生肌化瘀凝膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

張玉萱，徐玲玲，劉愛軍，單陳偉，廖雪清

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437）

生肌化瘀凝膠以黃芪、丹參為君藥，可益氣補(bǔ)血、扶正祛邪；以大黃、血竭、白芷為臣藥，可祛瘀定痛、斂血生?。灰宰咸K為佐藥，可行氣止痛；以珍珠粉、爐甘石為使藥，可收濕斂瘡、去腐生肌。諸藥配伍，有祛瘀生肌、活血消瘢、扶正祛邪之功效［1-3］。目前，關(guān)于生肌化瘀凝膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究鮮有報(bào)道。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明，生肌化瘀凝膠可能通過多成分、多靶點(diǎn)對(duì)慢性皮膚潰瘍起到治療作用，方中主要藥物為大黃、血竭［4］。但該方藥味組成與化學(xué)成分復(fù)雜，化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，故需建立標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)量控制方法，確定主要化學(xué)成分，明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究中采用薄層色譜（TLC）法和高效液相色譜（HPLC）法對(duì)生肌化瘀凝膠進(jìn)行質(zhì)量控制研究，以保障臨床用藥安全、有效，為后續(xù)新藥的開發(fā)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent - 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；52-CS RE型系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；H.H.S-4 型電熱數(shù)字顯示恒溫水浴鍋，DHG-9071型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，均購(gòu)自上海圣欣科學(xué)儀器有限公司；Sartorius BL310 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，精度為0.000 1 g）。

1.2 試藥

血竭素高氯酸鹽對(duì)照品（批號(hào)為110811-201506，純度為99.0%），大黃酚對(duì)照品（批號(hào)為110796 -200309，純度為99.0%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；歐前胡素對(duì)照品（批號(hào)為14073021，純度為98.0%），丹參酮ⅡA對(duì)照品（批號(hào)為14072844，純度為98.0%），紫草素對(duì)照品（批號(hào)為14071521，純度為98.0%），黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)為16053121，純度為98.0%），均購(gòu)自Shanghai Tauto Biotech 公司；生肌化瘀凝膠（醫(yī)院制劑，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)研究室）；乙腈（色譜純，批號(hào)為20210310），甲醇（色譜純，批號(hào)為20210514），乙酸乙酯（分析純，批號(hào)為T20110922），均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二氯甲烷（批號(hào)為20131017），甲酸乙酯（分析純，批號(hào)為20121112），環(huán)己烷（批號(hào)為20120916），均購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；石油醚（分析純，上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20161001）；氫氧化鉀（上海精化科技研究所，批號(hào)為20041020）；甲苯（上海和逸化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為2016117）；氨水（批號(hào)為2012201），甲酸（分析純，批號(hào)為20130202），均購(gòu)自江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

取泊洛沙姆、聚乙二醇、氮酮各適量，置燒杯中，加入適量純化水，室溫放至澄清，加入生肌化瘀方提取液，混勻，調(diào)節(jié)pH值，即得樣品，共6批，分別編號(hào)為1-6。

2.2 TLC 鑒別

血竭［5］：取樣品2.5 g，加入30 mL 甲醇，水浴，濾過，再加甲醇定容至25 mL，取10 mL 蒸干，殘?jiān)? mL甲醇使溶解，作為供試品溶液；另取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品，加甲醇溶解，即得對(duì)照品溶液；按樣品制備方法制備不含血竭的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各10～20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷- 甲醇（19∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見圖1 A。

大黃［6-7］：同法制備供試品溶液；另取大黃酚對(duì)照品適量，加甲醇溶解，即得對(duì)照品溶液；按樣品制備方法制備不含大黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。分別吸取上述溶液各2～4 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚- 甲酸乙酯- 甲酸（15∶5∶1，V/V/V）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同位置紫外光燈（365 nm）下顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；經(jīng)氨蒸氣熏蒸后，日光下可見斑點(diǎn)變紅，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖分別見圖1 B1和圖1 B2。

丹參［8-9］：同法制備供試品溶液；另取丹參酮ⅡA對(duì)照品，加甲醇溶解，即得對(duì)照品溶液；按樣品制備方法制備不含丹參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。分別吸取上述溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷- 甲苯- 乙酸乙酯-甲醇- 甲酸（6∶4∶8∶1∶4，V/V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見圖1 C。

圖1 薄層色譜圖1.Reference solution 2-4.Test solution 5.Negative reference solutionA.Draconis Sanguis（365 nm） B1，B2.Rhei Radix et Rhizoma（365 nm，sunlight） C. Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma（365 nm） D.Arnebiae Radix（sunlight） E1，E2.Astragali Radix（sunlight，365 nm） F.Angelicae Dahuricae Radix（365 nm）Fig.1 TLC chromatograms

紫草［10-11］：同法制備供試品溶液；另取紫草素對(duì)照品，加甲醇溶解，即得對(duì)照品溶液；按樣品制備方法制備不含紫草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。分別吸取上述溶液各4 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷- 甲苯- 乙酸乙酯-甲酸（5∶5∶0.5∶0.1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同位置顯相同的紫紅色斑點(diǎn)，噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液后斑點(diǎn)變藍(lán)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見圖1 D。

黃芪［12-13］：同法制備供試品溶液；另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇溶解，即得對(duì)照品溶液；按樣品制備方法制備不含黃芪的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。分別吸取上述溶液各2 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同位置日光下顯相同棕褐色斑點(diǎn)，紫外光燈（365 nm）下顯橙黃色熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖分別見圖1 E1和圖1 E2。

白芷［14-15］：取樣品2 g，加10 mL 乙醚，浸泡1 h，不時(shí)振搖，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液；另取歐前胡素對(duì)照品，加乙酸乙酯溶解，即得對(duì)照品溶液；按樣品制備方法制備不含白芷的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。分別吸取上述溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚-乙醚（3∶2，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同位置顯相同藍(lán)色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見圖1 F。

2.3 含量測(cè)定［16-17］

2.3.1 色譜條件

1）血竭素。色譜柱：Agilent Zorbax - SB - C18柱（250 mm×4.6 mm，15 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（50∶50，V/V）；流速：1 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：440 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2）大黃酚。色譜柱：Zorbax Eclipse XDB - C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（85∶15，V/V）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 溶液制備

血竭素：取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品8.9 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加3%磷酸甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為0.178 mg/mL 的對(duì)照品溶液Ⅰ，即每1 mL 含血竭素0.129 3 mg。取樣品2.5 g，精密稱定，置50 mL燒杯中，加30 mL 3%磷酸甲醇，40 ℃水浴加熱，過濾提取液，加3%磷酸甲醇定容至50 mL容量瓶中，再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液Ⅰ。按處方工藝，除去血竭藥材，制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

大黃酚：取大黃酚對(duì)照品5 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液Ⅱ。取樣品2.5 g，精密稱定，置5 mL 容量瓶中，加純化水定容，搖勻，濾過，精密吸取1 mL，置2 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，離心（轉(zhuǎn)速為3 000 r/min）5 min，取上清液，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液Ⅱ。按處方工藝，除去大黃藥材，制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取2.3.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有對(duì)應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖1.Draconin 2.ChrysophanolA.Reference solution B.Test solution C1，C2.Negative reference solution（lack of Draconis Sanguis and Rhei Radix et Rhizoma respectively）Fig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：1）血竭素。分別精密吸取2.3.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液Ⅰ200，300，400，500，600，700 μL，置1 mL容量瓶中，加3%磷酸甲醇定容，制備成含血竭素0.025 85，0.038 77，0.051 70，0.064 63，0.077 55，0.090 48 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=3 165.650 1X-14.435 2（r=0.999 9，n=6）。結(jié)果表明，血竭素質(zhì)量濃度在0.025 85～0.090 48 mg/mL 范圍內(nèi)與面積線性關(guān)系良好。2）大黃酚。分別精密吸取2.3.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液Ⅱ100，400，800，2 000，4 000，6 000 μL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.001，0.004，0.008，0.020，0.040，0.060 mg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 40 807X+ 7.347 5（r=0.999 9，n=6）。結(jié)果表明，大黃酚質(zhì)量濃度在0.001～0.060 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

日內(nèi)精密度試驗(yàn)：分別吸取2.3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液Ⅰ，Ⅱ各10 μL，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件1 d 內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定5 次。結(jié)果血竭素、大黃酚峰面積的RSD分別為2.30%和0.48%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.1 項(xiàng)下樣品適量，按2.3.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液Ⅰ，Ⅱ，分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h 時(shí)按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果血竭素、大黃酚峰面積的RSD分別為0.23%和0.23%（n= 8），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取2.1 項(xiàng)下樣品適量，平行5 份，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液Ⅰ，Ⅱ，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果血竭素、大黃酚含量的RSD分別為0.86%和0.98%（n=5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：分別精密吸取已知含量的供試品溶液Ⅰ，Ⅱ各適量，共9 份，分別精密加入80%，100%，120%的對(duì)照品溶液Ⅰ，Ⅱ，混勻，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果血竭素、大黃酚的平均加樣回收率分別為101.88%和96.82%，RSD分別為2.50%和0.79%（n=9），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.3.4 樣品含量測(cè)定［18-19］

取6 批（編號(hào)為1-6）樣品，按2.3.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液Ⅰ，Ⅱ，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果見表1。

表1 6批樣品中血竭素和大黃酚含量測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of the content determination of draconin and chrysophanol in samples

3 討論

3.1 TLC 鑒別

2020年版《中國(guó)藥典（一部）》中有血竭、大黃、丹參、紫草、黃芪、白芷的TLC鑒別方法，但因不同劑型、不同制備方法及不同藥物間相互作用的影響，操作方法不能完全應(yīng)用于生肌化瘀凝膠。曾比較藥典方法與文獻(xiàn)［6-15］報(bào)道的方法，最終建立2.2項(xiàng)下TLC鑒別方法。

3.2 流動(dòng)相系統(tǒng)選擇

本研究中對(duì)大黃酚的含量進(jìn)行了測(cè)定，流動(dòng)相分別考察了乙腈- 0.1%磷酸水溶液、甲醇- 0.1%磷酸水溶液（85∶15，V/V），結(jié)果乙腈- 0.1%磷酸水溶液（85∶15，V/V）的分離效果差，且調(diào)整比例無(wú)明顯改變；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（85∶15，V/V）時(shí)色譜峰峰形好，分離度良好，出峰時(shí)間理想。故流動(dòng)相最終選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液（85∶15，V/V），該條件下系統(tǒng)基線平穩(wěn)，各色譜峰間分離度好，響應(yīng)值較高。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于生肌化瘀凝膠的質(zhì)量控制，為進(jìn)一步建立其特征指紋圖譜奠定了基礎(chǔ)，后期將從細(xì)胞、分子、基因、藥理作用、成分分析等多方面、多層次對(duì)其進(jìn)行分析鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)。