原花色素對(duì)雞胸肉肌原纖維蛋白凝膠特性影響

鄭卓琦 李 巖 李松艷 馮冠霖 李靜媛

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266109)

雞胸肉作為一種經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的食品,由于雞肉營(yíng)養(yǎng)豐富,適宜微生物生長(zhǎng)繁殖,極易腐敗且腐敗問題嚴(yán)重制約中式快餐企業(yè)規(guī)?；耐七M(jìn)。雞胸肉質(zhì)量主要由其肌原纖維蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)、流變等特性決定。提取肉制品中的肌原纖維蛋白是對(duì)肉制品中蛋白質(zhì)性質(zhì)專門研究的一種方案。肌原纖維蛋白凝膠的形成是基于蛋白質(zhì)的鹽析作用,使蛋白質(zhì)在溶液中發(fā)生團(tuán)聚和沉淀。凝膠的穩(wěn)定性在一定程度上是蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的體現(xiàn)[1]。熱加工是生產(chǎn)肌原纖維蛋白凝膠的常用方法之一[2]。在蛋白質(zhì)的加熱過程中,蛋白質(zhì)骨架斷裂,疏水基團(tuán)暴露。隨著溫度的升高,蛋白質(zhì)聚集,α-螺旋結(jié)構(gòu)展開,逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的凝膠化來源于蛋白質(zhì)之間通過共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的交聯(lián),包括離子鍵、氫鍵、疏水作用、二硫鍵等共價(jià)鍵[3-4]。通過研究凝膠的保水性、凝膠強(qiáng)度、抗氧化性等因素,可以從側(cè)面反映出蛋白質(zhì)的一些生理特性。因此,提高雞胸肉肌原纖維蛋白的保護(hù)機(jī)制以及其肉制品品質(zhì)具有重要意義。

原花色素是廣泛存在于植物中的一類黃酮類化合物,是天然抗氧化劑。Xu等[5]研究發(fā)現(xiàn),表沒食子兒茶素沒食子酸(EGCG)的添加可提高大豆分離蛋白的成膠速率,形成更均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),從而改善大豆分離蛋白的凝膠性能。Ferreira等[6]發(fā)現(xiàn)原花色素富含疏水芳香環(huán)和羥基,可通過氫鍵和疏水作用與蛋白質(zhì)相互作用,通過填充作用支撐和穩(wěn)定蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)支架,還能與蛋白質(zhì)產(chǎn)生相互作用,有效增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度和持水能力。Jia等[7]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)兒茶素添加量大于2.9 g/kg蛋白時(shí),兒茶素引起的疏水結(jié)構(gòu)域被暴露,凝膠中的巰基(S-H)含量明顯降低,在超過14.5 g/kg時(shí)凝膠嚴(yán)重惡化,在此濃度下兒茶素對(duì)凝膠產(chǎn)生了極不利的影響。Lee等[8]研究表明,兒茶素或原花青素的添加對(duì)3D打印材料有強(qiáng)化作用,且添加物具有更好的打印性和凝膠性。研究表明,原花青素可以降低凝膠的表面疏水性,從而改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),添加原花青素可以保護(hù)肉制品免受紫外線誘導(dǎo)的光損傷,是減輕紫外線誘導(dǎo)的氧化損傷的有效策略[1,9]。

原花色素現(xiàn)主要應(yīng)用領(lǐng)域?yàn)轸~油微膠囊的壁材和部分保健食品的添加劑,但在研究中發(fā)現(xiàn)其潛在的生物功效并沒有很好的應(yīng)用于醫(yī)療或其他領(lǐng)域,在很多食品領(lǐng)域的功能尚未開發(fā)完全。本研究設(shè)計(jì)一定濃度范圍原花色素對(duì)雞胸肉肌原纖維蛋白的影響,以及添加原花色素后,凝膠理化性質(zhì)隨時(shí)間的變化。本研究目的在于通過研究原花色素對(duì)蛋白凝膠特性的影響,反應(yīng)其對(duì)雞胸肉中最重要的蛋白肌原纖維蛋白的影響,從而探究原花色素是否可以作為一種天然的食品添加劑加入至雞胸肉中。Cao等[10]研究了添加0.1 g/kg原花色素單倍體可以提高凝膠的氧化穩(wěn)定性,但是Jongberg等[11]研究發(fā)現(xiàn)在添加量為0.5 g/kg時(shí),原花色素對(duì)肉及其凝膠產(chǎn)生了負(fù)面影響,其基質(zhì)包括觸覺、味覺和視覺與空白組對(duì)比均出現(xiàn)明顯差異,且凝膠形成不穩(wěn)定。本研究補(bǔ)足了0.1～0.5 g/kg濃度區(qū)間原花色素對(duì)凝膠的影響,研究了原花色素對(duì)凝膠影響的關(guān)鍵濃度,確定了原花色素的最適添加量及在合適添加量的條件下凝膠的變化情況,對(duì)原花色素的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供了可參考的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮雞胸肉購自大潤(rùn)發(fā)超市。兒茶素、原花色素二聚體和原花色素四聚體購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,純度為99.9%。葡萄籽購自山東煙臺(tái)部分酒莊。

藥品EDTA、EDTA-2Na、NaCl、Tris-HCl、Triton X-100、Na2HPO4、NaH2PO4、香蘭素和濃硫酸為分析純,均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。藥品CH3CN、HOAc、CH3OH、C3H6O、兒茶素為色譜純,購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原花色素制備與檢測(cè)

參考李春陽[12]和周蒙等[13]、楊成東[14]和張兵兵等[15]的試驗(yàn)方案,稱取20 g葡萄籽用冷凍-研磨機(jī)研磨,研磨后的粉末過100目篩。過濾后的粉末用索氏抽提器抽提8 h去除油脂和脂肪。之后用真空冷凍干燥機(jī)對(duì)溶液進(jìn)行凍干。凍干后將凍干粉取出,按料液比1∶14加入50%乙醇中,再加入0.56 g/L纖維素酶,靜置30 min。將溶液微波消解,微波處理時(shí)間6 min,微波功率800 W,微波溫度60 ℃。后將溶液在4 ℃下8 000 g離心10 min,取上清液凍干,得到的凍干粉即為原花色素粉末。

參考石磊等[16]的方法,采用香草醛-鹽酸法檢測(cè)原花色素的濃度。根據(jù)周蒙等[13]和樊金玲[17]的試驗(yàn)方法,采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器(HPLC-FLD)檢測(cè)提取的原花色素組分。使用C-18液相色譜柱,流速為1.0 mL/min,柱溫35 ℃,以0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相A,甲醇為流動(dòng)相B, 進(jìn)行梯度洗脫。

1.2.2 凝膠的制備

參考魯小川等[18]的方法并加以修改, 將切碎的雞胸肉進(jìn)行多次鹽析去雜并通過三層紗布過濾去除結(jié)締組織和脂質(zhì),在10 000 g離心10 min后,用冷蒸餾水洗滌沉淀2次。本研究中使用的蛋白質(zhì)是從最終收集的沉積物中獲得的,將提取的肌原纖維蛋白粗粉(Myofibrillar protein crude powder, MP)粉末與磷酸鹽緩沖液混合,形成濃度為100 mg/mL的MP溶液。將50 mL MP溶液置于80 mL燒杯中。此時(shí),分別向燒杯中添加0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 g/kg 原花色素。并將其置于水浴中以1 ℃/min的速度從室溫升至80 ℃,在黑暗條件中進(jìn)行,80 ℃保溫30 min。然后將燒杯轉(zhuǎn)移至-20 ℃冷卻10 min,棄去液體,剩余部分為合成的凝膠。

1.2.3 凝膠色澤測(cè)定

根據(jù)Filipecki等[19]的方法對(duì)凝膠色澤進(jìn)行測(cè)定,采用全自動(dòng)色差儀進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)樣品均被切成小立方體(1 cm×1 cm×1 cm)上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 凝膠微觀結(jié)構(gòu)

凝膠微觀結(jié)構(gòu)采用拉曼顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)并記錄,樣品被切成1 mm薄片進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 凝膠結(jié)構(gòu)強(qiáng)度的測(cè)定

根據(jù)王秀娟等[20]研究的方法,制備的MP凝膠經(jīng)過全自動(dòng)切割機(jī)切成小立方體(1 cm×1 cm×1 cm),采用P50探針測(cè)試硬度、咀嚼性和彈性,并根據(jù)質(zhì)構(gòu)剖面分析(TPA)計(jì)算出最佳測(cè)試條件為:應(yīng)變(40%)、觸發(fā)力(10 g)、測(cè)試前、測(cè)試中和測(cè)試后速度(1、0.5和1 mm/s)和間隔時(shí)間(10 s)。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜和拉曼光譜光譜分析

參考林玲[21]的研究方法,取小部分MP凝膠在真空冷凍干燥機(jī)中凍干后研磨成粉,采用KBr壓片法制備樣品上機(jī)檢測(cè)。掃描波長(zhǎng)為500～4 000 cm-1,分辨率為4 cm-1,掃描頻率為64。

根據(jù)薛思雯[22]研究的方法并根據(jù)儀器調(diào)試參數(shù),激光功率10.0 mW, 曝光時(shí)間2 Hz, 掃描次數(shù)350。

1.2.7 低場(chǎng)核磁共振

根據(jù)孫任寬等[23]的研究方法并做了優(yōu)化,諧振頻率為22.6 MHz、累加次數(shù)NS為32,在室溫條件下對(duì)水的遷移率和分布進(jìn)行了評(píng)估。將約2 g MP凝膠置于直徑為15 mm圓柱形玻璃管中,插入核磁共振探針中檢測(cè)。

1.2.8 流變學(xué)特性

根據(jù)湯回花等[24]的研究方法,采用配備鋼平行板幾何結(jié)構(gòu)的流變儀評(píng)價(jià)黏彈性性能。將未加熱的1.5 mL MP溶液置于平板表面,立即用硅油密封。采用10 Hz的恒定頻率,在以下程序下監(jiān)測(cè)儲(chǔ)能模量(G’)和損耗模量(G”):以0.5 ℃/min從30 ℃加熱至80 ℃。此外,對(duì)熱處理結(jié)束(80 ℃)的凝膠樣品進(jìn)行了頻率掃描測(cè)試,應(yīng)變范圍為0～100 Hz。

1.2.9 硅壓阻式力敏傳感器測(cè)量凝膠體積

根據(jù)陳瑩梅等[25]的研究方法并改進(jìn),將制備好的凝膠用超聲波切割機(jī)切割出1 cm×1 cm×1 cm的立方體。將切下的樣品放入檢測(cè)器中10 s后讀取,可以防止因凝膠表面張力而造成的數(shù)據(jù)誤差。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每份樣品測(cè)定3次。試驗(yàn)采用origin軟件繪制圖表和IBM SPSS Statistics軟件分析數(shù)據(jù)顯著性差異和誤差等。

2 結(jié)果與分析

2.1 原花色素提取分析

以兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程:Y=0.001 191X+0.001 23,R2=0.999。根據(jù)公式最終提取率為(4.69±0.11)%(w/w),相對(duì)偏差為0.638%。

根據(jù)圖1液相色譜圖數(shù)據(jù)分析,該方法提取的原花色素主要成分為原花色素二聚體,其中兒茶素、原花色素二聚體和原花色素四聚體的比例約為5∶31∶4,因?yàn)樵ㄉ囟垠w相較于兒茶素具有更高的抗氧化活性[13],故提取的原花色素對(duì)凝膠抗氧化作用應(yīng)存在有利影響。由圖1可知,從葡萄籽中提取的原花色素含有兒茶素、二聚體和四聚體。但出現(xiàn)連峰和雜峰的情況,是因?yàn)樵ㄉ靥崛∥镏兴煞直容^復(fù)雜,有許多的同分異構(gòu)體[26]。

2.2 凝膠特性分析

圖2顯示的是添加不同濃度提取的原花色素后形成的凝膠外觀。從圖2和表1色差儀檢測(cè)的數(shù)據(jù)可以看出,由于提取的原花色素呈現(xiàn)鮮紅色,故添加后對(duì)所產(chǎn)生的凝膠色澤有所影響,且當(dāng)原花色素添加量≥0.30 g/kg時(shí),凝膠的狀態(tài)不穩(wěn)定且外觀架構(gòu)及顏色中的白值不穩(wěn)定,沒有研究?jī)r(jià)值,最終確定為0～0.20 g/kg原花色素添加量。

表1 不同濃度原花色素對(duì)顏色的影響Table 1 Effects of PAS on gel chromatic aberration

采用雙縮脲法對(duì)提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),測(cè)得純度為(90.08±2.27)%,與先前研究[27-28]開展凝膠研究的蛋白質(zhì)提取純度大致相同。

紅色曲線為含兒茶素、原花色素二聚體和原花色素四聚體的混合標(biāo)品的HPLC-FLD色譜圖,黑色曲線為凍干法后重新溶解的原花色素的HPLC-FLD色譜圖,圖中T1-3為物質(zhì)出鋒時(shí)間。The red curve was the HPLC-FLD of the mixed standard substance containing catechin, proanthocyanin dimer and proanthocyanin tetra. The black curve was the HPLC-FLD of the proanthocyanin redissolved after lyophilization. T1-3 in the figure was the material retention time.圖1 提取的PAS與標(biāo)品的HPLC-FID高效液相色譜圖Fig.1 Label and extracted PAS of HPLC-FID

(a)、(b)和(c)列分別為添加了0.10、0.20和0.30 g/kg原花色素后形成的凝膠形態(tài)。Column (a), (b) and (c) showed the gel after adding 0.10, 0.20 and 0.30 g/kg PAS.圖2 不同濃度原花色素對(duì)凝膠外觀的影響Fig.2 Effects of PAS on gel appearance

2.3 凝膠表征分析

2.3.1 凝膠含水量及體積分析

保水性是評(píng)價(jià)肉及肉制品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,在加熱過程中蛋白結(jié)構(gòu)的展開、變性和聚集以及與原花色素的聚合作用之間的相互作用都會(huì)影響凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成,并最終改變凝膠的保水性[29]。圖3中3個(gè)峰從左到右依次為結(jié)合水、不易流動(dòng)水和自由水,當(dāng)H原子處于不同分子上或處于不同物理狀態(tài)下的樣品中時(shí),其弛豫時(shí)間會(huì)有所不同[30]。從圖4可以看出,在添加原花色素的凝膠形成的0 d,3種水的弛豫時(shí)間對(duì)比空白組均顯著延遲,說明形成的凝膠中的H原子核能被激發(fā)后恢復(fù)到原來平衡狀態(tài)所需的時(shí)間增多,H原子核可以儲(chǔ)存更多的能量,凝膠系統(tǒng)由一個(gè)平衡態(tài)到達(dá)另一個(gè)平衡態(tài)所用的平均時(shí)間間隔更長(zhǎng),說明了原花色素的加入使得凝膠中H原子核需要吸收更多的能量才會(huì)發(fā)生改變,側(cè)面說明了原花色素增強(qiáng)了凝膠持水的穩(wěn)定性。弛豫時(shí)間的延遲證明原花色素對(duì)凝膠的水分子的固定起到了增強(qiáng)作用。其原因可能是部分凝膠分子在聚合過程中與原花色素形成了具有較多結(jié)合水的空間結(jié)構(gòu),也可能是原花色素在凝膠形成階段與大量羥基反應(yīng)使H原子暴露較多。

T1、T3、T5為空白組的結(jié)合水、不易流動(dòng)水和自由水的出峰時(shí)間;T2、T4、T6為添加原花色素組的結(jié)合水、不易流動(dòng)水和自由水的出峰時(shí)間。T1, T3 and T5 were the peak time of combined water, immobilized water and free water in the blank contrast; And T2, T4 and T6 were the peak time of combined water, immobilized water and free water in the PAS group.圖3 凝膠形成時(shí)低場(chǎng)核磁共振圖Fig.3 Low-field NMR during gel formation

圖4和表2給出了5個(gè)樣品隨時(shí)間變化的低場(chǎng)核磁共振檢測(cè)圖。在隨時(shí)間變化的檢測(cè)中,只有T1和T2的弛豫時(shí)間在5 d及以后的檢測(cè)中再次提前。其原因可能是原花色素的羥基與凝膠的部分氨基酸分子在空氣氧化作用下形成了較為穩(wěn)定的結(jié)合水。也就是說,原花色素誘導(dǎo)了游離水向固定化水的轉(zhuǎn)化,凝膠中的水分流動(dòng)受到了某種限制,這種現(xiàn)象可能歸因于良好的聚集性。

表2 凝膠形成后隨時(shí)間推移的弛豫時(shí)間及占比Table 2 Relaxation time and proportion with gel formation over time

圖4 凝膠形成后隨時(shí)間推移的低場(chǎng)核磁共振圖Fig.4 Low-field NMR change gel formation over time

從圖5可以看出,在0 d時(shí),雖然切割參數(shù)設(shè)定為1 cm×1 cm×1 cm,但硅壓阻式力敏傳感器測(cè)得的體積仍不足1 cm3,這可能是因?yàn)榍懈顧C(jī)的誤差,也可能是凝膠形成時(shí)結(jié)構(gòu)不均勻或產(chǎn)生大孔導(dǎo)致。由數(shù)據(jù)可知,原花色素加入后形成的凝膠具有更緊密的空間結(jié)構(gòu),凝膠密度也更大,水分子不易揮發(fā),保水性更強(qiáng)。前10 d時(shí),凝膠體積與原花色素添加量呈正相關(guān)。10 d后,添加0.15和0.20 g/kg原花色素的凝膠體積迅速下降,但仍高于空白對(duì)照,可能是由于凝膠表面氧化孔隙變大變軟導(dǎo)致測(cè)量時(shí)散落。因此,可以推斷,在添加0～0.2 g/kg原花色素濃度下,凝膠的保水性隨著時(shí)間的推移相比于空白組更加穩(wěn)定,高濃度原花色素短期保水性較好,但長(zhǎng)期保水性下降較快。

圖5 凝膠隨時(shí)間推移的體積變化Fig.5 Volume change of gel over time

2.3.2 紅外光譜和拉曼光譜分析

利用紅外光譜進(jìn)一步研究了蛋白質(zhì)-原花色素分子間的相互作用。如圖6所示,中心位于3 000～3 600 cm-1的寬帶歸屬為O-H和N-H基團(tuán),暗示了氫鍵相互作用的潛力增強(qiáng)[31-32]。這意味著隨著原花色素的加入,凝膠力中O-H和N-H基團(tuán)增加,也可能是原花色素本身自帶的O-H和N-H基團(tuán)導(dǎo)致了氫鍵相互作用的增加。與空白相比,O-H和N-H基團(tuán)在3 000～3 500 cm-1處出現(xiàn)伸縮振動(dòng),0.15%和0.20%原花色素試驗(yàn)組的強(qiáng)度增強(qiáng),表明分子間和分子內(nèi)氫鍵強(qiáng)度增強(qiáng)。這是影響蛋白質(zhì)之間親和力的有利變化。MP凝膠表面的強(qiáng)氫鍵勢(shì)有助于蛋白質(zhì)之間的穩(wěn)定和有序,加速了蛋白質(zhì)的重排和聚集過程[9]。在2 300 cm-1左右是產(chǎn)生氣體的峰,這與凝膠生產(chǎn)時(shí)觀察到的表面一致,隨著原花色素濃度的升高,凝膠表面出現(xiàn)的微氣泡增多且更加透軟,但切開后內(nèi)部仍十分緊實(shí),這可能是蛋白質(zhì)的某些集團(tuán)與原花色素活躍的羥基發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生的氣體有關(guān)。

圖6 凝膠形成時(shí)的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrum of gel formation during gel formation

近年來,許多研究利用拉曼光譜來反映蛋白質(zhì)凝膠的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)信息。凝膠性質(zhì)與二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)。通常用酰胺Ⅰ(1 600～1 700 cm-1)和酰胺Ⅲ(1 200～1 300 cm-1)的拉曼光譜來測(cè)量二級(jí)結(jié)構(gòu)[19]。圖6顯示了0 d時(shí)不同濃度原花色素處理后凝膠的拉曼光譜。通過高斯曲線和傅里葉自反卷積擬合分析以1 652 cm-1為中心的酰胺Ⅰ帶和以 1 234 cm-1為中心的酰胺Ⅱ帶和波長(zhǎng)為1 509～1 592 cm-1為酰胺Ⅱ區(qū),分析蛋白的結(jié)構(gòu)。1 652、1 663、1 674和 1 683 cm-1的條帶分別為α螺旋、無規(guī)卷曲、β-折疊和β轉(zhuǎn)角[33]。(1 235±10) cm-1波長(zhǎng)是β-折疊在酰胺Ⅲ帶的表現(xiàn)[34]。920～1 180 cm-1波長(zhǎng)為N-Cα-C骨架伸縮振動(dòng),被一些作者歸類為酰胺模式[35]。

由圖7可知,添加原花色素的凝膠中,α-螺旋總量與原花色素添加量無明顯相關(guān)性,但1 650 cm-1左右酰胺Ⅰ帶對(duì)比空白組的擬合峰面積都減少了,這意味著α-螺旋總量的減少。這種減少可能是由于凝膠主要部分中相當(dāng)數(shù)量的α-螺旋的解旋化造成的。需要指出的是,α-螺旋中的肽鍵可能形成氫鍵[36],因此,α-螺旋非常穩(wěn)定。本研究中,加入原花色素后,α-螺旋有很大程度的解旋化,分子內(nèi)疏水基團(tuán)的暴露似乎有利于解旋化作用后凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成和新蛋白折疊的出現(xiàn)(β-折疊)。從而促進(jìn)了疏水作用和凝膠化的穩(wěn)定。

圖7 凝膠形成時(shí)的拉曼光譜圖Fig.7 Raman spectra of gel formation during gel formation

圖8(a)和(b)檢測(cè)到的是酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶的β-折疊。在0 d時(shí)形成凝膠時(shí),添加了原花色素形成的凝膠中β-折疊的含量均高于空白對(duì)照組,這與α-螺旋總量減少,減少的α-螺旋部分轉(zhuǎn)化成了β-折疊推論相吻合。隨著時(shí)間推移,空白組與試驗(yàn)組的β-折疊含量雖均出現(xiàn)下降趨勢(shì),但試驗(yàn)組的β-折疊含量仍高于空白組。這可能是因?yàn)樘砑恿嗽ㄉ氐哪z在形成過程中原花色素的聚合帶走了凝膠中部分氨基酸的電荷。隨著相同電荷的減少和不同電荷的增加,肽鏈之間形成的β-折疊變得更強(qiáng)和更穩(wěn)定。但隨著時(shí)間的推移,特別是5～10 d,β-折疊有快速下降的趨勢(shì),10 d后繼續(xù)緩慢下降,可能是凝膠中部分氫鍵或S-S鍵被氧化斷裂,導(dǎo)致凝膠不穩(wěn)定。

根據(jù)圖8(c)可以得出,在凝膠形成的0 d時(shí),原花色素的加入量與N-Cα-C骨架伸縮振動(dòng)的強(qiáng)度范圍呈負(fù)相關(guān),這很可能是由于原花色素中大量的C=O、羥基或苯環(huán)增強(qiáng)了凝膠中某些氨基酸的N-Cα-C穩(wěn)定性,抑制了N-Cα-C骨架伸縮振動(dòng)的振幅,導(dǎo)致檢測(cè)到的N-Cα-C骨架伸縮振動(dòng)低于空白組。但隨著時(shí)間的推移,原花色素的強(qiáng)化穩(wěn)定作用逐漸減弱,空白組與試驗(yàn)組能檢測(cè)到的N-Cα-C骨架伸縮振動(dòng)強(qiáng)度均呈現(xiàn)上升趨勢(shì),這可能與凝膠被氧化導(dǎo)致的密度變小、表面硬度降低、凝膠空隙變大有關(guān)。

酰胺Ⅱ區(qū)有N-H面內(nèi)彎曲、C-N拉伸、C-O面內(nèi)彎曲和C-C拉伸[37-38]。根據(jù)圖8(d)可以得出,隨著原花色素的加入,酰胺Ⅱ區(qū)的檢測(cè)強(qiáng)度也增強(qiáng),可能是由于原花色素分子中存在C-C、C-O鍵使得檢測(cè)信號(hào)增強(qiáng)。但酰胺Ⅱ區(qū)的強(qiáng)度仍隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大?？赡艿脑蚴茄趸兔撍┞读缩０发騾^(qū)域的C-C拉伸和C-O面內(nèi)彎曲,從而檢測(cè)到了較大的信號(hào)強(qiáng)度。

圖8 凝膠隨時(shí)間推移的拉曼光譜部分波長(zhǎng)峰面積擬合圖Fig.8 Fitting diagram of partial wavelength peak area of Raman spectra

2.3.3 流變性能分析

儲(chǔ)能模量(G’)和損耗模量(G”)是表征凝膠粘彈性的重要指標(biāo)。動(dòng)態(tài)流變分析對(duì)研究肌肉加工過程中蛋白質(zhì)功能特性非常有用,有助于研究凝膠形成過程[29]。從圖9(a)和(g)可以看出,隨著溫度的升高,G’逐漸減小,在48 ℃時(shí)達(dá)到最低點(diǎn),然后繼續(xù)上升到80 ℃,G’繼續(xù)增加到穩(wěn)定狀態(tài), Sovrani等[39]也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。G’的增加表明凝膠或彈性蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的初步形成。48 ℃前G’的暫時(shí)性下降是由于肌球蛋白重鏈的伸縮和交聯(lián),可能是由于肌球蛋白尾部變性,主要涉及非共價(jià)鍵的解離和分子間的暫時(shí)性相互作用,從而增加了肌球蛋白的流動(dòng)性[8]。進(jìn)一步升溫后,疏水基團(tuán)的形成和二硫鍵的相互作用增加了蛋白質(zhì)聚集體的相互作用,形成了良好的絲狀結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致G’增大,說明黏性溶膠狀態(tài)向彈性凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[40-41]。隨后G’迅速增加,在72 ℃時(shí)增長(zhǎng)放緩,說明凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)完全形成。原花色素的添加,使得凝膠形成的G’均高于空白對(duì)照組,說明凝膠存儲(chǔ)彈性變形能量的能力增加。對(duì)流變完成后的樣品進(jìn)行觀察,與在水浴鍋中凝膠的形成表態(tài)相似,形貌為絮狀凝聚塊。

根據(jù)圖9(b)和圖9(f)可以得出,隨著原花色素的加入,G”也呈現(xiàn)上升趨勢(shì),G’是G”的5倍多。隨著溫度的升高,在70 ℃左右達(dá)到峰值,之后呈下降趨勢(shì)。當(dāng)添加量為0～0.20 g/kg時(shí),凝膠的黏度隨添加量的增加而增加,且高于空白對(duì)比。從圖9(e)可以看出,隨著原花色素濃度增加,實(shí)驗(yàn)組和空白組的MP溶液的復(fù)合模量均繼續(xù)增加,其粘彈性不斷增強(qiáng),向著形成凝膠的方向發(fā)展。從圖9(g)和(h)可以看出,隨著溫度、頻率和原花色素添加量的不斷增加,凝膠的儲(chǔ)能模量和損耗模量都在增加,但儲(chǔ)能模量的增長(zhǎng)速度明顯高于損耗模量的增長(zhǎng)速度,證明在加熱過程中形成的凝膠,在頻率掃描過程中也表現(xiàn)出一定程度的凝膠穩(wěn)定性。

圖9(c)、(d)和(h)中的頻率掃描表明,在0～0.20 g/kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨著原花色素和掃描頻率的增加,除0.15和0.20 g/kg的原花色素實(shí)驗(yàn)組,凝膠的G’和G”均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。但從添加0.15 和0.20 g/kg原花色素的凝膠的數(shù)據(jù)可以看出凝膠已經(jīng)表現(xiàn)出一定的不穩(wěn)定性。當(dāng)添加量為0.05 g/kg時(shí),PG的復(fù)合黏度數(shù)據(jù)與空白對(duì)比無明顯差異。當(dāng)添加量為0.05～0.20 g/kg時(shí),可以看出原花色素的添加增強(qiáng)了凝膠的強(qiáng)度,但在0.20 g/kg時(shí)也存在不穩(wěn)定性。隨著原花色素添加量的增加,凝膠的硬度和黏度增加,但PG在0.20 g/kg時(shí)存在不穩(wěn)定性,這與質(zhì)構(gòu)、拉曼和紅外檢測(cè)結(jié)果一致。

2.3.4 質(zhì)構(gòu)分析

圖10(a)中的咀嚼性數(shù)據(jù)顯示,0.05 g/kg原花色素添加量的咀嚼性低于空白組?？紤]到原花色素濃度過低時(shí)形成的凝膠黏附性和黏聚力不足,對(duì)二硫鍵和酰胺鍵的影響不穩(wěn)定,導(dǎo)致0.05 g/kg時(shí)咀嚼性較低。但隨著原花色素用量的增加,可以看出咀嚼性有非常迅速的增長(zhǎng)趨勢(shì)。隨著時(shí)間的推移,各濃度試驗(yàn)組中的咀嚼性隨時(shí)間迅速下降?？梢钥闯?原花色素在凝膠形成過程中可以起到抗氧化和穩(wěn)定作用,但原花色素容易聚合,低聚物形式過多,在參與凝膠形成時(shí)會(huì)因?yàn)椴煌瘓F(tuán)的種類和數(shù)量影響凝膠的穩(wěn)定性[42]。隨著時(shí)間的推移,不同的分子基團(tuán)由于氧化而轉(zhuǎn)變?yōu)樾碌姆肿有螒B(tài),導(dǎo)致凝膠外的凝膠層發(fā)生軟化。將20 d凝膠切片后發(fā)現(xiàn),凝膠表面柔軟、柔嫩,無凝膠特性,但中心部分仍顯示凝膠特性。這與拉曼顯微鏡的觀察趨勢(shì)一致。

從圖10(b)可以看出,凝膠的彈性與原花色素添加量呈正相關(guān),在4 ℃貯藏20 d后,原花色素組的彈性衰減率低于空白組,衰減率比空白組平均低13.574%。根據(jù)數(shù)據(jù)推測(cè),彈性下降與凝膠20 d內(nèi)游離水流失和二硫鍵破壞有關(guān)。從圖6也可以看出,硅壓阻式力敏傳感器測(cè)量的凝膠體積下降也表明凝膠有一定程度的收縮和塌陷。但從數(shù)據(jù)來看,實(shí)驗(yàn)組的凝膠崩解速率比空白對(duì)照組慢。這可能是由于在凝膠形成的加熱過程中,原花色素中的C-環(huán)與凝膠顆粒中的C-C、C-N鍵發(fā)生聚合,加強(qiáng)了凝膠中鍵之間的相互作用[29]。從圖10(c)可以看出,隨著試驗(yàn)組原花色素濃度的增加,形成的凝膠硬度增加,并且隨著時(shí)間的推移,凝膠硬度仍然增加,這與凝膠的失水直接相關(guān)。20 d時(shí),兩組自由水含量均顯著降低,凝膠呈現(xiàn)硬脆特性。

同時(shí)發(fā)現(xiàn),在質(zhì)構(gòu)儀檢測(cè)過程中,實(shí)驗(yàn)組比空白組更加不穩(wěn)定,誤差更大。分析認(rèn)為,在凝膠形成的加熱過程中,形成了不同的原花色素低聚物或聚合物,不同的聚合物對(duì)S-S鍵的影響不同,使得試驗(yàn)組的穩(wěn)定性低于空白組。

2.3.5 微觀結(jié)構(gòu)分析

通過對(duì)比圖11(a)和(b)的顯微圖像,空白組凝膠表面粗糙,結(jié)構(gòu)紊亂,說明凝膠化過程中蛋白質(zhì)分子沒有充分展開,彼此之間沒有很好的連接。隨著原花色素的加入,凝膠網(wǎng)絡(luò)變得更加規(guī)則和均勻,從圖11(c)和(d)中可以看出形成的凝膠孔隙更加致密且并不會(huì)隨時(shí)間變化使得凝膠結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較大程度的變化。高度互聯(lián)、緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可能會(huì)表現(xiàn)出更大的抗外應(yīng)力,通過毛細(xì)管效應(yīng)為包裹水提供更多的空間,從而提高凝膠強(qiáng)度和保水性。此外,基于原花色素的自我聚集效應(yīng),團(tuán)聚的原花色素可以充當(dāng)填料填充網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),且這些填充效應(yīng)在較高濃度時(shí)似乎更加明顯。

(a)儲(chǔ)能模量隨溫度的變化;(b)損耗模量隨溫度的變化;(c)儲(chǔ)能模量隨頻率的變化;(d)損耗模量隨頻率的變化;(e)復(fù)合模量隨溫度的變化;(f) 儲(chǔ)能模量/損耗模量G’/G”;(g)儲(chǔ)能模量與損耗模量隨溫度的變化;(h)儲(chǔ)能模量和損耗模量隨頻率的變化。(a) Change of storage modulus with temperature; (b) Change of loss modulus with temperature; (c) Change of storage modulus with frequency; (d) Change of loss modulus with frequency; (e) Change of composite modulus with temperature; (f) G’/G”; (g) Change of storage modulus and loss modulus with temperature; (h) Change of storage modulus and loss modulus with frequency.圖9 凝膠隨時(shí)間變化的流變學(xué)數(shù)據(jù)Fig.9 Rheology data change of gel over time

(a)凝膠咀嚼性隨時(shí)間的變化;(b)凝膠彈性隨時(shí)間的變化;(c)凝膠硬度隨時(shí)間的變化。(a) Change of chewness with time; (b) Change of springness with time; (c) Change of hardness with time.圖10 凝膠隨時(shí)間變化的質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)Fig.10 Texture data change of gel over time

根據(jù)圖11(a)和(c)可以看出,0 d形成的凝膠表面和內(nèi)部凝膠結(jié)構(gòu)不同,這與低場(chǎng)核磁共振檢測(cè)、體積檢測(cè)和質(zhì)構(gòu)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)的問題一致。考慮可能是凝膠形成過程中凝膠外層表皮與溶液過度接觸所致。研究發(fā)現(xiàn),如果在0 d時(shí)剝除凝膠所有表層部分,那么20 d可見兩組凝膠均出現(xiàn)大面積塌陷,考慮凝膠在被氧化的過程中產(chǎn)生了大量的羧基導(dǎo)致。

(a)0 d空白對(duì)照組;(b)20 d空白對(duì)照組;(c)0 d 0.20 g/kg原花色素;(d)20 d 0.20 g/kg原花色素。(a) Blank contrast on day 0; (b) Blank contrast on day 20; (c) PAS group on day 20; (d) PAS group on day 20.圖11 凝膠隨時(shí)間變化的微觀圖Fig.11 Microscopic graph change of gel over time

3 結(jié) 論

本研究填補(bǔ)了Ferreira等[6]與Jia等[7]研究中PAS濃度范圍的空缺,找到了PAS濃度對(duì)肌原纖維蛋白凝膠影響的拐點(diǎn)。本研究首次引入硅壓阻式力敏傳感器測(cè)量凝膠體積,在原有的凝膠常用表征方法[43-44]上豐富了凝膠數(shù)據(jù)支撐,使得凝膠表征數(shù)據(jù)更加完整。通過微觀和宏觀的結(jié)果表明,PAS的加入提升了凝膠保存自由水的能力,減緩了流動(dòng)水隨時(shí)間的損耗速度,通過提高凝膠的空間密度,提升了凝膠存儲(chǔ)彈性形變能量的能力,這與Xu等[5]研究的大豆分離蛋白凝膠結(jié)果相似,說明PAS具有使得凝膠具有更強(qiáng)的保水性以及更致密的空間結(jié)構(gòu)的能力。紅外和拉曼結(jié)果與Saeki等[45]研究分析的EGCG對(duì)凝膠影響趨勢(shì)相同,PAS通過增加蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的氫鍵之間的強(qiáng)度、促進(jìn)蛋白質(zhì)之間的疏水作用、蛋白之間形成更多的β-折疊,從而強(qiáng)化蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),使得添加PAS后的凝膠具有更穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)和更不易被破壞的空間結(jié)構(gòu)。Lee等[46]研究發(fā)現(xiàn),兒茶素的添加有助于提升凝膠的儲(chǔ)能模量,提升水凝膠敷料的愈合性能,加速了凝膠成型的速度,這與本試驗(yàn)中凝膠獲得了更高的彈性和更高的硬度以及更加致密的空間結(jié)構(gòu)結(jié)論相同,蛋白質(zhì)之間的作用力更強(qiáng),凝膠更具有穩(wěn)定性。凝膠的流變學(xué)結(jié)果表明,添加PAS后,凝膠更易形成,且在形成凝膠的過程中,儲(chǔ)能模量和損耗模量與PAS添加量呈正相關(guān)趨勢(shì),凝膠具有更強(qiáng)的回彈能力和更大的粘性,這與先前的研究趨勢(shì)相同[5,46]。因此,PAS作為一種天然且充裕的物質(zhì),可作為一種新型的食品添加劑作用于個(gè)性化凝膠制品和肉制品研發(fā)中。其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)價(jià)與感官評(píng)價(jià)有待進(jìn)一步研究。