PI3Ks 新型抑制劑NVP-BEZ235 對食管鱗癌的抑制作用*

姚佳儀，王斯琦，錢玉蘭，孫曉鳴，馬 賽，楊 薇，郭 冰，楊 中，查良英

（1. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006； 2. 江蘇省蘇州市第五人民醫(yī)院，江蘇 蘇州 215131；3. 江蘇省蘇州市廣濟醫(yī)院，江蘇 蘇州 215131； 4. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院，江蘇 蘇州 215008；5. 江蘇省蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院，江蘇 蘇州 215129）

食管癌是人類常見的惡性腫瘤，我國發(fā)病率和病死率分別居全球第6位和第4位，嚴(yán)重威脅國民健康［1］。食管癌在組織病理學(xué)上主要分為食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）［2］，我國以食管鱗癌為主，占食管癌的90%。目前，食管鱗癌的發(fā)病機制尚不完全清楚，其治療仍以手術(shù)為主，輔以放射治療和化學(xué)治療，臨床缺乏有效的分子靶向藥物，患者5年生存率極低［3］。因此，探索新的靶向治療藥物對食管鱗癌的治療十分重要。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）是一種位于胞內(nèi)的磷脂酰肌醇激酶家族，在細(xì)胞的增殖、分化和胞內(nèi)運輸中具有關(guān)鍵作用［4-5］。PI3Ks 根據(jù)其編碼基因和催化底物，可分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3 種類型。Ⅰ類亞型的PI3Ks 為異源二聚體，由1 個110 000 催化亞單位（p110α，由位于3q26.3 的PIK3CA 編 碼）和1 個85 000 調(diào) 節(jié) 亞 單 位（p85α，由位于5q13.1 的PIK3R1 編碼）組成［6］。PIK3CA在食管鱗癌中存在高頻突變和擴增，其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［7-8］。磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基p85α抗體（PI3K-p85α）的基因多態(tài)性與食管鱗癌的風(fēng)險增加有關(guān)［9］。有研究指出，lncRNA LINC01503 可誘導(dǎo)PI3K -p85α 的激活而促進食管鱗癌細(xì)胞的增殖［10］。NVP -BEZ235（Dactolisib）是一種新型的PI3Ks 和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）雙重抑制劑，對肝癌、甲狀腺癌等均顯示出良好的抑制作用［11-12］。本研究中主要通過體內(nèi)外模型探討了NVP-BEZ235 對食管鱗癌的作用，以及PI3K -p85α 表達水平對NVP-BEZ235 效果的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥、動物與細(xì)胞

儀器：Thermo 240 型CO2培養(yǎng)箱，Thermo Varieskan LUX 型酶標(biāo)儀，均購自（美國Thermo Revco 公司；Olympus Ⅸ51型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，批號8122282）；胎牛血清（法國Biowest公司，批號為S1700）；NVP - BEZ235（Dactolisib，Med Chem Express 公司，批號20210712）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號為HY -15925），二甲基亞砜（批號HY - Y0320），均購自Med Chem Express 公司；吉姆薩染液（北京索萊寶科技有限公司，批號為G1015）；PI3K-p85α（批號為60225-1-Ig），甘油醛- 3 - 磷酸脫氫酶抗體（GAPDH，批號60004 -1 - Ig），均購自美國Proteintech 公司；BCA 檢測試劑盒（批號為P0012S），0.25%胰蛋白酶- 乙二胺四乙酸（Trypsin - EDTA，批號為C0201），放射免疫沉淀分析裂解液（RIPA，批號為P0013B），上樣緩沖液（Loading Buffer，批號為P0015），聚偏二氟乙烯膜（PVDF，批號為FFP28），脫脂牛奶（批號為P0216），均購自上海碧云天生物科技有限公司；發(fā)光液（蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司，批號為180-5001）。

動物：6 周齡雌性BALB/c-nu 裸鼠10 只，購自杭州子源實驗動物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（浙）2019 - 0004，使用許可證號SCXK（蘇）2022 -0008。動物實驗經(jīng)江蘇省蘇州市第五人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)［批件號為（2022）院倫理審字（10）號］。飼養(yǎng)條件為，SPF 級動物房，溫度23～25 ℃，相對濕度（50±10）%，12 h/12 h 明暗交替。

細(xì)胞：食管鱗癌細(xì)胞系KYSE30、KYSE70、KYSE510、KYSE410、 TE1、 KYSE150、 KYSE180、 KYSE270、KYSE450 均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；食管腺癌細(xì)胞系OE33、OE19、ESO26 由美國南加州大學(xué)De-chenLin 教授惠贈。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)：在37 ℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)食管癌細(xì)胞系，隔天換液。每個細(xì)胞系給予0，1，4，8，16，32，64，128 nmol/L 濃度梯度的NVP-BEZ235培養(yǎng)48 h。

細(xì)胞增殖能力檢測：采用MTT 比色法。取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于96 孔板中，每孔6 × 103個，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。每個細(xì)胞系給予0，1，4，8，16，32，64，128 nmol/L NVP-BEZ235 培養(yǎng)48 h。加入MTT（每孔20 μL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜（DMSO，每孔200 μL）振蕩10 min。以酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定吸光度（OD），平行測定3 次，并計算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率（%）=OD用藥組/OD對照組× 100%。以增殖率為50%時的藥物濃度為半數(shù)抑制濃度（IC50）。

細(xì)胞集落形成實驗：取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于24孔板中，每孔1×103個，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 d。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見克隆時，給予10 nmol/ L NVP-BEZ235培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）小心浸洗2 次，空氣干燥。甲醇固定15 min，棄甲醇，空氣干燥。用吉姆薩染液染色10 min，用流水緩慢洗去染液，空氣干燥。

細(xì)胞表達檢測：采用免疫印跡（Western blot）法。在T25瓶中收集腫瘤細(xì)胞，計數(shù)2×106細(xì)胞，離心（轉(zhuǎn)速為1 500 r/min）5 min，加入300 μL RIPA 裂解液，4 ℃冰浴10 min，超聲5 min，離心（轉(zhuǎn)速為12 000 r/min）10 min，采用BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度，加入Loading Buffer 煮沸5 min。冷卻后上樣（30 μg蛋白/泳道）。100 V、60 min進行轉(zhuǎn)膜，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，并在室溫條件下用牛奶封閉1 h，加入p85α 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；次日用TBST 洗脫3 次，每次15 min；加入二抗孵育1 h。加入顯影檢測試劑與膜蛋白充分混勻，室溫孵育5 min，用凝膠成像儀曝光并拍照。

裸鼠移植瘤實驗：6周齡雌性BALB/c-nu裸鼠10只，KYSE30 腫瘤細(xì)胞1×106個/只接種于裸鼠上肢腋下。每10 d 測量皮下移植瘤的長度和寬度，計算腫瘤體積，體積= 1/ 3 ×（長度× 寬度× 寬度）。待腫瘤體積達到100 mm3時，將裸鼠隨機分為實驗組和對照組，每組5 只。實驗組腹腔注射NVP-BEZ235（10 mg/kg），每周2 次；對照組注射PBS。第50 天使用CO2法處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤組織，稱定質(zhì)量并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料以±s表示，行t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌細(xì)胞系中PI3K-p85α 表達

食管鱗癌細(xì)胞系中KYSE30，KYSE70，KYSE510，KYSE410，TE1，以及食管腺癌細(xì)胞系OE33 和OE19 中PI3K - p85α 表達均較高；食管鱗癌細(xì)胞系KYSE150，KYSE180，KYSE270，KYSE450，以及食管腺癌細(xì)胞系ESO26中PI3K-p85α的表達量較低。詳見圖1。

圖1 食管鱗癌細(xì)胞系中PI3K-p85α表達量Fig.1 Expression of PI3K-p85α in ESCC cell lines

2.2 對食管鱗癌細(xì)胞系增殖能力的影響及IC50

結(jié)果顯示，高濃度處理后，細(xì)胞的增殖能力均顯著下降，每個細(xì)胞系IC50差異顯著。PI3K-p85α 高表達的食管鱗癌細(xì)胞系對NVP-BEZ235 的敏感度更高，抑制效果較好，KYSE30，KYSE70，KYSE510，TE1的IC50分別為4.92，5.43，4.76，7.78 nmol/L；PI3K - p85α 表達量較低的食管鱗癌細(xì)胞系對NVP-BEZ235的敏感度低，抑制效果較差，KYSE150，KYSE180，KYSE270，KYSE450的IC50分別為13.21，18.44，20.37，48.45 nmol/L。詳見表1。由圖2 可知，在加入10 nmol/ L NVP - BEZ235 處理的細(xì)胞集落形成實驗中，KYSE30，KYSE70，KYSE510，TE1 的集落數(shù)目少于KYSE150，KYSE180，KYSE270，KYSE450的集落數(shù)目。

圖2 NVP-BE235對食管鱗癌細(xì)胞系IC50及集落形成的影響A.IC50 values of ESCC cell lines exposed to different concentrations of NVP -BEZ235 B.Colony formation assay of ESCC cell lines treated with 10 nmol/L of NVP-BEZ235Fig.2 Effect of NVP-BEZ235 on IC50 values and colony formation of ESCC cell lines

表1 NVP-BEZ235對食管癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖的影響（±s，n=4）Tab.1 Effect of NVP-BEZ235 on cell proliferation of ESCC cell lines（±s，n=4）

注：與0 nmol/L比較，*P ＜0.05。Note：Compared with those at 0 nmol/L，*P ＜0.05.

序號1 2 3 4 5 6 7 8濃度（nmol/L）0 1 4 8 16 32 64 128 KYSE30 100.00±10.23 95.13±10.34 70.15±7.45*11.01±6.12*9.92±7.34*3.56±3.32*2.63±2.28*1.86±1.23*KYSE150 100.00±10.34 80.83±8.78*68.05±7.45*64.46±7.64*54.50±5.12*34.34±3.37*15.34±1.76*7.64±0.89*KYSE70 100.00±12.12 86.76±8.56 62.60±6.79*32.12±3.42*23.78±3.87*17.98±1.84*9.67±0.75*4.32±0.43*KYSE510 100.00±9.79 88.37±8.87 52.90±5.67*34.06±3.47*19.41±2.01*16.77±1.72*11.02±1.23*7.25±0.82*TE1 100.00±9.01 91.55±9.13 72.88±7.45*43.32±4.56*31.87±3.41*15.91±1.52*9.96±0.98*5.50±0.45*KYSE180 100.00±9.87 98.64±9.65 75.71±8.03*69.22±7.12*54.55±6.34*38.38±4.12*22.14±2.78*15.09±1.68*KYSE270 100.00±10.21 90.94±9.42 88.86±8.91 74.46±7.82*55.72±5.71*35.23±3.52*22.92±3.91*14.87±1.52*KYSE450 100.00±11.39 94.36±9.21 88.67±8.38*81.15±8.31*74.24±7.31*65.54±6.73*48.74±5.01*19.14±2.13*

2.3 對食管鱗癌細(xì)胞系裸鼠皮下移植瘤生長能力的影響

腹腔注射NVP-BEZ235的荷瘤裸鼠皮下移植瘤見圖3 A。實驗組的移植瘤體積為（531.98±37.14）mm3，顯著低于對照組的（1 169.5 ± 110.34）mm3（t= 12.24，P＜0.001）。實驗組的移植瘤質(zhì)量為（0.37±0.10）g，顯著低于對照組的（0.91±0.08）g（t=9.51，P＜0.001）。詳見圖3 B和圖3 C。

3 討論

我國是食管鱗癌的高負(fù)擔(dān)國家，過量飲酒、吸煙等對食管造成損傷的各類慢性刺激及環(huán)境因素是中國食管鱗癌發(fā)病的主要原因［13-14］。過去幾十年，不同于肺癌等其他腫瘤，食管鱗癌在靶向治療方面發(fā)展緩慢，5年生存率改善程度低，亟需在食管鱗癌治療靶點發(fā)現(xiàn)和抑制劑探索方面進行深入研究［3，15］。

腫瘤靶向藥物主要是利用腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞間分子生物學(xué)上的差異（癌基因的突變激活或異常高表達）而抑制腫瘤細(xì)胞生長，促進其凋亡壞死，同時降低對正常組織的損害［16］。NVP - BEZ235 是一種 新 型PI3K /mTOR 雙重抑制劑，其化學(xué)成分是咪唑并喹啉類的小分子合成物，NVP-BEZ235 可與PI3K 和mTOR 激酶的ATP結(jié)合口袋結(jié)合，抑制其激酶活性［17］。有研究表明，NVP-BEZ235在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等腫瘤中均能產(chǎn)生有效的抗腫瘤活性［12，17-19］。NVP-BEZ235 可誘導(dǎo)p21 基因表達而阻滯細(xì)胞周期［20］。NVP-BEZ235 還可通過抑制mTORSer2448位點的去磷酸化下調(diào)mTOR 的活性，進而抑制AKTSer473位點磷酸化，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［18，21］。本研究中探討了NVP - BEZ235 對食管鱗癌細(xì)胞系的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 nmol/L NVP-BEZ235便可對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生明顯抑制，提示NVP-BEZ235 對食管鱗癌的細(xì)胞增殖抑制效果良好。

Ⅰ型PI3K分為ⅠA型（p110α，p110β，p110γ）和ⅠB型（p110δ），其中由p110α 和p85α 組成的ⅠA 類PI3K 是目前研究最廣泛的類型，主要參與細(xì)胞生長、胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和葡萄糖代謝［5］。p85α 由5 個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。SH3（Src homology 3 domain）結(jié)構(gòu)域、GAP 結(jié)構(gòu)域（a Rac binding domain flanked by two proline - rich domains，nPRD and cPRD）、N- 端SH2（nSH2）結(jié)構(gòu)域、SH2間（iSH2）結(jié)構(gòu)域和C-端SH2（cSH2）結(jié)構(gòu)域組成。p85α 的主要功能是穩(wěn)定和結(jié)合抑制p110α。p85α 的iSH2結(jié)構(gòu)域與p110α 的結(jié)合對p110α 的蛋白穩(wěn)定性十分重要。但當(dāng)細(xì)胞受到胞外刺激時，nSH2與cSH2結(jié)構(gòu)域可和酪氨酸激酶受體及接頭蛋白中磷酸化的酪氨酸結(jié)合，破壞iSH2結(jié)構(gòu)域?qū)110α 的接觸抑制，從而促進p110α 催化亞基的激活，最終引起PI3K激酶活化［22-24］。據(jù)報道，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測了590 例石蠟包埋的食管鱗癌腫瘤組織中PI3K-p85α 蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)57.1%的腫瘤組織高表達PI3K-p85α，且PI3K-p85α的高表達與不良預(yù)后顯著相關(guān)［25］。本研究結(jié)果表明，PI3K -p85α 的高表達可顯著提高NVP - BEZ235 對食管鱗癌細(xì)胞的抑制作用。在食管鱗癌細(xì)胞系KYSE30，KYSE70，KYSE510，TE1 中，10 nmol/ L NVP - BEZ235具有明顯的抑制作用。而PI3K-p85α 相對低表達的食管鱗癌細(xì)胞系KYSE150，KYSE180，KYSE270，KYSE450對NVP-BEZ235 的敏感度較低。裸鼠移植瘤實驗結(jié)果表明，腹腔注射較低劑量（10 mg/kg）的NVP-BEZ235促使移植瘤體積明顯縮小，表明NVP-BEZ235 對食管鱗癌體內(nèi)模型的療效較好。

綜上所述，較低劑量（10 mg/kg）NVP-BEZ235 可在細(xì)胞系模型和裸鼠皮下移植瘤中抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖，且PI3K - p85α 高表達可顯著增強NVP -BEZ235對食管鱗癌細(xì)胞的抑制作用。