白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑活性的測(cè)定*

張雪嬌,劉春葉,成 昭

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,陜西 西安 710021)

α-淀粉酶抑制劑(α-AI)屬于糖苷水解酶,是一種糖苷酶抑制劑,在禾谷類作物和豆類作物的種子中含量較為豐富[1]。近年的研究發(fā)現(xiàn),糖尿病患者長(zhǎng)時(shí)間的高血糖是導(dǎo)致病人多系統(tǒng)多臟器損害的最主要原因[2-4]。α-AI不但能特異性抑制α-淀粉酶活性,如胃腸道內(nèi)唾液淀粉酶和胰淀粉酶等,使人體對(duì)糖分的吸收受到阻礙或延緩。同時(shí),α-AI還可減少人體內(nèi)糖向脂肪的轉(zhuǎn)化,用來(lái)防治糖尿病、動(dòng)脈硬化癥、高血脂、脂肪過(guò)多癥及肥胖癥[5],在醫(yī)學(xué)上有很好的應(yīng)用發(fā)展前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

碘化鉀、碘、磷酸二氫鈉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;檸檬酸：無(wú)錫第二制藥廠;氯化銅：北京市東風(fēng)化學(xué)試劑有限公司;可溶性淀粉：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司;α-淀粉酶：邢臺(tái)萬(wàn)達(dá)生物化學(xué)試劑有限公司;以上試劑均為分析純;鹽酸：優(yōu)級(jí)純,開(kāi)封東大化工(集團(tuán))有限公司;α-淀粉酶抑制劑：自制,從白蕓豆中提取;實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-757,上海尤尼柯有限公司;電子天平：ALC-210.4,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司; 離心機(jī)：AnkeTGL-16C,上海安亭儀器廠;酸度計(jì)：PB-10,德國(guó)Accula公司;電熱恒溫水浴鍋：DZKW-6-9,北京市永光明醫(yī)療廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1ρ(淀粉)的確定

配制一定質(zhì)量濃度的碘溶液、淀粉溶液和碘-淀粉復(fù)合物溶液,分別以相應(yīng)溶劑為試劑空白,測(cè)定其吸光度,確定碘-淀粉復(fù)合物的最大吸收波長(zhǎng)。

淀粉溶液：精密稱取一定量烘干之后的可溶性淀粉,以緩沖溶液為溶劑配制ρ(淀粉)=0.001～0.008 g/mL溶液。碘液：參考文獻(xiàn)[8],精密稱取一定質(zhì)量的碘化鉀和碘,以蒸餾水為溶劑配制而成。緩沖溶液：在pH 計(jì)調(diào)控下,用0.2 mol/L的磷酸氫二鈉溶液和0.1 mol/L的檸檬酸溶液配制pH =6.5的緩沖溶液。酶解反應(yīng)終止液：參考文獻(xiàn)[8]中的配制方法,精密稱取一定質(zhì)量的氯化銅和一定體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)37% 鹽酸,用蒸餾水稀釋配制而成。

上述淀粉溶液分別移取5.00 mL置于8只比色管中,t=37 ℃水浴鍋中恒溫10 min,依次加入同樣在37 ℃水浴鍋中恒溫10 min的緩沖溶液和反應(yīng)終止液各1.00 mL,搖勻,放至室溫后,精確移取0.20 mL混合溶液于干燥試管中,再分別加入7.00 mL的碘液,充分混勻后在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,根據(jù)不同質(zhì)量濃度淀粉水解后吸光度的值確定實(shí)驗(yàn)所需淀粉的最佳質(zhì)量濃度。

1.2.2 α-淀粉酶加入量的確定

為了考察α-AI對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用,實(shí)驗(yàn)中根據(jù)等量α-淀粉酶在不等量α-AI 的作用下對(duì)等量淀粉的水解促進(jìn)作用不同,借助碘比色法確定不同條件下吸光度的變化,進(jìn)而確定α-AI對(duì)α-淀粉酶活性的抑制效果。根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[9],考慮到吸光度測(cè)量值和計(jì)算結(jié)果的準(zhǔn)確性,實(shí)驗(yàn)采用5.00 mLρ(淀粉)=0.008 g/mL溶液、1.00 mLρ(α-淀粉酶)=0.03 mg/mL溶液。

1.2.3 α-AI抑制活性的測(cè)定

α-AI的制備：參考文獻(xiàn)[10]中的方法,稱取適量的白蕓豆干燥粉末于蒸餾燒瓶中,加入去離子水,調(diào)整 pH 值和溫度后浸提一段時(shí)間,離心、過(guò)濾上清液得 α-AI 粗提液。粗提液在酸性條件下進(jìn)行沉降,取上清液用堿中和后通過(guò)醇沉法得到初步純化的 α-AI。最后經(jīng)超濾、透析及濃縮凍干后得到純化的 α-AI。

樣品管：在一系列試管中分別加入1.00 mLρ(α-淀粉酶)=0.03 mg/mL溶液,再分別加入1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mLρ(α-AI)=0.03 mg/mL溶液,用緩沖溶液定容至10.00 mL,搖勻后各取1.00 mL置于編號(hào)為1～6的樣品管中;標(biāo)準(zhǔn)管 1：用緩沖溶液代替 α-淀粉酶溶液和α-AI,其他條件同上;標(biāo)準(zhǔn)管2：用緩沖溶液代替α-AI,其他條件同上。將所有試管置于37 ℃ 水浴加熱2 min,依次加入同溫度預(yù)熱的5.00 mLρ(淀粉)=0.008 g/mL溶液,立即混勻。37 ℃準(zhǔn)確反應(yīng)10 min,立即加入1.00 mL的終止液。搖勻后冷卻至室溫,參考1.2.1方法取樣與碘液充分顯色,在最大吸收處測(cè)定其吸光度,根據(jù)樣品管、標(biāo)準(zhǔn)管1及標(biāo)準(zhǔn)管2的吸光度值確定α-AI 對(duì)α-淀粉酶的活性抑制率。

α-AI對(duì)α-淀粉酶的活性抑制率參照文獻(xiàn)[11]的方法,計(jì)算方法見(jiàn)公式(1)。

(1)

式中：As、Ab1、Ab2分別為樣品管、標(biāo)準(zhǔn)管1和標(biāo)準(zhǔn)管2的吸光度值。

1.2.4 方法學(xué)考察

對(duì)實(shí)驗(yàn)中所建立起來(lái)的關(guān)于 α-AI抑制 α-淀粉酶活性的測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)考察。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)抽取3號(hào)樣為檢測(cè)對(duì)象,在上述實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定其吸光度,間隔10 min測(cè)定1次,連續(xù)測(cè)定6次,根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算RSD值。精密度實(shí)驗(yàn)：以3號(hào)樣為檢測(cè)對(duì)象,同時(shí)配制6份3號(hào)樣品溶液,在上述實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定其吸光度,根據(jù)6次的測(cè)定結(jié)果計(jì)算RSD值。重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)：以3號(hào)樣為檢測(cè)對(duì)象,每天配制1份3號(hào)樣品溶液,在上述實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定其吸光度,連續(xù)測(cè)定6次,根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算RSD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 ρ(淀粉)的測(cè)定

碘溶液、淀粉溶液和碘-淀粉絡(luò)合物溶液在可見(jiàn)光區(qū)的掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。

λ/nm圖1 碘-淀粉絡(luò)合物的紫外可見(jiàn)吸收曲線

由圖1可知,碘-淀粉絡(luò)合物在580 nm處產(chǎn)生明顯的特征吸收。所以選擇580 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

按照1.2.1方法進(jìn)行操作,以ρ(淀粉)為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性擬合,見(jiàn)圖2。

ρ(淀粉)/(g·mL-1)圖2 ρ(淀粉)與吸光度的關(guān)系

由圖2可知,碘與淀粉絡(luò)合后在580 nm處產(chǎn)生特征吸收,并且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi),該特征吸收與ρ(淀粉)呈正相關(guān)性,該法可用于測(cè)定淀粉含量。

2.2 α-AI抑制活性的測(cè)定

2.2.1 α-AI抑制活性的測(cè)定

按照1.2.3方法進(jìn)行操作,并按照公式(1)計(jì)算α-AI對(duì)α-淀粉酶的活性抑制率,將α-AI的加入量與α-AI的抑制活性進(jìn)行線性擬合,見(jiàn)圖3。

ρ(α-AI)/(mg·mL-1)圖3 ρ(α-AI)對(duì)抑制率的變化曲線

由圖3可知,ρ(α-AI)=0.003～0.018 mg/mL,對(duì)α-淀粉酶的活性抑制作用與ρ(α-AI)呈正相關(guān)性,可以利用碘與淀粉的顯色反應(yīng)對(duì)α-AI的抑制活性進(jìn)行測(cè)定。

2.2.2 方法學(xué)考察

按照1.2.4方法隨機(jī)抽取3號(hào)樣為檢測(cè)對(duì)象,分別對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性、精密度及重現(xiàn)性進(jìn)行考察,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性、精密度和重現(xiàn)性 n=6

由表1可知,采用碘比色法測(cè)定α-AI抑制活性,t<1 h,RSD=1.86%,穩(wěn)定性良好。精密度和重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的RSD值分別為1.45%和2.10%,均小于5%。說(shuō)明采用實(shí)驗(yàn)方法對(duì)α-AI抑制活性進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果準(zhǔn)確,方法可靠。

3 結(jié) 論

(1)碘比色法測(cè)定α-AI對(duì)α-淀粉酶抑制率,實(shí)驗(yàn)條件為在pH =6.5的緩沖體系中,等量淀粉和等量淀粉酶的混合溶液中加入不等量α-AI,顯色后根據(jù)其在580 nm處的測(cè)定結(jié)果計(jì)算α-AI對(duì)α-淀粉酶的活性抑制率,ρ(α-AI)=0.003～0.018 mg/mL,α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制率與ρ(α-AI)呈正相關(guān)性,線性相關(guān)系數(shù)r2=0.990 5。

(2)穩(wěn)定性、精密度及重現(xiàn)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該實(shí)驗(yàn)方法在1h內(nèi)穩(wěn)定性良好,精密度和重現(xiàn)性的RSD值也均小于5%,說(shuō)明結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

(3)實(shí)驗(yàn)條件易于控制、操作簡(jiǎn)單,為α-AI抑制α-淀粉酶活性強(qiáng)弱的研究提供可借鑒的參考依據(jù)。