楊梅根藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

耿冶飛，陳秀杰，鄭風(fēng)敏，王永杰，陶曉賽

（河南省鶴壁市食品藥品檢驗檢測中心，河南 鶴壁 458030）

楊梅根為楊梅科植物矮楊梅Myrica nanaCheval.的干燥根，產(chǎn)于云南中部，向東達(dá)貴州西部，主要生長于海拔1 500～3 500 m 的山坡、林緣及灌木叢中［1］。矮楊梅為云南地方習(xí)用藥材，以根皮、莖皮、果實入藥，《云南中草藥》、《中藥大辭典（下冊）》［2］、《中華本草（第二冊）》［3］、《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（第一冊）》［4］、《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn) 中藥成方制劑》［5-7］中均有收載。其根皮味澀、性涼，果實味酸、性涼，具有收斂、止血、消炎功效，主治痢疾、泄瀉、脫肛、崩漏、消化道出血、風(fēng)濕疼痛、外傷出血等癥。楊梅根主要含有黃酮及其苷類、二芳基庚烷類、三萜及其苷類、沒食子酸、β-谷甾醇、鞣質(zhì)等成分，其中分離最多的黃酮類化合物為楊梅苷。藥理學(xué)研究表明，黃酮類化合物具有祛痰、止咳、對抗自由基、抗癌、防癌、抗菌、消炎、防治心腦血管疾病等作用［8-13］。為控制楊梅根藥材的質(zhì)量，本研究中通過藥材性狀、粉末顯微特征和薄層色譜對其進(jìn)行定性鑒別；通過測定其水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物，初步擬訂檢查項和浸出物限量；并選擇化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、含量較高的楊梅苷作為指標(biāo)性成分，建立了測定其含量的高效液相色譜法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

N - 300M 型生物顯微鏡（寧波永新光學(xué)股份有限公司），配有顯微成像系統(tǒng)；Nanomat 4 型薄層色譜手動點樣儀（瑞士卡瑪公司）；AE240 型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司，精密度為0.1 mg）；GoodLook - 1000 型薄層色譜成像系統(tǒng)（上?？普苌萍加邢薰荆籇HG-9145A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，SX2-4-10型箱式電阻爐，均購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SK2510HP 型超聲波清洗機（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為53 kHz）；e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）。

1.2 試藥

楊梅苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111860-201703，含量以95.2%計）；聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；甲醇、乙腈（色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易＜上海＞有限公司）；水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純；16 批楊梅根（編號為S1 -S16）采自云南省不同地區(qū)，經(jīng)河南省鶴壁市食品藥品檢驗檢測中心陳秀杰副主任藥師鑒定為正品，采集后均按試驗要求洗凈、晾干，備用。樣品信息見表1。

表1 楊梅根樣品信息Tab.1 Information of Myricae Radix samples

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

楊梅根藥材呈圓柱形，粗壯扭曲，多有分枝，直徑0.5～8.0 cm。表面褐色，略粗糙，有縱皺紋及橫形皮孔樣痕跡。質(zhì)硬而韌，難折斷，斷面不平坦，皮部狹窄，深棕色，木部寬廣，淺棕色至棕色，有細(xì)密的放射狀紋理。氣微，味微澀。

2.2 鑒別

顯微鑒別：取藥材粉末（過4 號篩）少許，置載玻片上，制片，顯微鏡下觀察。粉末呈灰棕色。木栓細(xì)胞呈淡黃色，呈類長方形或多角形，壁厚。韌皮纖維末端較鈍圓，直徑15～23 μm，壁厚，胞腔極窄，孔溝較密，有的深達(dá)纖維壁，胞腔內(nèi)可見點狀紋孔。木纖維散在或成束，纖維末端較尖，直徑11～22 μm，壁厚，胞腔具稀疏斜紋孔。石細(xì)胞呈類橢圓形或類長方形，單個散在或多個集聚，直徑26～89 μm，壁厚，孔溝明顯，胞腔內(nèi)有黃棕色物或具點狀紋孔。草酸鈣方晶較多，散在，呈方形或不規(guī)則多面體，直徑13～22 μm。導(dǎo)管多為網(wǎng)紋導(dǎo)管，網(wǎng)眼排列較緊密，少數(shù)為具緣紋孔導(dǎo)管，直徑11～37 μm。詳見圖1。

圖1 楊梅根粉末顯微特征圖1.Cork cells 2.Phloem fiber 3.Wood fiber 4.Stone cell 5.Calcium oxalate square crystal 6.Reticulated vessel 6′.Bordered pit vesselFig.1 Microscopic characteristics of Myricae Radix powder

薄層色譜鑒別：取藥材粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，加乙酸乙酯10 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取楊梅苷對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法試驗，吸取上述2 種溶液各1 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-水-冰乙酸（6∶4∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取岀，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點。色譜圖見圖2。

圖2 楊梅根薄層色譜圖（365 nm）S.Reference solution 1-16.Test solution（No.S1-S16）Fig.2 TLC chromatograms of Myricae Radix（365 nm）

2.3 檢查

水分：取16批藥材樣品粉末，按2020年版《中國藥典（四部）》通則0832 水分測定法第二法（烘干法）測定，結(jié)果見表2。根據(jù)測定結(jié)果，水分?jǐn)M訂為不得過10.0%。

表2 16批楊梅根藥材檢查項和其中楊梅苷含量測定結(jié)果（%）Tab.2 Inspection items of 16 batches of Myricae Radix and results of the content determination of myricetin in Myricae Radix（%）

總灰分：取16 批藥材樣品粉末，按2020年版《中國藥典（四部）》通則2302 灰分測定法測定，結(jié)果見表2。根據(jù)測定結(jié)果，總灰分?jǐn)M訂為不得過5.0%。

酸不溶性灰分：取16批藥材樣品粉末，按2020年版《中國藥典（四部）》通則2302 灰分測定法測定，結(jié)果見表2。根據(jù)測定結(jié)果，酸不溶性灰分?jǐn)M訂為不得過2.0%。

醇溶性浸出物：取16 批藥材樣品粉末，按2020年版《中國藥典（四部）》通則2201 浸出物測定法項下的冷浸法，以60%乙醇為溶劑測定，結(jié)果見表2。根據(jù)測定結(jié)果，醇溶性浸出物擬訂為不得少于15.0%。

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Symmetry?C8柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（13∶87，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：260 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。對照品溶液、供試品溶液、空白溶液在此色譜條件下的色譜圖見圖3。可見，理論板數(shù)按楊梅苷峰計不低于3 000，楊梅苷色譜峰均達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，且空白溶液對測定無干擾。

圖3 高效液相色譜圖1.MyricetinA.Reference solution B.Test solution C.Blank solutionFig.3 HPLC chromatograms

2.4.2 溶液制備

取楊梅苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg 的對照品溶液。取藥材粉末（過3 號篩）0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，放置30 min，超聲處理（功率為250 W，頻率為53 kHz）45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。以甲醇為空白溶液。

2.4.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取楊梅苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL 含楊梅苷0.01，0.025，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25 mg的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.4.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，以楊梅苷質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=107X-6 086.2（r=1.000 0，n=7）。結(jié)果表明，楊梅苷質(zhì)量濃度在0.01～0.25 mg/ mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限確定：取2.4.2 項下對照品溶液適量，加甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度，按2.4.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以信噪比（S/N）為3∶1 時的質(zhì)量濃度為檢測限，以S/N為10∶1 時的質(zhì)量濃度為定量限。結(jié)果檢測限為0.002 1 mg/ mL，定量限為0.007 0 mg/mL。

精密度試驗：取2.4.2 項下對照品溶液適量，按2.4.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄色譜峰峰面積，結(jié)果楊梅苷峰面積的RSD為0.52%（n=6），表明儀器日內(nèi)精密度良好。取上述對照品溶液每天進(jìn)樣2次，連續(xù)測定3 d，記錄色譜峰峰面積，結(jié)果楊梅苷峰面積的RSD為1.39%（n=6），表明儀器日間精密度良好。

重復(fù)性試驗：取藥材樣品（編號為S8）粉末6 份，每份0.3 g，精密稱定，按2.4.2 項下方法制備供試品溶液，按2.4.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算楊梅苷含量。結(jié)果楊梅苷含量的RSD為0.58%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.4.2 項下供試品溶液適量，分別于0，4，8，12，18，24，36，48 h 時按2.4.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果楊梅苷峰面積的RSD為1.36%（n=8），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取已知楊梅苷含量的藥材樣品（編號為S8）粉末6 份，每份0.15 g，精密稱定，分別加入2.4.2 項下對照品溶液適量，依法制備供試品溶液，按2.4.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.4.4 樣品含量測定

分別取16批（編號為S1-S16）藥材樣品粉末0.3 g，精密稱定，按2.4.2項下方法制備供試品溶液，按2.4.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算楊梅苷含量。結(jié)果見表2。根據(jù)測定結(jié)果，擬訂楊梅苷含量按干燥品計算不得少于1.5%。

3 討論

3.1 薄層色譜條件選擇

根據(jù)楊梅根藥材中所含化學(xué)成分，選擇其所含化學(xué)成分較高的黃酮類化合物楊梅苷作為指標(biāo)性成分對其進(jìn)行薄層色譜鑒別。楊梅苷為黃酮醇苷類，可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇等溶劑提取。本研究中參考文獻(xiàn)［4，14］，分別以乙酸乙酯、甲醇、60%乙醇為溶劑進(jìn)行提取，結(jié)果以甲醇和60%乙醇為提取溶劑時，色譜圖斑點較多，且有雜質(zhì)斑點干擾；以乙酸乙酯為提取溶劑時主斑點清晰，且無雜質(zhì)斑點干擾。故選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

采用硅膠G 薄層板時，分別以三氯甲烷- 甲醇-甲酸（20∶5∶2，V/V/V）和乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1，V/V/V）為展開劑進(jìn)行試驗，結(jié)果薄層色譜的比移值偏低，且斑點分離度不理想；采用聚酰胺薄膜時，分別以異丙醇- 水（3∶2，V/V）和甲醇- 水- 冰乙酸（4∶5∶1，V/V/V）為展開劑進(jìn)行試驗，結(jié)果薄層色譜主斑點的比移值較合適，且斑點較清晰。故選擇聚酰胺薄膜作為固定相。當(dāng)采用聚酰胺薄膜時，用以上2 種展開劑的展開時間較長，且主斑點有拖尾現(xiàn)象，參考文獻(xiàn)［15］，分別采用正丁醇- 乙醇- 水（2∶4∶5，V/V/V），乙醇- 水-冰乙酸（7∶3∶1，V/V/V），乙醇- 水- 冰乙酸（6∶4∶1，V/V/V）為展開劑進(jìn)行試驗，結(jié)果以乙醇-水-冰乙酸（6∶4∶1，V/V/V）為展開劑時的展開效果最好。故選擇此溶劑為展開劑。

關(guān)于薄層色譜點樣量的確定，分別用對照品溶液和供試品溶液點樣1，2，5，10 μL 于同一聚酰胺薄膜上進(jìn)行比較，結(jié)果采用聚酰胺薄膜時，點樣量不宜過大，當(dāng)點樣量超過2 μL 時主斑點有拖尾現(xiàn)象，且點樣量越大，拖尾現(xiàn)象越明顯。故選擇點樣量為1 μL。

3.2 浸出物測定條件選擇

楊梅根所含成分為黃酮類化合物，故選擇不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取較合適。本研究中按2020年版《中國藥典（四部）》通則2201 醇溶性浸出物測定法項下的冷浸法和熱浸法，分別用無水乙醇、75%乙醇、60%乙醇、50%乙醇作為溶劑，選定3 批樣品進(jìn)行測定，結(jié)果在相同體積分?jǐn)?shù)乙醇條件下，熱浸法浸出物含量高于冷浸法浸出物含量。在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇條件下，60%乙醇和50%乙醇浸出物含量高于無水乙醇和75%乙醇浸出物含量。比較冷浸法60%乙醇和50%乙醇浸出物含量，發(fā)現(xiàn)60%乙醇浸出物含量稍高于50%乙醇浸出物含量。經(jīng)綜合考慮，最終選擇60%乙醇為溶劑，采用冷浸法測定藥材中的浸出物。

3.3 含量測定條件選擇

參考文獻(xiàn)［4］，本研究中考察了以甲醇作為溶劑，分別采用加熱回流提取1 h 和2 h，索氏抽提1，2，3 h，超聲提取30，45，60 min 等不同提取方法，發(fā)現(xiàn)以索氏抽提法和超聲提取法的提取效率較高，考慮到超聲提取法較簡便，更易于操作，最終選擇超聲提取法進(jìn)行提取。試驗發(fā)現(xiàn)，超聲提取45 min 和60 min 的提取效率相當(dāng)，為節(jié)約時間，最終選擇超聲提取45 min 作為提取條件。

對楊梅苷對照品溶液進(jìn)行全波長掃描（190～400 nm），結(jié)果顯示，于260 nm波長處有較大吸收。還考察了甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液［4］、乙腈- 0.5%磷酸水溶液［14］等不同流動相系統(tǒng)，分別選擇不同規(guī)格的C18柱、C8柱，設(shè)置不同色譜柱溫度（25，30，35，40 ℃）對色譜條件進(jìn)行考察。試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)色譜柱選擇C18柱時，有雜質(zhì)峰影響楊梅苷色譜峰的分離，而C8柱則無雜質(zhì)峰干擾，故選擇色譜柱為C8柱；當(dāng)流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（13∶87，V/V），色譜柱溫度為40 ℃時，色譜峰的對稱性和分離度均較好，且出峰時間適宜，無雜質(zhì)峰干擾，故確定2.4.1項下色譜條件。

3.4 限度指標(biāo)擬訂

根據(jù)試驗結(jié)果，將水分的平均值上浮30%，擬訂水分限度標(biāo)準(zhǔn)；將醇溶性浸出物的平均值下浮30%，擬訂浸出物限度標(biāo)準(zhǔn)；將含量測定結(jié)果平均值下浮25%，擬訂含量限度標(biāo)準(zhǔn)；考慮到實際采收、加工、生產(chǎn)等情況對總灰分和酸不溶性灰分造成的影響，參考一般根及根莖類藥材總灰分和酸不溶性灰分的限度標(biāo)準(zhǔn)。初步擬訂楊梅根藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為，水分不得過10.0%，總灰分不得過5.0%，酸不溶性灰分不得過2.0%，醇溶性浸出物含量不得少于15.0%，楊梅苷含量按干燥品計算不得少于1.5%。