CCCP+阿奇霉素篩選出5株外排泵表型陽(yáng)性菌株,MIC值由>256 μg/mL降至<0.062 5 μg/mL,細(xì)菌由耐藥變?yōu)槊舾?CCCP+克拉霉素篩選出2株外排泵表型陽(yáng)性菌株(編號(hào)為27、38號(hào)包含在前述5株菌中)。其中27號(hào)、38號(hào)菌在CCCP作用下,阿奇霉素、克拉霉素的MIC值降低≥4倍,說明CCCP對(duì)這兩株菌的外排轉(zhuǎn)運(yùn)阿奇霉素和克拉霉素的外排泵具有顯著的抑制作用。與Deng等[15]報(bào)道結(jié)果相似,CCCP對(duì)篩選外排泵陽(yáng)性菌株及降低菌株耐藥性方面較PAβN更有優(yōu)勢(shì)。本研究PAβN+克拉霉素也篩選出2株菌外排泵表型陽(yáng)性菌株,但與CCCP+克拉霉素篩選的菌株不完全一致,其中38號(hào)菌是共有的,均表現(xiàn)出外排泵抑制現(xiàn)象。38號(hào)菌在PAβN作用下,克拉霉素的MIC值由128 μg/mL降至16 μg/mL,但阿奇霉素的MIC值并未發(fā)生變化,提示CCCP對(duì)外排泵的抑制作用較PAβN更廣譜,這可能與CCCP和PAβN的作用機(jī)制不同相關(guān),CCCP作為一種氧化磷酸化抑制劑,廣泛影響外排泵的能量供應(yīng)從而抑制外排泵作用,而PAβN則需競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合某種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)才能起抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)耐藥性C.acnes中存在外排泵導(dǎo)致耐藥,外排泵抑制劑CCCP和PAβN能一定程度上降低多重耐藥痤瘡丙酸桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類抗生素的耐藥性。但文獻(xiàn)報(bào)道的外排泵系統(tǒng)種類繁多、機(jī)制復(fù)雜,不同細(xì)菌對(duì)同種抗生素或同種細(xì)菌對(duì)不同抗生素的外排作用可由不同的外排泵參與[12],未來研究重點(diǎn)是痤瘡丙酸桿菌的多重耐藥與哪些外排泵相關(guān),總而言之,本研究為解決C.acnes耐藥的藥物開發(fā)提供一定參考。