金胺“O”熒光染色法與萋—尼染色法在肺結(jié)核細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中的準(zhǔn)確性

王亞茹 呂思遙 鄭牛威 史雯舒

1 天津市河?xùn)|區(qū)疾病預(yù)防控制中心 300171;2 天津市紅橋區(qū)疾病預(yù)防控制中心; 3 天津市水閣醫(yī)院; 4 天津市河西區(qū)中醫(yī)院

肺結(jié)核是全球常見的慢性呼吸系統(tǒng)傳染性疾病,主要是因結(jié)核分枝桿菌感染引起。結(jié)核分枝桿菌早期、快速、準(zhǔn)確鑒定,是肺結(jié)核治療及管理的重要環(huán)節(jié)[1]。細(xì)菌分離培養(yǎng)法能夠進(jìn)行菌種鑒定及藥敏試驗(yàn),但操作復(fù)雜、煩瑣,培養(yǎng)周期長,難以及時(shí)予以結(jié)果報(bào)告[2]。隨著實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的發(fā)展,Xpert MTB/RIF檢測逐漸用于臨床,其操作準(zhǔn)確、快速、安全性高,可滿足臨床檢驗(yàn)需求[3],但其檢驗(yàn)價(jià)格昂貴,患者難以接受。因此抗酸染色法仍在結(jié)核分枝桿菌感染的檢測中占據(jù)著重要作用,其中萋—尼染色法是重要手段,隨著熒光染色技術(shù)的發(fā)展,金胺“O”熒光染色法在臨床上的應(yīng)用取得一定效果[4]。故本文比較金胺“O”熒光染色法與萋—尼染色法對結(jié)核分枝桿菌的檢驗(yàn)準(zhǔn)確性,旨為抗酸染色法的選擇提供參考,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取在2018年1月—2022年10月期間預(yù)進(jìn)行肺結(jié)核病篩查的痰標(biāo)本360份,痰液標(biāo)本均對應(yīng)有詳細(xì)的病例資料,其中男192例,女168例;年齡30～76(58.31±3.15)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)選取的痰液標(biāo)本病例均有持續(xù)咳嗽、咳痰,伴咯血或有血痰癥狀;(2)發(fā)熱、胸痛持續(xù)時(shí)間超過2周;(3)選取痰液標(biāo)本合格,為血性、膿性、干酪樣或黏液性痰,痰量超過2ml;(4)均有完整的臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)痰液標(biāo)本不合格或被污染;(2)伴惡性腫瘤、急慢性感染者;(3)臨床資料不全者。

1.2 檢測方法 選取病例晨起痰液,每份痰液制作4張?zhí)低科?2張為直接痰涂片,2張為次氯酸鈉液化離心沉淀集菌痰涂片。由珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的金胺“O”熒光染色液與萋—尼染色液,日本尼康E200型光學(xué)顯微鏡,正值相差熒光顯微鏡,100倍油鏡下觀察。

選取痰液內(nèi)的膿樣、干酪樣及血性物質(zhì),劑量在0.05～0.1ml。將挑選的標(biāo)本均勻涂抹在玻片正面右側(cè)2/3部位,使痰膜朝上,厚度適中,形成卵圓形痰膜,10mm×20mm。

萋—尼染色法:在痰標(biāo)本涂抹于痰膜片后,自然干燥,置于染色架上,先添加石炭酸復(fù)紅溶液,覆蓋全部玻片,玻片距離10mm以上進(jìn)行加熱固定,于5s內(nèi)對玻片進(jìn)行火焰加熱,待出現(xiàn)蒸汽后脫離火焰,維持染色5min。流水沖洗后再次添加酸性乙醇美藍(lán)溶液,覆蓋全部玻片,脫色1min;若有塊狀紅色殘留,再次對脫色液進(jìn)行流水沖洗,至痰膜片無紅色;再添加亞甲藍(lán)復(fù)染液,覆蓋全部玻片,染色時(shí)間為30s,用流水將其沖去,瀝干水,待其自然干燥后進(jìn)行鏡檢。連續(xù)觀察300個(gè)視野,陰性:未出現(xiàn)抗酸桿菌;陽性(+):每100個(gè)視野出現(xiàn)1～9條抗酸桿菌;(++):每10個(gè)視野出現(xiàn)1～9條抗酸桿菌;(+++):每1個(gè)視野出現(xiàn)1～9條抗酸桿菌;(++++):每1個(gè)視野出現(xiàn)至少10條抗酸桿菌;至少觀察20個(gè)視野。

金胺“O”熒光法:將處理后的玻片置于染色架上,滴加0.1%金胺“O”染色液,全部覆蓋玻片,放置時(shí)間為15min;流水緩慢沖洗,將初染液全部沖去后,添加0.5%鹽酸乙醇進(jìn)行脫色,持續(xù)時(shí)間為2min,至外觀無黃色;隨后再次復(fù)染,脫色液用流水緩慢沖洗,滴加0.5%高錳酸鉀復(fù)染液,全部覆蓋玻片,持續(xù)時(shí)間為1min;再用流水沖洗復(fù)染液,瀝干水分,自然干燥后準(zhǔn)備鏡檢。陰性:未出現(xiàn)抗酸桿菌;陽性:(+):每50個(gè)視野出現(xiàn)10～49條抗酸桿菌;(++):每1個(gè)視野出現(xiàn)1～9條抗酸桿菌;(+++):每1個(gè)視野出現(xiàn)10～99條抗酸桿菌;(++++):每1個(gè)視野出現(xiàn)至少100條抗酸桿菌;至少觀察20個(gè)視野。由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富、專業(yè)性強(qiáng)、工作時(shí)間超過5年的檢驗(yàn)人員觀察及詳細(xì)記錄數(shù)據(jù)。

1.3 觀察指標(biāo) (1)比較金胺“O”熒光染色法與萋—尼染色法的檢測價(jià)值,以酸性羅氏(L-J)培養(yǎng)基上做痰培養(yǎng)法(L-J痰培養(yǎng))為金標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算兩種染色方法的陽性檢出率,計(jì)算其診斷價(jià)值:敏感度、特異度、準(zhǔn)確性、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值;(2)比較兩種染色技術(shù)對(+)(++)(+++)(++++)抗酸桿菌陽性檢出率;(3)比較兩種染色法的平均檢驗(yàn)耗費(fèi)時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 兩種染色法檢測結(jié)果及診斷價(jià)值比較 360例疑似肺結(jié)核患者L-J痰培養(yǎng)法檢測,共檢測出陽性124例(34.44%),金胺“O”熒光染色法檢測出陽性120例(96.77%),萋—尼染色法檢測出陽性108例(87.10%),見表1;金胺“O”熒光染色法檢測肺結(jié)核的敏感度、特異度、準(zhǔn)確性、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值均高于萋—尼染色法,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表1 兩種染色法對肺結(jié)核檢測分布情況比較(n)

表2 兩種染色法對肺結(jié)核診斷價(jià)值比較(%)

2.2 兩種染色方法對抗酸桿菌陽性檢出率比較 金胺“O”熒光染色法對抗酸桿菌陽性檢出率高于萋—尼染色法,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 兩種染色方法對抗酸桿菌陽性檢出率比較[n(%)]

2.3 兩種染色法檢驗(yàn)耗費(fèi)時(shí)間比較 金胺“O”熒光染色法檢驗(yàn)耗費(fèi)時(shí)間為(32.14±5.36)min,萋—尼染色法檢驗(yàn)耗費(fèi)時(shí)間為(47.15±5.48)min,二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=37.153,P=0.000)。

3 討論

肺結(jié)核是我國高發(fā)病率的傳染性疾病,控制結(jié)核病的傳播首要環(huán)節(jié)是早期診斷與及時(shí)治療。通常臨床診斷肺結(jié)核時(shí),多依據(jù)結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果。結(jié)核分枝桿菌液體培養(yǎng)法診斷敏感度高,可進(jìn)行菌種鑒定及藥敏試驗(yàn),但其操作相對復(fù)雜、煩瑣,細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間長,平均陽性報(bào)告時(shí)間需要13d,陰性報(bào)告時(shí)間需要42d[5]。實(shí)時(shí)熒光檢測(PCR)法能夠在短期內(nèi)完成細(xì)菌培養(yǎng)及檢測,但對于基層醫(yī)院而言,各醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室普遍沒有條件開展,且因?qū)嶒?yàn)室技術(shù)人員能力及專業(yè)水平參差不齊,更進(jìn)一步限制其應(yīng)用[6]。因此痰涂片鏡檢仍是實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)核分枝桿菌的主要方法。

結(jié)核分枝桿菌細(xì)長且略微彎曲,細(xì)胞壁脂質(zhì)含量高,大量分枝菌酸包裹在肽聚糖層的外層,從而會影響染色過程。其中萋—尼染色法是鏡檢的常規(guī)染色技術(shù),以5%石炭酸復(fù)紅加溫染色,3%鹽酸乙醇避免脫色,再用亞甲藍(lán)復(fù)染,此時(shí)結(jié)核分枝桿菌最后呈紅色,而其他細(xì)菌以及背景呈藍(lán)色[7]。金胺“O”熒光染色法的檢測原理與萋—尼染色法的檢測原理基本相同,均添加一定量的石炭酸,作為媒染劑,以此充分顯示結(jié)核分枝桿菌[8]。本文結(jié)果顯示,金胺“O”熒光染色法檢測肺結(jié)核的敏感度、特異度、準(zhǔn)確性、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值均高于萋—尼染色法,對抗酸桿菌陽性檢出率高于萋—尼染色法,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明與萋—尼染色法相比,采用金胺“O”熒光染色法可提高結(jié)核分枝桿菌的檢出率,診斷價(jià)值高。分析原因是萋—尼染色法檢測時(shí),當(dāng)細(xì)菌濃度達(dá)到10 000個(gè)/ml時(shí),才能被檢測出,難以發(fā)現(xiàn)少量細(xì)菌,故而陽性檢出率較低;金胺“O”熒光染色法只需要適當(dāng)加熱處理,促使熒光染料能順利滲透結(jié)核分枝桿菌內(nèi),在暗背景下,細(xì)菌呈現(xiàn)黃綠色熒光,故而能增加細(xì)菌檢出率[9]。

本文結(jié)果顯示,金胺“O”熒光染色法檢驗(yàn)耗費(fèi)時(shí)間短于萋—尼染色法,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明金胺“O”熒光染色法檢測過程較萋—尼染色法簡便,操作時(shí)間短,能相應(yīng)減輕操作人員的工作負(fù)擔(dān)。分析原因是萋—尼染色法操作較為煩瑣,在染色加熱時(shí)容易產(chǎn)生氣溶膠,對檢驗(yàn)人員身體健康造成一定危害;同時(shí)該染色法技術(shù)要求高,油鏡觀察時(shí)的視野范圍小,鏡檢時(shí)間長,檢驗(yàn)人員容易產(chǎn)生疲勞感[10]。金胺“O”熒光染色法過程中添加熒光染色液,可暗色背景下,細(xì)菌可呈現(xiàn)明顯的黃綠色熒光,此時(shí)容易被發(fā)現(xiàn),可減輕檢驗(yàn)人員鏡檢時(shí)間及工作負(fù)擔(dān),增加工作效率,以此能縮短檢驗(yàn)時(shí)間[11]。

金胺“O”熒光染色法注意事項(xiàng):(1)熒光染色后涂片需要在24h內(nèi)完成鏡檢;必要時(shí)可置于4℃環(huán)境內(nèi)進(jìn)行保存,于第2天完成鏡檢,以免時(shí)間越久,熒光減退導(dǎo)致陽性結(jié)果不準(zhǔn)確[12];(2)熒光染色液置于棕色瓶內(nèi)保存,保存時(shí)間不宜超過2周,以免影響熒光染色效果;(3)40×背景下難以區(qū)別個(gè)別抗酸桿菌,此時(shí)需要采用100×油鏡下進(jìn)行觀察[13];(4)染色時(shí),水流沖洗背面速度宜細(xì)弱,避免流水污染熒光素,影響鏡檢結(jié)果[14];(5)每張涂片的鏡檢視野數(shù)量會影響染色法的診斷靈敏度,當(dāng)鏡檢視野越多,其檢測靈敏度越高,故建議每張涂片觀察300個(gè)視野以上,以此提高臨床診斷價(jià)值[15]。

綜上所述,與萋—尼染色法相比,金胺“O”熒光染色法可提高肺結(jié)核分枝桿菌陽性率,診斷敏感度、特異度、準(zhǔn)確度高,檢測耗費(fèi)時(shí)間短,操作簡單、方便,可提高檢驗(yàn)人員的工作效率,適用于大批標(biāo)本檢測,值得臨床應(yīng)用。但要求人員鏡檢操作經(jīng)驗(yàn)豐富,掌握染色流程,注意自身防護(hù),從而提高工作安全性及檢驗(yàn)質(zhì)量。