噬菌體清除沙門氏菌生物被膜應(yīng)用研究進(jìn)展

郝柳杭，謝自強(qiáng)，宋瑞銘，尹鼎澤，李 悅，黃洋鈴，張占麗，張永英*

（ 1. 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056000 ；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100 ； 3. 館陶縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 邯鄲 056000 ）

沙門氏菌在自然界中廣泛分布，是一種常見(jiàn)的食源性致病菌。沙門氏菌不僅以感染畜禽作為傳染源，通過(guò)水平傳播和垂直傳播兩種方式在動(dòng)物間傳播，還可通過(guò)食品等途徑感染人，從而引起食源性疾病[1]。自然界中，沙門氏菌大多以生物被膜形式存在，附著于飲水設(shè)備、醫(yī)療設(shè)備、食品加工設(shè)備等載體表面，約80%的慢性感染均與生物被膜的形成有關(guān)[2]。由此可見(jiàn)，沙門氏菌生物被膜是造成公共衛(wèi)生安全事件的主要因素之一。生物被膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜，細(xì)菌細(xì)胞被自身產(chǎn)生的胞外聚合物（EPS）包圍。EPS結(jié)構(gòu)不僅增強(qiáng)了其抵抗吞噬細(xì)胞、殺傷細(xì)胞的能力，也妨礙了細(xì)菌與抗菌藥物和細(xì)菌菌團(tuán)的接觸，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生。與浮游態(tài)沙門氏菌相比，生物被膜形態(tài)沙門氏菌更難清除[3]。因此，研究新型安全無(wú)污染生物被膜的清除劑刻不容緩。在禁抗背景下，噬菌體因具有抗菌作用而受到了廣泛關(guān)注。噬菌體侵染宿主菌時(shí)，自身編碼的解聚酶和溶素可降解多糖和肽聚糖，破壞EPS結(jié)構(gòu)，裂解生物被膜。同時(shí)，解聚酶還可降解細(xì)菌細(xì)胞壁上的多糖化合物，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，幫助噬菌體與宿主菌結(jié)合，更好地裂解宿主菌[4]。本文總結(jié)了沙門氏菌生物被膜、噬菌體的研究進(jìn)展，總結(jié)噬菌體裂解細(xì)菌生物被膜的作用機(jī)制及相關(guān)應(yīng)用，以期為噬菌體在沙門氏菌臨床防控中的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 沙門氏菌生物被膜的相關(guān)研究進(jìn)展

1.1 沙門氏菌生物被膜形成

自然界中，沙門氏菌大多以生物被膜（biofilm）的形式存在。生物被膜是由微生物的細(xì)胞及其分泌的聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）所組成的多細(xì)胞復(fù)合體，在微生物的生長(zhǎng)過(guò)程中附著于載體的表面而形成[5]。生物被膜的形成極大地提高了沙門氏菌在自然環(huán)境中的生存能力[3]。EPS對(duì)生物被膜的穩(wěn)定性具有很大的影響，其主要組成成分為多糖和肽聚糖[6]。此外，載體材料、胞外多糖、胞外蛋白、胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）在生物被膜形成過(guò)程中也發(fā)揮了很大的作用，是維持生物被膜穩(wěn)定性的重要組成部分。生物被膜形成和發(fā)展過(guò)程可分為5 個(gè)階段：黏附、定植、發(fā)育、成熟、主動(dòng)擴(kuò)散[7]。不同階段的細(xì)菌具有不同的特點(diǎn)，黏附期細(xì)菌為可逆地吸附到物體表面，但當(dāng)細(xì)菌到達(dá)定植期時(shí)，吸附作用轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡?，而后逐漸產(chǎn)生更難清除的EPS結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)[8]。

1.2 沙門氏菌生物被膜形成的影響因素

生物被膜的形成因子可分為與細(xì)胞表面相關(guān)和胞外分泌兩大類，其中與細(xì)胞表面相關(guān)的因子包括鞭毛、菌毛、功能性蛋白質(zhì)等；與胞外分泌相關(guān)的包括胞外多糖、蛋白質(zhì)、eDNA、eRNA 等[7]。不同組分在生物被膜形成過(guò)程中起到不同作用，以下主要介紹5種組分的作用。

（1）鞭毛：在生物被膜形成的初始階段，需要依靠鞭毛的運(yùn)動(dòng)性[9]。生物被膜形成過(guò)程中的鞭毛功能可在兩個(gè)階段進(jìn)行調(diào)節(jié)：在組裝階段可通過(guò)一系列轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子進(jìn)行調(diào)節(jié)；在組裝后階段可通過(guò)效應(yīng)蛋白和運(yùn)動(dòng)蛋白之間的相互作用進(jìn)行調(diào)節(jié)[10]。鞭毛存在于生物被膜形成的各個(gè)階段，并在生物被膜的結(jié)構(gòu)中形成類似支架的結(jié)構(gòu)，比缺乏鞭毛的生物被膜結(jié)構(gòu)更難清除[11]。

（2）菌毛（fimbriae）：腸桿菌科中的Ⅰ型菌毛（fimACDH基因簇）和Ⅲ型菌毛（mrkABCD基因簇）在細(xì)菌生理學(xué)中起到多種作用，包括附著、侵襲、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及生物被膜形成[12]。Guo等[13]在123株大腸桿菌強(qiáng)陽(yáng)性菌株中檢測(cè)到49.59%菌株含有mrkABCD基因簇，14.64%菌株含有fimACDH基因簇；而將強(qiáng)陽(yáng)性菌株中的mrkABCDF和fimACDH基因簇克隆并導(dǎo)入中等陽(yáng)性菌株質(zhì)粒載體內(nèi)，最終中等陽(yáng)性菌株均轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)陽(yáng)性菌株。

（3）胞外多糖：胞外多糖是EPS的主要組成成分，對(duì)生物被膜形成具有重要影響[14]。胞外多糖有助于生物被膜附著于載體表面，幫助鈣鎂離子結(jié)合，使生物被膜結(jié)構(gòu)更加緊密，抵御抗菌劑滲透[15-16]。一些清除生物被膜的酶制劑也是依靠溶解生物被膜EPS 中的多糖骨架清除生物被膜[17]。

（4）蛋白質(zhì)：外膜蛋白（outer membrane protein，OmpS）不僅是細(xì)菌重要的毒力因子，對(duì)細(xì)菌的黏附、侵襲、生物被膜形成、生物被膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定也具有重要作用[18]。外膜蛋白的β-桶狀蛋白結(jié)構(gòu)使其在生物被膜中具有極高的穩(wěn)定性，使生物被膜能夠抵抗惡劣環(huán)境[19]。

（5）eDNA：eDNA 結(jié)構(gòu)主要由DNA 結(jié)合蛋白家族（DNABII）中整合宿主因子（integrated host factor，IHF）和組蛋白樣蛋白（histone-like protein，HP）維持[20]。這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞外是穩(wěn)定eDNA交叉鏈結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵蛋白，而穩(wěn)定的eDNA 結(jié)構(gòu)在生物被膜EPS 結(jié)構(gòu)中類似霍利迪連接（Holliday junctions），增強(qiáng)了生物被膜穩(wěn)定性[21]。Rocco等[22]用特異性抗體靶向去除DNABⅡ蛋白后，發(fā)現(xiàn)生物被膜清除效果明顯。Buzzo 等[23]研究表明，eDNA 為罕見(jiàn)的Z 型DNA，隨著生物被膜的生長(zhǎng)而積累，并在積累過(guò)程中完善生物被膜結(jié)構(gòu)的完整性，促進(jìn)生物被膜形成。

1.3 沙門氏菌生物被膜的危害

以生物被膜形態(tài)存在的細(xì)菌可黏附于各種載體表面，而當(dāng)微生物所處環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，生物被膜內(nèi)細(xì)菌可由一個(gè)微菌落轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌中，從而脫離生物被膜進(jìn)行擴(kuò)散。由于生物被膜的形成是動(dòng)態(tài)過(guò)程，且各細(xì)菌的發(fā)展位于不同的時(shí)間和空間，所以其生理活性和基因表達(dá)具有不均質(zhì)性[8]，并使生物被膜具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和代謝方式[24]。此外，生物被膜的不均質(zhì)性導(dǎo)致生物被膜亞群之間具有生理性的異質(zhì)性，與浮游細(xì)胞相比，生物被膜結(jié)構(gòu)更難清除，也更具有抗性[5]。Wang等[25]研究表明，與浮游形態(tài)中存在的沙門氏菌相比，以生物被膜形式存在的沙門氏菌對(duì)抗菌劑的敏感性更低。細(xì)菌形成生物被膜后，由于外部黏性基質(zhì)的保護(hù)，殺菌藥物僅能殺死生物被膜表層細(xì)菌和浮游細(xì)菌，因此其抵抗吞噬細(xì)胞、殺傷細(xì)胞等的能力大大提高。同時(shí)生物被膜活性較低、生長(zhǎng)較慢的特性促進(jìn)了抗生素耐藥基因交換，更易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生抗生素耐藥性[26]。沙門氏菌生物被膜形成對(duì)于沙門氏菌的生存具有重要作用。

1.4 傳統(tǒng)生物被膜的清除方法

生物被膜的清除方法已成為當(dāng)下研究的一大熱點(diǎn)，常見(jiàn)的有物理方法和化學(xué)方法和微生態(tài)制劑法。

生物被膜很容易黏附于醫(yī)療器械、生物管腔、器官表面等，且難以清除。孫惠惠等[27]研究?jī)?nèi)鏡硬式管腔生物被膜清除方法時(shí)，利用40 kHz 超聲波清洗內(nèi)鏡管腔，銅綠假單胞桿菌清除率達(dá)99%。Carmen等[28]研究表明，超聲波促進(jìn)了慶大霉素導(dǎo)入大腸桿菌生物被膜。生物被膜外部黏性基質(zhì)阻礙了抗菌藥物的導(dǎo)入，但是超聲波可促進(jìn)抗生素導(dǎo)入，提高了抗菌藥物對(duì)于生物被膜的清除效果。超聲波法對(duì)生物被膜具有良好的清除作用，但與儀器管腔不同，養(yǎng)殖場(chǎng)常見(jiàn)飲水管道長(zhǎng)，且常位于地底或墻內(nèi)等位置，不易于超聲波清除生物被膜。

抗生素、消毒劑等是常見(jiàn)的清除生物被膜的方法[29]。養(yǎng)殖人員會(huì)施用沙門氏菌敏感抗生素或消毒劑清除沙門氏菌生物被膜[30]，但由于生物被膜外部黏性基質(zhì)對(duì)生物被膜的保護(hù)作用可阻礙抗菌藥物導(dǎo)入，抗生素或消毒劑往往只能作用于生物被膜表層細(xì)菌，不能破壞生物被膜的EPS結(jié)構(gòu)，無(wú)法清除生物被膜[31]。

益生元和抗菌肽等是常見(jiàn)的防控沙門氏菌的生物制劑，可有效防止沙門氏菌定植，避免生物被膜形成，但二者發(fā)揮效用的條件比較苛刻，制造成本較高，不適用于環(huán)境中生物被膜的防控與清除[32-33]。

隨著沙門氏菌耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重，尋找一個(gè)新型、有效、安全、方便的抑制生物被膜形成和裂解沙門氏菌生物被膜的方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

2 噬菌體及其裂解生物被膜的作用

2.1 噬菌體的特性及應(yīng)用進(jìn)展

噬菌體是一種特殊的細(xì)菌“病毒”，可將宿主菌裂解。自然界中，有細(xì)菌生存的地方就有噬菌體的存在，數(shù)量十分龐大。噬菌體可分為裂解性噬菌體和溫和性噬菌體，裂解性噬菌體可特異性地感染某些細(xì)菌，并將其裂解；溫和性噬菌體也稱作溶原性噬菌體，是將自身DNA 與宿主菌的DNA 整合，使其與宿主菌的DNA 一同復(fù)制，這個(gè)過(guò)程也可稱作“溶原轉(zhuǎn)換”[34]。噬菌體具有較高的溫度耐受力和較強(qiáng)的耐酸性，且尚未發(fā)現(xiàn)噬菌體會(huì)對(duì)生物機(jī)體產(chǎn)生明顯毒性，因而對(duì)噬菌體藥物的研究具有可行性[35]。

1921年，學(xué)界第一次報(bào)道了人類疾病治療中應(yīng)用噬菌體[36]。但由于抗生素的發(fā)展與使用，噬菌體的研究被慢慢擱置。近年來(lái)，日益嚴(yán)重的耐藥性問(wèn)題使得噬菌體療法重新被人們重視，許多研究人員開(kāi)始利用噬菌體治療細(xì)菌疾病。目前，噬菌體療法主要分為全噬菌體療法與裂解酶制劑療法兩個(gè)方向[37]。噬菌體療法還應(yīng)用于沙門氏菌、大腸桿菌、彎曲桿菌等多種細(xì)菌性疾病的治療中[38-40]。

2.2 噬菌體裂解細(xì)菌生物被膜機(jī)制

噬菌體復(fù)制需要依賴宿主細(xì)菌，當(dāng)噬菌體侵染細(xì)菌時(shí)，自身編碼多種酶，損害細(xì)菌的屏障。雖然噬菌體可能受到EPS基質(zhì)的影響，但其編碼的解聚酶和溶素可降解多糖和肽聚糖，從而破壞EPS結(jié)構(gòu)，協(xié)助噬菌體傳播，裂解細(xì)菌生物被膜[6]，因此噬菌體仍然能夠在生物被膜內(nèi)傳播和復(fù)制，避免生物被膜的抗吞噬性，從而更好地殺滅細(xì)菌[41]。當(dāng)增殖周期結(jié)束時(shí)，噬菌體會(huì)在宿主細(xì)胞內(nèi)合成內(nèi)溶素，直接靶向細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖（peptidoglycan，PG）中的鍵，特異性地裂解細(xì)菌[42]；解聚酶還可識(shí)別、結(jié)合、降解細(xì)菌細(xì)胞壁上的多糖化合物，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，暴露受體，使噬菌體更易與宿主菌結(jié)合[43]。

2.3 噬菌體裂解細(xì)菌生物被膜的應(yīng)用

2.3.1 噬菌體裂解細(xì)菌生物被膜在外部環(huán)境中的應(yīng)用

生物被膜具有黏附特性，在飼料儲(chǔ)存場(chǎng)所、飼料傳送帶、飲水管道等多處飼料飲水可接觸表面可以檢出沙門氏菌。Korzeniowski 等[44]在試驗(yàn)中利用噬菌體清除96 孔板和不銹鋼表面的沙門氏菌生物被膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)清除率分別為32%～69%和52%～98%。有研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體可顯著減少96孔板（32%～69%）和不銹鋼表面（52%～98%）的沙門氏菌生物被膜，此外，他們通過(guò)人工感染家禽飲水器，來(lái)模擬自然界中沙門氏菌生物被膜的形成環(huán)境，發(fā)現(xiàn)噬菌體不僅顯著減少飲水器表面的沙門氏菌數(shù)量，還通過(guò)飲水來(lái)治療家禽沙門氏菌體內(nèi)感染[45]。Gong 等[46]在研究噬菌體清除工人靴子上的沙門氏菌污染時(shí)，通過(guò)對(duì)比研究實(shí)驗(yàn)室條件和工作環(huán)境中沙門氏菌生物被膜的清除效果，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室條件下，經(jīng)噬菌體處理，橡膠鞋底模板和靴子上沙門氏菌生物被膜分別減少了95.100%～99.999% 和91.5%～99.2%；在工作環(huán)境中，經(jīng)噬菌體、噬菌體+次氯酸鈉和噬菌體+擦洗等3 種處理后，工人靴子上的沙門氏菌數(shù)量分別減少了84.2%、92.9%和93.2%。兩次結(jié)果均表明噬菌體可有效減少工人靴子上的沙門氏菌污染。

2.3.2 噬菌體裂解細(xì)菌生物被膜在細(xì)菌性疾病治療中的應(yīng)用

Song 等[47]在噬菌體清除金黃葡萄球菌生物被膜的研究中表明，噬菌體不僅可清除金黃葡萄球菌生物被膜，還會(huì)在侵染細(xì)菌的過(guò)程中成倍增加，使其裂解生物被膜、殺滅細(xì)菌的能力大大增強(qiáng)。醫(yī)院常見(jiàn)糞腸球菌感染，常附著于各種醫(yī)療設(shè)備，傳播范圍廣，研究人員利用噬菌體清除耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌生物被膜，發(fā)現(xiàn)生物被膜生成量減少了2/3，提示噬菌體可有效去除耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌生物被膜[48]。Kunz 等[49]嘗試將噬菌體與抗生素聯(lián)用清除多重耐藥糞腸球菌生物被膜，分別利用氨芐青霉素、達(dá)托霉素、氨芐青霉素+達(dá)托霉素、單噬菌體、噬菌體混合物、噬菌體+抗生素組合的方法分析達(dá)托霉素耐藥菌株生物被膜的清除效果。結(jié)果表明，最佳清除方案為達(dá)托霉素+氨芐青霉素+噬菌體混合物，可完全清除生物被膜形態(tài)的糞腸球菌，且氨芐青霉素與任何噬菌體聯(lián)用均可呈現(xiàn)良好的生物被膜清除效果。Esmael等[50]研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體混合物可減少鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌生物被膜的形成。Webber等[51]研究發(fā)現(xiàn)，單一噬菌體或噬菌體雞尾酒均可減少沙門氏菌生物被膜的形成，噬菌體雞尾酒的能力更加顯著，清除率可達(dá)83.4%。

2.3.3 噬菌體裂解細(xì)菌生物被膜在食品行業(yè)中的應(yīng)用

消除食品中沙門氏菌及其生物被膜的方法主要是使用殺菌劑、化學(xué)消毒劑、熱處理或其他特殊防腐劑，但這些方法不僅會(huì)影響食物的食用口感，甚至?xí)斐苫瘜W(xué)試劑殘留，進(jìn)而影響人類健康。

近年來(lái)，許多學(xué)者對(duì)噬菌體減少食品中沙門氏菌污染進(jìn)行研究。在水、牛奶、雞胸肉、洋蔥等常見(jiàn)食品的研究中發(fā)現(xiàn)噬菌體可有效減少食品中沙門氏菌活菌數(shù)[52-53]。沙門氏菌常通過(guò)食品污染傳播，為應(yīng)對(duì)沙門氏菌的食源性污染，研究者嘗試在飼料中添加噬菌體以期減少動(dòng)物體內(nèi)的沙門氏菌。Thanki 等[54]將噬菌體噴霧干燥制成粉末狀態(tài)與飼料混合，結(jié)果顯示，預(yù)防性地使用干噬菌體能夠減少沙門氏菌在仔豬胃、十二指腸、結(jié)腸和盲腸中的定植，且不會(huì)影響仔豬健康。Kimminau 等[55]研究表明，飼料中添加噬菌體也不會(huì)影響沙門氏菌活疫苗的功效。

傳統(tǒng)生物被膜清除方法存在耐藥問(wèn)題、成本高、操作復(fù)雜、不適合畜牧業(yè)批量應(yīng)用等缺點(diǎn)，在后抗生素時(shí)期，噬菌體作為一種清除沙門氏菌生物被膜的生物防治劑，效果良好，而且噬菌體感染周期短，增殖迅速，小劑量的噬菌體制劑即可清除宿主細(xì)菌[56]。噬菌體培養(yǎng)成本較低、適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣泛，發(fā)生腸炎沙門氏菌病傳播的地區(qū)往往能夠檢測(cè)到特異性噬菌體的存在[57-58]。目前針對(duì)噬菌體應(yīng)用研究中實(shí)際應(yīng)用的產(chǎn)品很少，且多用于治療細(xì)菌性疾病，因此利用噬菌體清除沙門氏菌生物被膜擁有巨大潛力。

3 結(jié)論

沙門氏菌廣泛存在于自然界中，患病動(dòng)物排泄物增加了沙門氏菌環(huán)境污染程度，環(huán)境中沙門氏菌常以生物被膜的形式存在，相較于浮游態(tài)，生物被膜形態(tài)沙門氏菌更難清除。噬菌體作為新型減抗替抗產(chǎn)品，其自身編碼的解聚酶和溶素不僅可以特異性地裂解宿主菌，還能夠破壞EPS結(jié)構(gòu)，裂解生物被膜。同時(shí)，由于噬菌體具有培養(yǎng)成本較低、適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣泛的特點(diǎn)，可以在清除環(huán)境中沙門氏菌生物被膜中發(fā)揮良好的效果，利用噬菌體清除沙門氏菌生物被膜擁有巨大潛力。