產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測方法研究進展

王建東，王景松,，王健霖，李繼東，郭亞男*

（1.寧夏農(nóng)林科學院 動物科學研究所，寧夏 銀川 750002；2.寧夏大學 動物科技學院，寧夏 銀川 750021）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）又稱產(chǎn)氣莢膜芽孢桿菌、魏氏芽孢桿菌和魏氏梭菌，是一種革蘭氏陽性專性厭氧桿菌，可形成芽孢，不能運動[1-2]。產(chǎn)氣莢膜梭菌在環(huán)境中分布廣泛，包括污染的水、食物和土壤中。產(chǎn)氣莢膜梭菌也是人和其他動物胃腸道微生物群的組成部分，屬于條件致病菌。在臨床上，人和動物的氣性壞疽、食物中毒、非食源性腹瀉、腸炎和腸毒血癥等疾病都與產(chǎn)氣莢膜梭菌有一定關(guān)系[3-4]。產(chǎn)氣莢膜梭菌致病性與其能產(chǎn)生20余種毒素和酶，即α、β、ε、ι、腸毒素、NetB、κ、μ、θ、PFO和β2等[1,5-6]是密不可分的，而且大多數(shù)疾病都由這些毒素中的一種或多種介導(dǎo)。由于不同菌株所產(chǎn)生的毒素有很大不同，這種差異性使得產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株可以根據(jù)所產(chǎn)生的毒素進行分類，這種分型方式稱為毒素分型。Rood等[7]對毒素分型方案進行了修改和補充，根據(jù)α、β、ε、ι、腸毒素和NetB 6種主要毒素，將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為7種毒素類型，即A型（產(chǎn)α毒素）、B型（產(chǎn)α、β、ε毒素）、C型（產(chǎn)α、β毒素，部分產(chǎn)cpe）、D型（產(chǎn)α、ε毒素，部分產(chǎn)cpe）、E型（產(chǎn)α、ι，部分產(chǎn)cpe）、F型（產(chǎn)α、cpe）和G型（產(chǎn)α、NetB）。不同類型的產(chǎn)氣莢膜梭菌對動物所產(chǎn)生的影響有所不同，所以需準確判斷產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素類型。因此，本文對目前產(chǎn)氣莢膜梭菌主要毒素的檢測方法進行總結(jié)，為后續(xù)快速診斷方法的建立以及相關(guān)研究提供一定參考。

1 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測方法研究進展

產(chǎn)氣莢膜梭菌引起動物感染發(fā)病的主要因素取決于細菌產(chǎn)生的外毒素和酶。為控制產(chǎn)氣莢膜梭菌病的傳播，減少或避免給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成的嚴重經(jīng)濟損失，必須快速且準確地確定該菌的毒素基因型。臨床上一般通過了解病史、臨床癥狀和病理剖檢等對是否患有產(chǎn)氣莢膜梭菌病作出初步判斷，但確診還需要進行實驗室診斷。實驗室診斷方法目前主要包括微生物學檢測法、免疫學檢測法以及分子生物學檢測法。

1.1 微生物學方法

實驗室微生物學方法是將樣品進行預(yù)處理，接種至專性培養(yǎng)基37 ℃厭氧培養(yǎng)18～24 h后，挑取疑似菌落進行擴大培養(yǎng)，革蘭氏染色鏡檢，最后通過生化試驗等進行確認。產(chǎn)氣莢膜梭菌的微生物學檢測方法可以參考GB 4789.13—2012《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗》中的緩沖動力-硝酸鹽試驗、乳糖-明膠以及含鐵牛乳發(fā)酵試驗進行復(fù)檢確認，也可以利用反向CAMP試驗：用無乳鏈球菌在血平板上劃線，疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌的樣品垂直于無乳鏈球菌劃線，厭氧培養(yǎng)24～48 h后，由于協(xié)同溶血作用，將形成一個“蝴蝶結(jié)”帶，即可驗證。

1.2 免疫學方法

免疫學方法是利用特異性免疫原理建立的檢測方法。與細菌學診斷方法相比，具有取樣便捷、樣品用量少、可靠性強、靈敏度高、便于操作等優(yōu)點[8]。毒素中和試驗是最早和最經(jīng)典的檢測方法之一。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）屬于免疫學方法中的一種重要檢測方法。王武斌等[9]以純化的產(chǎn)氣莢膜梭菌etx毒素重組蛋白作為包被抗原，構(gòu)建了etx毒素間接ELISA檢測方法，其血清靈敏度為1∶3 200，靈敏度和特異性良好。馬玲玲等[10]以產(chǎn)氣莢膜梭菌CPB1毒素作為包被抗原，建立了CPB1抗體的間接ELISA檢測方法，其特異性、靈敏度和重復(fù)性均較高。cpa毒素、β1毒素、β2毒素等均已作為包被抗原被構(gòu)建為產(chǎn)氣莢膜梭菌的間接ELISA檢測方法[11-13]。陳長俊等[14]以抗α毒素單克隆抗體為捕獲抗體，抗α毒素多克隆抗體為檢測抗體，建立了檢測α毒素的雙抗夾心ELISA（DAS-ELISA）檢測方法，其特異性、靈敏度良好。

1.3 分子生物學技術(shù)

隨著近些年科研水平的不斷提高，分子生物學也得到了快速發(fā)展，將分子生物學技術(shù)應(yīng)用于病原分析鑒定也越來越廣泛。實驗室診斷技術(shù)也從常規(guī)的微生物學檢測和免疫學檢測發(fā)展為分子生物學檢測。分子生物學檢測技術(shù)除了傳統(tǒng)的基礎(chǔ)PCR方法外，還出現(xiàn)了多重PCR、熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loopmediated isothermal amplification，LAMP）以及重組酶聚合酶擴增（Recombinase polymerase amplification，RPA）等新型分子生物學技術(shù)手段，利用這些方法可以鑒定細菌菌型以及判定其致病性。

1.3.1 16S rRNA PCR技術(shù) 16S rRNA基因序列全長約1 500 bp，是原核生物中編碼核糖體16S rRNA的DNA序列，存在于細菌、支原體等所有原核生物中，因具有特異性和穩(wěn)定性，常用于原核生物的初步鑒定。在PCR中使用全長16S rRNA通用引物進行基因擴增并測序，將測序結(jié)果進行生物信息學鑒定，基于序列相似性＞97%來指定分類學，在檢測食品中的產(chǎn)氣莢膜梭菌中也有所應(yīng)用[15]。

1.3.2 普通PCR技術(shù) 普通PCR技術(shù)又稱聚合酶鏈式反應(yīng)，是在生物體外進行特殊的DNA復(fù)制，通常利用變性、退火、延伸三步法進行體外擴增。1993年，F(xiàn)ach P等[16]建立了產(chǎn)氣莢膜梭菌cpa毒素的檢測方法，可直接用于糞便樣本的檢測。Uzal等[17]針對產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β、ε和ι 4種毒素基因設(shè)計了4對特異性引物，分別進行PCR擴增反應(yīng)，可用于檢測不同類型的產(chǎn)氣莢膜梭菌。2004年，梁光軍等[18]建立了可擴增α毒素全基因的PCR檢測方法。單一PCR每次只能擴增1種靶基因，因此對產(chǎn)氣莢膜梭菌定型就需要多次反應(yīng)。于是，1次反應(yīng)即可檢測多個靶基因的多重PCR技術(shù)應(yīng)運而生。

1.3.3 多重PCR技術(shù) 多重PCR技術(shù)是在單一PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來的PCR技術(shù)，其特點是能夠在反應(yīng)體系中加入多種引物，從而擴增出多條帶的PCR方法。其原理與單一PCR基本相同。2004年，Baums等[19]建立的多重PCR，利用高溫將產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液裂解作為模板進行產(chǎn)氣莢膜梭菌cpa、cpb、etx、ia、cpb2和cpe毒素基因的檢測，減少了提取產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組的步驟，極大地節(jié)省了檢測時間。2005年，Heikenheimo等[20]通過經(jīng)典毒素試驗和多重PCR證實了2種方法對C.perfringens的分型結(jié)果一致，并且其特異性和敏感性均比毒素中和試驗高。張凱川等[21]以產(chǎn)氣莢膜梭菌cpa基因、艱難梭菌Glud基因、脆弱擬桿菌Lue基因為靶基因，建立了快速檢測厭氧菌引起的細菌性腹瀉多重PCR檢測方法，其最低檢測下限分別為1.6×10-2pg/μL、0.7 pg/μL和2.8 pg/μL。唐娜等[22]以小反芻獸疫病毒N蛋白基因和產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因建立了雙重PCR檢測方法，檢測下限分別達到0.001 TCID50/mL和10 個CFU/mL，實現(xiàn)了小反芻獸疫病毒與產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒別診斷。2013年，董潔等[23]根據(jù)α、β、ε、ι毒素基因序列構(gòu)建了C.perfringens定型的菌落多重PCR，可以鑒定A、B、C、D、E 5個型，并對106份樣本進行檢測，鑒定出30株C.perfringensA型。2022年，繆西鵬等[24]以產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β、ε、ι毒素的基因序列為靶基因，構(gòu)建四重PCR檢測方法，通過對樣本檢測并與GB 4789.13—2012《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗》進行對比，結(jié)果高度一致。張凱悅[25]建立了cpa、cpb、etx、itx、cpe和netB毒素基因的六重PCR，通過對34株已知樣品進行檢測，結(jié)果與菌株的分型一致。多重PCR技術(shù)簡單、經(jīng)濟，通過1次反應(yīng)即可檢測出多種靶基因，不僅節(jié)省試劑和時間，而且能達到理想的對比效果，從而準確鑒別產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素類型[26]。

1.3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù) LAMP是一種新型的核酸擴增技術(shù)。該技術(shù)主要依靠一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在恒溫條件下快速擴增DNA，既有較高的特異性，又具備較高的擴增效率，而且反應(yīng)時間只需1 h左右[27]。王朋沖等[28]建立了快速檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的LAMP檢測方法，靈敏度高，對產(chǎn)氣莢膜梭菌的DNA檢測下限為10 ng/L，對產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液的檢測下限為3.7×102CFU/mL，比普通PCR靈敏10～100倍；反應(yīng)時間為62 ℃水浴40 min，80 ℃ 10 min終止反應(yīng)，對牛糞便樣品、飼料和飲水進行檢測時，檢出率為19.61%，與PCR檢測和細菌分離鑒定結(jié)果一致。Radhika B等[29]利用自身構(gòu)建的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的LAMP檢測方法，對120份疑似腸毒血癥糞便樣本進行檢測，LAMP和PCR檢測cpa毒素基因，112份（93.3%）陽性，檢測結(jié)果一致，靈敏度相同。

1.3.5 重組酶聚合酶擴增 RPA是一種恒溫核酸擴增技術(shù)，主要利用重組蛋白酶和單鏈結(jié)合蛋白等物質(zhì)參與反應(yīng)，可在37 ℃左右條件下30 min內(nèi)完成對靶基因的檢測，無需高溫變性、退火、延伸等步驟。該技術(shù)具有特異性強、靈敏度高等特征，目前已被廣泛應(yīng)用于多種食源性致病菌的快速檢測。許笑等[30]以產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的編碼基因plc為靶基因進行引物和探針設(shè)計，建立了雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌的real-time RPA快速診斷技術(shù)，該方法可在38 ℃、25 min內(nèi)完成檢測，檢測下限為1×10 copies/L，并且與qPCR檢測方法檢測結(jié)果一致，但比qPCR的檢測時間縮短了近一半。劉立兵等[31]以保守性強的產(chǎn)氣莢膜梭菌plc基因序列為靶基因，建立了實時熒光RPA檢測方法，其檢測下限為1.3 pg/μL和1.0×102CFU/mL，只需要3～13 min即可完成樣品檢測，特異性強，操作方便。

RPA在引物設(shè)計上要求高，引物序列長度控制在30～35 bp，擴增片段大小在100～500 bp，擴增效率更高，但也有學者將擴增片段設(shè)計到1 000 bp，也可擴增出靶基因片段。同時RPA較高的靈敏度使其極易出現(xiàn)污染或假陽性。目前為止還未研發(fā)出專門用于設(shè)計RPA的引物軟件。

1.3.6 TaqMan熒光定量PCR TaqMan熒光定量PCR以其探針的特異性可用于多種靶基因檢測，已廣泛應(yīng)用于科學研究、食品檢測、臨床醫(yī)學檢測與診斷等領(lǐng)域[32-34]。2004年，Wise等[35]建立的產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rRNA熒光定量PCR，可檢測50 fg產(chǎn)氣莢膜梭菌菌體。2007年，Gurjar等[36]構(gòu)建了產(chǎn)氣莢膜梭菌cpa、cpb、etx、ia、cpb2和cpe多毒素二重TaqMan熒光定量PCR，其分別以cpa和cpb2、cpb和etx以及ia和cpe三個體系同時進行，對307份牛糞便進行檢測，檢測結(jié)果顯示，cpa、cpb、ia、etx、cpb2和cpe毒素基因分別檢測到68份（28.2%）、6份（2.5%）、6份（2.5%）、4份（1.6%）、164份（68%）和11份（4.6%）。2011年，石玉玲等[37]以產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rRNA為目的基因，構(gòu)建了產(chǎn)氣莢膜梭菌TaqMan熒光定量PCR，對純菌液的檢測下限為9×102CFU/mL，可對氣性壞疽快速診斷進行準確報告。2016年，張蓉蓉等[38]以產(chǎn)氣莢膜梭菌α和cpe毒素為目的基因，構(gòu)建雙重熒光定量PCR方法，其靈敏度、特異性、重復(fù)性均較好。2017年，鄭萍等[39]針對水中產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因構(gòu)建單重熒光定量PCR檢測方法，其靈敏度達到10 copies/μL，對16種細菌進行特異性驗證均為陰性。2020年，李一鳴等[40]對產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β、ε毒素基因序列設(shè)計特異性引物和TaqMan探針，構(gòu)建了可鑒定羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌A、B、C和D型的三重熒光定量PCR檢測方法，其靈敏度可達到1×102copies/μL。2020年，學者根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌高度保守的plc基因設(shè)計特異性引物和探針，建立了產(chǎn)氣莢膜梭菌的實時熒光定量PCR，其檢測下限為1.3 pg/μL和1.0×102CFU/mL，僅需24～46 min（Ct值為17.45～33.65）即可完成檢測，其特異性強、靈敏度高、操作方便[31]。2021年，劉嘉琳等[41]對豬大腸桿菌irp2基因、沙門氏菌fim基因和產(chǎn)氣莢膜梭菌plc基因進行特異性引物和探針設(shè)計，構(gòu)建了同時檢測3種病原的多重熒光定量PCR檢測方法，其產(chǎn)氣莢膜梭菌最低檢測下限為4.37×103copies/μL。

2 結(jié)語

隨著新型技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，有關(guān)產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測方法的研究也日益深入，本文對目前產(chǎn)氣莢膜梭菌主要檢測方法進行了總結(jié)，每種檢測方法均有一定的優(yōu)缺點，相信隨著科技的不斷進步，產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測方法也會日益完善。