重樓皂苷通過(guò)JNK/p53誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞鐵死亡的作用機(jī)制研究

趙 玲 彭 湃 馮沛貝 易善永

肺癌是臨床常見的原發(fā)性惡性腫瘤,常發(fā)于60歲以上男性,其發(fā)病率及病死率均居我國(guó)惡性腫瘤首位,以發(fā)病隱匿、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移迅速為主要特征[1]。近年來(lái),鐵死亡理論在腫瘤治療的各項(xiàng)研究中嶄露頭角,作為腫瘤治療新方向被眾多學(xué)者所關(guān)注。重樓皂苷是中藥重樓主要藥理成分之一,具有抑菌、抗炎、抗病毒等多種藥理活性[2]。有研究表明[3],其可有效抑制人骨肉瘤U2OS細(xì)胞活性、促進(jìn)自噬及凋亡,從而發(fā)揮其抗腫瘤功效。本研究采用重樓皂苷干預(yù)人肺癌A549細(xì)胞,觀察其對(duì)該細(xì)胞鐵死亡的影響,并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人肺癌A549細(xì)胞株,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物、主要試劑、儀器

重樓皂苷(純度:98%)、鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin(上海源葉生物科技有限公司),c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino terminal kinase,JNK)/p53信號(hào)通路抑制劑SP600125[愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司],丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、雙染細(xì)胞凋亡試劑盒(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司),兔抗人溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase 4,GPX4)、JNK、p-JNK、p53一抗(美國(guó)CST公司)。

Infinite 200 pro多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司),IX51倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司),FACS Aria流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

取A549細(xì)胞株恒溫37 ℃水浴解凍,在RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素)中,培養(yǎng)箱標(biāo)準(zhǔn)條件下(37 ℃,5%CO2)培育,待細(xì)胞融合至80%,消化傳代培養(yǎng),取對(duì)數(shù)期細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象。實(shí)驗(yàn)均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,取均值。

1.4 細(xì)胞分組、處理[4-5]

取對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞,清洗、重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL接種至6孔板,待細(xì)胞融合至80%,分為對(duì)照組、重樓皂苷組、SP600125組、聯(lián)合組。對(duì)照組完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),重樓皂苷組培養(yǎng)基加入重樓皂苷(終濃度4 g/L),SP600125組培養(yǎng)基加入SP600125(終濃度10 μmol/L),聯(lián)合組培養(yǎng)基加入重樓皂苷(4 g/L)及SP600125(10 μmol/L)。取干預(yù)48 h后的細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞鐵死亡抗性

取干預(yù)后各組細(xì)胞,PBS重懸,以1×105個(gè)/mL接種于96孔板,正常孵育24 h后,加入Erastin劑1 μmol/L誘導(dǎo)鐵死亡,24 h后各孔加入新配置MTT溶液(5.00 g/L)100 μL,2 h后吸棄上清,加入150 μL DMSO,振蕩10 min后靜置,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm位置吸光度值,以各孔吸光度值與對(duì)照孔吸光度值之比代表各孔細(xì)胞鐵死亡相對(duì)抗性。

1.6 熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS堆積

取干預(yù)后各組細(xì)胞,PBS重懸,以1×106個(gè)/mL接種至6孔板,將DCFH-DA熒光探針以1∶1 000避光溶解于無(wú)血清培養(yǎng)基,每孔各滴加500 μL,培養(yǎng)箱標(biāo)準(zhǔn)條件下繼續(xù)孵育20 min,吸棄原DCFH-DA熒光探針培養(yǎng)基,PBS清洗3次,加入完全培養(yǎng)基,熒光顯微鏡觀察紅色熒光細(xì)胞即為ROS陽(yáng)性細(xì)胞,拍照并統(tǒng)計(jì)各組視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.7 細(xì)胞MDA水平檢測(cè)

取干預(yù)后各組細(xì)胞,PBS清洗,以1×106個(gè)/mL接種至6孔板,低溫離心5 min(1000 r/min,r=8 cm)后棄上清,滴加提取液超聲碎裂細(xì)胞,低溫離心10 min(10 000 r/min,r=8 cm)取上清,根據(jù)細(xì)胞內(nèi)MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作實(shí)驗(yàn)步驟,經(jīng)比色法測(cè)定各組細(xì)胞MDA水平。

1.8 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)

取干預(yù)后的各組細(xì)胞,PBS清洗,加入RIPA裂解細(xì)胞并注入離心管內(nèi),低溫離心15 min(10 000 r/min,r=10 cm),取沉淀物經(jīng)BCA法定量蛋白。取微量待測(cè)蛋白,以1∶5體積比與SDS-PAGE上樣緩沖液混勻,水浴加熱變性蛋白,離心取其上清,恒壓80 V電泳分離并濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜,加入BSA液封閉2 h,加入兔抗人SLC7A11、GPX4一抗(1∶500),4 ℃冰箱過(guò)夜,TBST清洗,加入二抗(1∶2 000)常溫孵育2 h,TBST清洗,ECL液發(fā)光,暗盒顯影,凝膠分析儀分析蛋白條帶灰度值,以SLC7A11、GPX4蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示細(xì)胞SLC7A11、GPX4相對(duì)蛋白表達(dá)量。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取干預(yù)后的各組細(xì)胞,PBS清洗、重懸,以1×106個(gè)/mL接種至6孔板,完全培養(yǎng)液標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下培養(yǎng)48 h,PBS清洗,低溫離心5 min(1000 r/min,r=8 cm)后棄上清,根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書要求設(shè)計(jì)并操作實(shí)驗(yàn)過(guò)程,binding buffer液懸浮細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC避光染色15 min,再加入5 μL PI液雙染,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。

1.10 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞JNK、p-JNK、p53蛋白表達(dá)

取干預(yù)后的各組細(xì)胞,清洗、裂解、離心、定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉同1.8,加入兔抗人JNK、p-JNK、p53一抗(1∶500),4 ℃冰箱過(guò)夜,TBST清洗,加入二抗(1∶2 000)常溫孵育2 h,TBST清洗,ECL液發(fā)光,暗盒顯影,凝膠分析儀分析蛋白條帶灰度值,以JNK、p-JNK、p53蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示細(xì)胞JNK、p-JNK、p53相對(duì)蛋白表達(dá)量,計(jì)算p-JNK/JNK。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鐵死亡抗性比較

與對(duì)照組比較,重樓皂苷組鐵死亡抗性降低(P<0.05),SP600125組鐵死亡抗性升高(P<0.05);與重樓皂苷組比較,聯(lián)合組鐵死亡抗性升高(P<0.05);與SP600125組比較,聯(lián)合組鐵死亡抗性降低(P<0.05),見表1。

表1 各組細(xì)胞鐵死亡抗性比較

2.2 細(xì)胞內(nèi)ROS堆積比較

與對(duì)照組比較,重樓皂苷組ROS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05),SP600125組ROS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05);與重樓皂苷組比較,聯(lián)合組ROS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05);與SP600125組比較,聯(lián)合組ROS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05),見表2。

表2 各組ROS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較個(gè))

2.3 細(xì)胞內(nèi)MDA水平比較

與對(duì)照組比較,重樓皂苷組細(xì)胞內(nèi)MDA水平升高(P<0.05),SP600125組細(xì)胞內(nèi)MDA水平降低(P<0.05);與重樓皂苷組比較,聯(lián)合組細(xì)胞內(nèi)MDA水平降低(P<0.05);與SP600125組比較,聯(lián)合組細(xì)胞內(nèi)MDA水平升高(P<0.05)。見表3。

2.4 各組細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較,重樓皂苷組SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)降低(P<0.05),SP600125組SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與重樓皂苷組比較,聯(lián)合組SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與SP600125組比較,聯(lián)合組SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見表4,圖1。

表4 各組細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)比較

2.5 各組細(xì)胞凋亡率比較

與對(duì)照組比較,重樓皂苷組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05),SP600125組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與重樓皂苷組比較,聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與SP600125組比較,聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。見表5,圖2。

圖1 細(xì)胞SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)

表5 各組細(xì)胞凋亡率比較

圖2 細(xì)胞凋亡流式圖

2.6 各組細(xì)胞p-JNK/JNK及p53蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較,重樓皂苷組p-JNK/JNK及p53蛋白表達(dá)升高(P<0.05),SP600125組p-JNK/JNK及p53蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與重樓皂苷組比較,聯(lián)合組p-JNK/JNK及p53蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與SP600125組比較,聯(lián)合組p-JNK/JNK及p53蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見表6,圖3。

3 討論

肺癌是源自支氣管黏膜上皮的一種呼吸道癌癥,右肺上葉是最常見發(fā)病位置,可沿支氣管壁向外擴(kuò)張,逐步占領(lǐng)周圍肺組織,后浸潤(rùn)至胸膜外部,通過(guò)淋巴及血液轉(zhuǎn)移至其他臟器[6]。肺癌的早期癥狀并不明顯,常表現(xiàn)為咳嗽、痰中帶血、低熱、胸部脹痛等典型呼吸系統(tǒng)疾病癥狀,后期則表現(xiàn)為頸部水腫、聲音嘶啞及呼吸困難,多伴隨異位激素分泌綜合征,且根據(jù)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移臟器的不同,伴發(fā)阻塞性肺炎、腰痛、心包積液甚至腦皮質(zhì)變性[7]。吸煙是肺癌發(fā)病的首要危險(xiǎn)因素,其因素亦包括粉塵環(huán)境、電離輻射、慢性呼吸道疾病等。鐵死亡是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡模式,因細(xì)胞攝入鐵離子增多,鐵離子被轉(zhuǎn)化為亞鐵離子,同時(shí)使細(xì)胞內(nèi)大量生成脂質(zhì)ROS,氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇,造成脂質(zhì)過(guò)氧化物如MDA堆積,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡,肺癌細(xì)胞長(zhǎng)期處于高氧環(huán)境下,且需要吸收更多鐵離子以提高自身增殖性,以致其對(duì)鐵死亡尤為敏感[8]。因此,誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞鐵死亡或可成為肺癌化療耐受患者新的治療方式。

表6 各組細(xì)胞p-JNK/JNK及p53蛋白表達(dá)比較

圖3 細(xì)胞p-JNK、JNK、p53蛋白表達(dá)

SLC7A11屬于溶質(zhì)載體家族,是鐵死亡重要的調(diào)控因子,作為細(xì)胞膜重要的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,可等量比例排出細(xì)胞內(nèi)谷氨酸并輸入胱氨酸[9]。GPX4是細(xì)胞內(nèi)重要的促還原酶,可促進(jìn)胱氨酸合成還原劑谷胱甘肽,從而抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制細(xì)胞鐵死亡[10]。中醫(yī)將肺癌歸為“肺巖”、“痞癖”、“胸痛”等癥范疇,其主要病機(jī)為正氣不足、邪氣踞之,肺為嬌臟,不耐六淫,客邪留滯于肺,蘊(yùn)積生熱、氣陰兩虛,肺失宣降、津血凝滯、痰瘀內(nèi)生,熱毒痰瘀搏結(jié),積聚成癌,故治療應(yīng)以清熱解毒、化瘀通絡(luò)為主[11]。中藥重樓取自百合科重樓屬植物華重樓、云南重樓及七葉一枝花干燥根莖,性微寒、味苦、微毒,歸肝經(jīng),可祛毒、清熱,治疔瘡癌腫,明代藥學(xué)家蘭茂言其可攻各種瘡毒癰疽,主治一切無(wú)名腫毒[12]。重樓皂苷是提取自重樓根莖內(nèi)的一種甾體皂苷,可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、停滯腫瘤細(xì)胞周期并抑制血管新生,從而發(fā)揮其抑癌功效。Zhou等[13]研究認(rèn)為,重樓皂苷可增強(qiáng)三陰性乳腺癌細(xì)胞鐵敏感,誘導(dǎo)其鐵死亡,提示其或可成為惡性腫瘤誘導(dǎo)鐵死亡治療的新藥物。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,重樓皂苷組鐵死亡抗性,SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)降低,ROS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加,細(xì)胞內(nèi)MDA水平、細(xì)胞凋亡率升高,提示重樓皂苷可促進(jìn)肺癌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)鐵死亡。

JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族重要成員,在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、氧化應(yīng)激、線粒體功能異常及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。p53是JNK通路下游重要的抑癌因子,參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞死亡等多個(gè)細(xì)胞過(guò)程,可下調(diào)鐵死亡相關(guān)因子SLC7A11表達(dá),誘導(dǎo)高氧環(huán)境肺癌細(xì)胞鐵死亡[15]。王俊巖等[16]研究認(rèn)為,抑制JNK/p53通路可抑制心肌細(xì)胞鐵死亡,進(jìn)而改善慢性心衰小鼠心功能,提示JNK/p53通路在細(xì)胞鐵死亡方面的作用。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,重樓皂苷組p-JNK/JNK及p53蛋白表達(dá)升高,且在重樓皂苷基礎(chǔ)上增用JNK/p53通路抑制劑SP600125可減弱重樓皂苷對(duì)肺癌的治療作用,提示重樓皂苷可能通過(guò)介導(dǎo)該通路誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞鐵死亡。

綜上所述,重樓皂苷可促進(jìn)肺癌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)其鐵死亡,其作用機(jī)制可能與激活JNK/p53信號(hào)通路有關(guān)。