雙歧桿菌對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1增殖、侵襲及遷移的影響

鐘世順 梁瑋 許炎欽 劉進(jìn)生

結(jié)腸癌是全球第三常見的惡性腫瘤，也是第二常見的惡性腫瘤死亡原因[1]。結(jié)腸癌的發(fā)生與環(huán)境、飲食、腸道微生物等因素有關(guān)[2]。已有研究表明，腸道微生物會(huì)多方面影響腸道健康，包括對(duì)腸道細(xì)胞特征、新陳代謝和免疫的影響[3，4]。腸道微生物是寄居在人體腸道內(nèi)的龐大、復(fù)雜的微生物群落[5]。益生菌是一類重要的腸道微生物，可以通過平衡腸道微生物菌群和增強(qiáng)消化系統(tǒng)中的營(yíng)養(yǎng)吸收，對(duì)宿主產(chǎn)生有利影響[6]。

雙歧桿菌屬是常見的益生菌。雙歧桿菌是一種革蘭氏陽性、不運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞呈桿狀、一端有時(shí)呈分叉狀的厭氧細(xì)菌。其能夠合成氨基酸、硫胺素和核黃素，是腸道菌群的重要組成成員之一，在抑制腸道病原體的定植、保持腸道微生物穩(wěn)態(tài)、保護(hù)腸道黏膜屏障的完整性等方面發(fā)揮著重要作用[7]。已有研究表明，雙歧桿菌可以調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群組成，提高短鏈脂肪酸含量，提高腸道屏障相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而有效緩解小鼠潰瘍性結(jié)腸炎[8]。除了緩解腸炎方面的研究外，Bahmani 等[9]研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究評(píng)估體外條件下雙歧桿菌對(duì)人結(jié)腸癌DLD-1 細(xì)胞系增殖、侵襲及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD-1 從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（American type culture collection，ATCC）獲得，DLD-1 細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的PRMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)將雙歧桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，室溫5 000g 離心4min 收獲雙歧桿菌細(xì)胞，并將其重新懸浮在培養(yǎng)基，制備成1×108CFU/ml 的雙歧桿菌懸液。

1.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn)將DLD-1 細(xì)胞按照2 000 個(gè)/孔的數(shù)量加到含180μl 完全培養(yǎng)基的96 孔板中。實(shí)驗(yàn)組中每孔加入20μl 的1×108CFU/ml 雙歧桿菌懸液（雙歧桿菌終濃度為1×107CFU/ml），對(duì)照組中每孔加入20μl 的培養(yǎng)液。每組包含6 個(gè)復(fù)孔，設(shè)置0、24h、48h、72h 4 個(gè)時(shí)間梯度。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。測(cè)量時(shí)在培養(yǎng)孔中加入10μl CCK8 試劑后置于37℃靜置1h。在460nm 波長(zhǎng)處測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)孔的OD 值。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)將DLD-1 細(xì)胞以每孔1×106個(gè)接種于6 孔板之中，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，隨后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞與細(xì)胞之間契合并鋪滿整個(gè)6 孔板時(shí)，借助直尺用10μl 的槍頭在6孔板中劃出九宮格，槍頭劃過的地方形成沒有細(xì)胞的區(qū)域，用適量的PBS 洗滌培養(yǎng)孔3 遍，吸去PBS，而后每孔加入1.8ml 無血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組每孔中加入200μl 的1×108CFU/ml 雙歧桿菌懸液，對(duì)照組中每孔加入200μl 的培養(yǎng)液。接著進(jìn)行觀察拍照和記錄，拍攝完畢后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)48h 后，吸去無血清培養(yǎng)基，用PBS 洗滌3 次后再次加入2ml 無血清培養(yǎng)基，對(duì)劃痕區(qū)域進(jìn)行拍照，并記錄比對(duì)觀察遷移情況。

1.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)取一塊新的24 孔板，每孔加入270μl 完全培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組每孔加入30μl 的1×108CFU/ml 雙歧桿菌懸液，對(duì)照組每孔加入30μl的培養(yǎng)液。將Transwell 小室放入含有完全培養(yǎng)液的24 孔板內(nèi)，將小室的基質(zhì)膜水化，在Transwell 小室上方加入180μl 無血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組每孔加入20μl 的1×108CFU/ml 雙歧桿菌懸液，對(duì)照組每孔加入20μl 的培養(yǎng)液。將DLD-1 細(xì)胞以每孔1×104個(gè)接種于小室中，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h 后，取出小室，用移液槍吸取小室中的培養(yǎng)液，使用棉簽小心地擦去小室基質(zhì)膜上層細(xì)胞，在新的24 孔板中加入400μl 結(jié)晶紫染液，將擦干凈的小室放入帶有結(jié)晶紫染液的孔洞中染色15min。染色后用移液槍吸取染色液，用棉簽擦去基質(zhì)膜周圍多余的結(jié)晶紫染液。顯微鏡觀察小室并拍照記錄。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析CCK8 分析采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）方法進(jìn)行分析，兩組間的差異分析采用Studentt檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙歧桿菌抑制結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1增殖CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于對(duì)照組，雙歧桿菌組的結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1 的增殖能力顯著被抑制（P<0.01），見圖1。

圖1 兩組結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1增殖能力

2.2 雙歧桿菌抑制結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1 侵襲及遷移劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于對(duì)照組，雙歧桿菌可以顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1 的遷移（P<0.01），Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于對(duì)照組，雙歧桿菌可以顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1 的侵襲能力（P<0.01）。見圖2、3。

圖2 雙岐桿菌對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1 遷移能力的影響

圖3 雙岐桿菌對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1 侵襲能力的影響

3 討論

結(jié)腸癌是常見的消化道腫瘤。近年來，我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，均位列我國(guó)惡性腫瘤前5 位[10]，局部的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因。結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受多種因素影響。有研究顯示，腸道菌群在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[11]。人類腸道中包含大量的微生物菌群，腸道菌群的變化對(duì)宿主的生理有重要影響，比如腸道菌群能影響免疫系統(tǒng)發(fā)育及調(diào)控腸道相關(guān)代謝功能等[11]。

雙歧桿菌和乳酸桿菌是人類腸道菌群中重要的益生菌，具有增強(qiáng)免疫力和抗腫瘤功能。大多數(shù)結(jié)腸癌患者存在腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象，其腸道有益菌如雙歧桿菌及乳酸桿菌等較健康人群減少[12]。一項(xiàng)關(guān)于益生菌預(yù)防腸癌的作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群是影響腸癌進(jìn)展的最關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因素，它能夠平衡腸道菌群，減緩腸癌進(jìn)展。2017年，Hibberd等[13]研究發(fā)現(xiàn)益生菌能干預(yù)腸癌患者的腸道微生物菌群，對(duì)腸癌患者的治療有潛在的作用。

作為一種重要的益生菌，雙歧桿菌對(duì)腸道健康有重要影響，可抑制吸附于腸道上皮細(xì)胞的病原體的生長(zhǎng)，其主要代謝物乳酸和乙酸均能降低腸道內(nèi)的pH 值，進(jìn)而抑制許多有害微生物的生長(zhǎng)。因此，通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)的pH 值是雙歧桿菌發(fā)揮腸道益生菌功能的重要機(jī)制之一。此外，還有多項(xiàng)研究表明雙歧桿菌能影響結(jié)腸癌的進(jìn)展。Foo 等[14]通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，雙歧桿菌具有抑制抗凋亡蛋白表達(dá)，增強(qiáng)促凋亡蛋白表達(dá)的作用，進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，抑制結(jié)腸癌的進(jìn)展。大鼠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，與未服用雙歧桿菌的大鼠相比，服用雙歧桿菌的大鼠結(jié)腸癌的癌前病變可以降低25%左右。另一項(xiàng)結(jié)腸癌大鼠模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙歧桿菌等益生菌的混合物可以調(diào)節(jié)平衡大鼠腸道微生物的組成，進(jìn)而下調(diào)結(jié)腸癌的發(fā)生率[15]。Liang 等[16]研究了益生菌對(duì)直腸癌患者的影響，結(jié)果表明雙歧桿菌三活膠囊對(duì)直腸癌患者癥狀有顯著改善作用。

本研究主要通過CCK8、劃痕及Transwell 實(shí)驗(yàn)探究雙歧桿菌對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1增殖、侵襲及遷移的影響。結(jié)果表明，雙歧桿菌可以顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1增殖、侵襲及遷移能力。本研究相關(guān)內(nèi)容可以為結(jié)腸癌的臨床治療和預(yù)防提供一定的理論參考。