分子排阻色譜-反相高效液相色譜法測(cè)定阿莫西林顆粒中高分子聚合物含量*

王顯芹，鄭如程，錢世兵，傅世玲，邢建輝，秦 亮

（1. 安徽安科恒益藥業(yè)有限公司，安徽 銅陵 244061； 2. 安徽省銅陵市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 銅陵 244061）

β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物包括青霉素及其衍生物、頭孢菌素、單酰胺環(huán)類、碳青霉烯類、青霉烯類抑制劑等，是臨床常用的注射劑型抗菌藥物［1］。阿莫西林是第2代青霉素類抗菌藥物，具有廣譜抗菌作用，為首選β- 內(nèi)酰胺類口服抗菌藥物［2］，臨床常用于治療革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌等所致的感染性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病及泌尿系統(tǒng)疾?。?-6］，但藥品不良反應(yīng)發(fā)生率較高，過(guò)敏反應(yīng)可引起β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物聚合物雜質(zhì)［7］。阿莫西林的主要致敏原為其二聚體、三聚體、四聚體和五聚體，聚合度越高，引發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)越強(qiáng)，故應(yīng)嚴(yán)格控制阿莫西林中高分子聚合物的含量［8］。2020年版《中國(guó)藥典（二部）》［9］中采用Sephadex-G10 葡聚糖凝膠柱對(duì)聚合物進(jìn)行控制，但阿莫西林顆粒標(biāo)準(zhǔn)中未收錄“聚合物”檢查項(xiàng)?！睹绹?guó)藥典（43 版）》［10］和《歐洲藥典（9.0版）》［11］中采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時(shí)控制聚合物雜質(zhì)和一般雜質(zhì)。實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，采用Sephadex-G10 葡聚糖凝膠柱分離測(cè)定聚合物時(shí)，存在長(zhǎng)時(shí)間使用導(dǎo)致柱效降低，聚合物和主峰分離度不夠，測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)，測(cè)定過(guò)程煩瑣，進(jìn)樣量大，對(duì)進(jìn)樣設(shè)備要求高等問(wèn)題。本研究中參考文獻(xiàn)［12-16］，在國(guó)家藥品監(jiān)督管理局公布的參比制劑目錄中選擇國(guó)外L 公司的阿莫西林細(xì)粒（阿莫西林顆粒屬改劑型品種，國(guó)外原研藥無(wú)該劑型，相似劑型為細(xì)粒），以國(guó)內(nèi)A公司生產(chǎn)的阿莫西林顆粒（參比制劑）為檢測(cè)樣本，建立了測(cè)定阿莫西林顆粒中高分子聚合物含量的分子排阻色譜-反相高效液相色譜法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SQP QUINTIX 224-1CN 型電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)，精度為0.1 mg/0.01 mg）；S210 型pH 計(jì)（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）；LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），配有二極管陣列檢測(cè)器。

1.2 試藥

阿莫西林顆粒（A 公司，批號(hào)分別為S190601，S190801，S200301，S200302，S200303）；阿莫西林細(xì)粒（L 公司，批號(hào)分別為1903A0，9420）；阿莫西林對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為130409 - 201512，含量為86.9%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，試驗(yàn)用水由Milli-Q系統(tǒng)制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Cef-SEC球狀親水硅膠柱（300 mm×7.8 mm，5 μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液［pH 7.0，0.005 mol/L 磷酸氫二鈉-0.005 mol/L 磷酸二氫鈉（50∶50，V/V）］-乙腈（90∶10，V/V）；流速：0.6 mL / min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

供試品溶液：取樣品適量，精密稱定，冷水中加流動(dòng)相適量，超聲5 min使溶解，加流動(dòng)相定量稀釋成每1 mL含阿莫西林1.0 mg的溶液，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

對(duì)照品溶液：取阿莫西林對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解，稀釋成每1 mL含阿莫西林10 μg的溶液，即得。

系統(tǒng)適用性溶液：取阿莫西林對(duì)照品10 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相5 mL，超聲使溶解，加0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL，30 ℃水浴10 min，用0.1 mol/L 鹽酸溶液調(diào)酸堿性至中性，加流動(dòng)相定容，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：分別取供試品溶液、對(duì)照品溶液、系統(tǒng)適用性溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中，阿莫西林峰與主要降解雜質(zhì)峰的分離度為7.8，符合要求。色譜圖見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖1-5.Polymer impurities 6.Amoxicillin 7.Main degradation impurities A.Test solution B.Reference solution C.System suitability solutionFig.1 HPLC chromatograms of the system suitability test

專屬性試驗(yàn)：由藥品說(shuō)明書可知，樣品中含有蔗糖、日落黃鋁色淀、糊精、枸櫞酸鈉、香蘭素、桔子香精粉末等輔料。按處方工藝分別制備缺主藥的單一輔料溶液及混合輔料溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，輔料中存在干擾峰（蔗糖峰和日落黃鋁色淀峰），故測(cè)定聚合物含量時(shí)需扣除。色譜圖見圖2。

圖2 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖A.Sucrose solution B.Sunset yellow aluminum lake solution C.Mixed excipient solutionFig.2 HPLC chromatograms of the specific test

破壞性試驗(yàn)：取樣品和混合輔料，分別進(jìn)行堿破壞（加0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液0.8 mL，室溫放置5 min，用0.1 mol/L 鹽酸溶液調(diào)至中性）和高溫破壞（80 ℃破壞8 h）后，配制成相應(yīng)的強(qiáng)制降解供試品溶液和混合輔料溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。由圖3 可知，輔料中存在干擾峰；經(jīng)堿破壞和高溫破壞的混合輔料對(duì)阿莫西林中聚合物的測(cè)定未產(chǎn)生明顯干擾，阿莫西林峰與其前主要降解雜質(zhì)峰間的分離度均大于1.5，符合要求。

圖3 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.AmoxicillinA1，A2.Test solution（alkali damage and high-temperature damage） B1，B2.Mixed excipient solution（alkali damage and high-temperature damage）Fig.3 HPLC chromatograms of the destroyed test

線性關(guān)系考察：取阿莫西林對(duì)照品28.83 mg，精密稱定，加流動(dòng)相配制成質(zhì)量濃度為50.1 μg/mL 的線性貯備液；分別精密量取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為2.51，5.01，10.02，15.03，20.04，25.05，30.06，35.07 μg/mL 的系列線性溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A= 6 278.3C- 2 554.0（r=0.999 3，n=8）。結(jié)果表明，阿莫西林對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度在2.51～35.07 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限和定量限確定：精密量取線性關(guān)系考察項(xiàng)下質(zhì)量濃度為2.51 μg/ mL 的線性溶液，逐級(jí)稀釋，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。取信噪比（S/N）分別為10∶1 和3∶1 時(shí)待測(cè)成分的質(zhì)量為定量限和檢測(cè)限，結(jié)果分別為5.00 ng和1.60 ng。

精密度試驗(yàn)：取線性關(guān)系考察項(xiàng)下質(zhì)量濃度為10.02 μg/mL的線性溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄色譜圖。結(jié)果峰面積的RSD為0.60%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：按2.2項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液1份，于室溫下放置0，2，4，6，8 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積變化考察對(duì)照品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果對(duì)照品溶液主峰峰面積的RSD為0.5%（n=5），表明對(duì)照品溶液室溫放置8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液2 份，取1 份供試品溶液于室溫下放置0，1，2，3，4，5，6，8 h 及另1 份供試品溶液于4 ℃下放置0，2，4，6，8 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算聚合物含量，以聚合物含量變化量考察供試品溶液的穩(wěn)定性。與0 h 相比，供試品溶液室溫、4 ℃條件下放置8 h 聚合物含量分別增加0.40%和0.04%，表明供試品溶液在室溫條件下不穩(wěn)定，需臨用新制，或應(yīng)保存于4 ℃下并在8 h內(nèi)使用。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為S190601）樣品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算聚合物含量。結(jié)果6 份供試品溶液中聚合物含量分別為0.33%，0.28%，0.26%，0.26%，0.26%，0.25%，聚合物含量最大變化量為0.08%，表明方法重復(fù)性良好。

中間精密度試驗(yàn)：由不同分析人員按重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下方法，在不同時(shí)間重新制備6 份供試品溶液。結(jié)果聚合物含量分別為0.30%，0.28%，0.27%，0.32%，0.27%，0.26%。12份供試品溶液中，聚合物含量最大變化量為0.08%，表明方法中間精密度良好。

耐用性試驗(yàn)：在其他條件不變的情況下，分別微調(diào)流速、柱溫、磷酸鹽緩沖液pH、流動(dòng)相比例、檢測(cè)波長(zhǎng)，分別配制系統(tǒng)適用性溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液，測(cè)定聚合物含量。結(jié)果測(cè)定的聚合物含量最大變化量為0.08%，考慮聚合物含量為多個(gè)聚合物峰及積分差異，測(cè)定誤差均在可接受范圍內(nèi)；系統(tǒng)適用性溶液中，主峰與較大雜質(zhì)峰間的分離度均大于1.5。結(jié)果見表1，由于蔗糖色譜圖中存在多個(gè)小的色譜峰，無(wú)法用保留時(shí)間描述，故未列出。

表1 耐用性試驗(yàn)考察結(jié)果Tab.1 Results of the durability test

2.4 樣品含量測(cè)定

取5 批A 公司生產(chǎn)的阿莫西林顆粒，以2 批次L 公司生產(chǎn)的阿莫西林細(xì)粒為參比制劑，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算聚合物含量。結(jié)果A 公司5 批次阿莫西林顆粒中高分子聚合物的含量均低于參比制劑，提示A公司阿莫西林顆粒的質(zhì)量不低于參比制劑。詳見表2。

表2 樣品中高分子聚合物含量測(cè)定結(jié)果（%）Tab.2 Results of the content determination of high - molecular polymer in samples（%）

3 討論

3.1 柱溫選擇

參考文獻(xiàn)［14］中的色譜條件（柱溫為30 ℃，其余色譜條件不變）對(duì)各單一輔料溶液、混合輔料溶液及供試品溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果糊精、枸櫞酸鈉、香蘭素及桔子香精粉末對(duì)聚合物檢測(cè)基本無(wú)干擾；蔗糖與聚合物出峰位置有重合，故在計(jì)算時(shí)需扣除蔗糖峰中保留時(shí)間與聚合物峰重合的峰面積；日落黃鋁色淀峰于主峰前出峰，但峰形較差，故調(diào)整柱溫為25 ℃，此溫度下的峰形更優(yōu)。

3.2 超聲時(shí)間選擇

取同一批（批號(hào)為S190601）樣品4 份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，樣品溶解時(shí)分別超聲處理3，5，7，10 min，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算阿莫西林顆粒中聚合物含量。結(jié)果超聲3 min 與超聲10 min 的聚合物含量基本不變，為保證樣品溶解完全及檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性，同時(shí)避免超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)產(chǎn)生的熱量導(dǎo)致聚合物含量發(fā)生變化，建議超聲時(shí)間為5 min。

3.3 溶解時(shí)水溫選擇

根據(jù)阿莫西林顆粒藥品說(shuō)明書中的臨床用法，使用前需用涼開水?dāng)嚢韬蠓谩＝Y(jié)合本品實(shí)際使用情況（即每次1 袋），取A 公司生產(chǎn)的阿莫西林顆粒，制備含質(zhì)量濃度為3.75 mg/mL 的供試品溶液，溶解時(shí)的水溫分別選擇（25 ± 2）℃（涼開水）、40～50 ℃（溫水）、70～80 ℃（熱水），于室溫下放置3 h，考察0，1，2，3 h 時(shí)聚合物的含量。結(jié)果聚合物的含量隨溶解時(shí)水溫的升高而增加，聚合物含量越高可能導(dǎo)致的過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率越高。故為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，建議樣品于冷水中用流動(dòng)相溶解。

3.4 聚合物限度確定

根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典（四部）》附錄［17］中有關(guān)的指導(dǎo)原則和ICH HARMONISED TRIPARTITE GUIDELINE IMPURITIES IN NEW DRUG PRODUCTS Q3B（R2）中對(duì)雜質(zhì)限度的規(guī)定，同時(shí)結(jié)合本研究中的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果及參比制劑的對(duì)比結(jié)果，將本品的聚合物限度擬訂為≤標(biāo)示量的3.0%。

3.5 方法評(píng)價(jià)

本研究中所建立的方法操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于阿莫西林顆粒中高分子聚合物的含量測(cè)定。