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    TRV027在血管緊張素Ⅱ下調(diào)心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白43表達(dá)中的作用

    2023-05-10 02:08:44陳馨嶸范鑫司丹妮王明明龍章佑孫潤(rùn)民余靜
    關(guān)鍵詞:研究

    陳馨嶸 范鑫 司丹妮 王明明 龍章佑 孫潤(rùn)民 余靜

    腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system,RAS)是調(diào)節(jié)、參與心血管系統(tǒng)功能和結(jié)構(gòu)變化的重要組成部分,對(duì)心血管功能穩(wěn)態(tài)、電解質(zhì)和體液平衡的維持,以及血壓的調(diào)節(jié)均有重要作用。血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)作為RAS 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,在病理狀態(tài)下,可直接與心肌細(xì)胞膜上的Ang Ⅱ1 型受體(Angiotensin Ⅱtype 1 receptor,AT1R)結(jié)合,增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生,促進(jìn)細(xì)胞肥大、凋亡,引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和抑制自噬等,最終影響心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[1~3]。

    縫隙連接蛋白43(Connexin 43,Cx43)是心肌細(xì)胞間縫隙連接的主要蛋白成分,在成熟的心肌細(xì)胞中,Cx43 主要位于心肌細(xì)胞閏盤(pán)上,能在心肌細(xì)胞之間傳遞電流、允許化學(xué)信號(hào)和能量底物交換,是協(xié)調(diào)細(xì)胞功能所必需的結(jié)構(gòu)[4]。AngⅡ可以通過(guò)減少心肌細(xì)胞Cx43 的表達(dá)而引起心肌結(jié)構(gòu)和功能的異常改變[5~8]。

    TRV027 是一種新型AT1R 偏向性配體,能夠競(jìng)爭(zhēng)性阻斷AngⅡ與AT1R 的結(jié)合、選擇性地激活β-arrestin 通路,從而抑制AngⅡ介導(dǎo)的交感神經(jīng)興奮、血管收縮、水鈉潴留等,并且可以增強(qiáng)心肌細(xì)胞的收縮能力,增加心輸出量,改善心功能[9~11]。因此本研究針對(duì)AngⅡ與Cx43 之間的關(guān)系,探索TRV027 是否通過(guò)抑制Ang Ⅱ并激活β-arrestin 通路對(duì)心肌細(xì)胞Cx43 產(chǎn)生影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 選取大鼠心肌細(xì)胞H9C2 細(xì)胞株(和元生物技術(shù)股份有限公司)作為研究對(duì)象,細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(美國(guó)Gibco 公司)、1%雙聯(lián)抗生素(鏈霉素、青霉素,美國(guó)Gibco 公司)的DMEM 高糖培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2,選取第3~5 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.1.2 主要試劑和儀器 Ang Ⅱ、TRV027(美國(guó)AbMole 公司),GAPDH、β-arrestin 抗體、熒光二抗(中國(guó)Proteintech 公司),Cx43 抗體(美國(guó)abcam 公司),TBgreen(中國(guó)TaKaRa 公司);電泳儀、Bio-Tek 酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-tek 公司),全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像處理系統(tǒng)(中國(guó)天能科技公司),實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國(guó)Bio-rad 公司),倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法 將H9C2 細(xì)胞分為對(duì)照組、AngⅡ組、TRV027 組、AngⅡ+TRV027 組。AngⅡ組用1×10-5mol/L Ang Ⅱ干預(yù)48h;TRV027 組用1×10-8mol/L TRV027 干預(yù)24h;Ang Ⅱ+TRV027組用1×10-5mol/L AngⅡ干預(yù)24h 后,給予1×10-8mol/L TRV027 干預(yù)24h,對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng),無(wú)藥物干預(yù)。1.2.2 蛋白質(zhì)印跡(WB)法檢測(cè)Cx43 和β-arrestin在H9C2 細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 將四組細(xì)胞培養(yǎng)至6 孔板中,干預(yù)48h,收集細(xì)胞,加入裂解液,冰上裂解30min,12 000r/min 4℃離心20min,收集上清,按照BCA 試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度、計(jì)算上樣蛋白量,進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉1.5h,TBST 洗膜,加入稀釋的Cx43 一抗(1:1 000)和β-arrestin 一抗(1:700),4℃孵育過(guò)夜,TBST 洗膜,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1h,TBST 洗膜,將ECL 超敏化學(xué)發(fā)光液滴加于膜上,顯影、定影、拍照。用ImageJ 計(jì)算Cx43 蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

    1.2.3 RT-PCR 檢測(cè)H9C2 細(xì)胞中Cx43、β-arrestin mRNA 的表達(dá) 將四組細(xì)胞培養(yǎng)至6 孔板中,干預(yù)48h,按照Trizol 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,取逆轉(zhuǎn)錄模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括:模板cDNA 2μl,上下游引物各0.1μl,Taq DNA 聚合酶12.5μl,滅菌水8.5μl。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性30s,95℃變性5s,60℃退火30s,72℃延伸30s,共40 個(gè)循環(huán)。Cx43 上游引物:正向:5'-TGAAG TTCAGACAAGGCTCAAAGA-3',反向:5'-AATGTTGA TAGAAGCCGTTTGGTG-3';β-arrestin 上游引物:正向:5'-TGGGCAACTCAAGCACGAA-3',反向:5'-AGCTT CACCTTGACCCTGTAGGA-3'。以β-actin 為內(nèi)參基因,采用2-△△CT法計(jì)算Cx43、β-arrestin mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

    1.2.4 免疫熒光法觀察H9C2 細(xì)胞 將四組H9C2 細(xì)胞培養(yǎng)至24 孔板中,干預(yù)48h,用4%多聚甲醛固定30min,用PBS清洗5次,每孔加300μl 0.1%Triton(Cx43 檢測(cè)組不加Triton),用PBS 清洗5 次,加入10%正常山羊血清37℃溫箱封閉1.5h,滴加一抗100μl(Cx43 1:400,β-arrestin 1:200),置于4℃冰箱搖床孵育過(guò)夜,次日取出至室溫復(fù)溫1h,PBS 清洗5 次,加入熒光二抗100μl(1:400),室溫避光孵育1h,PBS 清洗5 次,用1:10 染色5min,PBS 清洗5 次,置于熒光顯微鏡下應(yīng)用FITC 通道觀察H9C2細(xì)胞內(nèi)Cx43、β-arrestin 的蛋白表達(dá)情況,DAPI 通道觀察細(xì)胞核染色。用ImageJ 計(jì)算細(xì)胞內(nèi)Cx43、β-arrestin 的相對(duì)表達(dá)水平。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0 分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組Cx43 和β-arrestin 的蛋白水平比較AngⅡ組H9C2 細(xì)胞Cx43(t=6.425、P=0.003)和β-arrestin(t=4.511、P=0.0004)的蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組;Ang Ⅱ+TRV027 組H9C2 細(xì)胞Cx43(t=-6.530、P=0.0001)和β-arrestin(t=-7.982、P=0.00001)的蛋白表達(dá)量明顯高于Ang Ⅱ組;TRV027 組Cx43(t=-5.524、P=0.0003)和β-arrestin(t=-6.137、P=0.0001)的蛋白表達(dá)量也高于Ang Ⅱ組。見(jiàn)表1、圖1。

    表1 各組H9C2 細(xì)胞Cx43 和β-arrestin 的蛋白表達(dá)水平比較(±s)

    表1 各組H9C2 細(xì)胞Cx43 和β-arrestin 的蛋白表達(dá)水平比較(±s)

    分組Cx43β-arrestin對(duì)照組0.63±0.010.65±0.02 Ang Ⅱ組0.42±0.040.47±0.06 TRV027 組0.71±0.060.73±0.02 AngⅡ+TRV027 組0.76±0.060.79±0.01

    圖1 各組H9C2 細(xì)胞Cx43 和β-arrestin 的蛋白水平比較

    2.2 各組Cx43 和β-arrestin 的 mRNA 水平比較Ang Ⅱ組H9C2 細(xì)胞Cx43(t=1.682、P=0.048)和β-arrestin(t=2.869、P=0.022)的mRNA 表達(dá)量明顯低于對(duì)照組;Ang Ⅱ+TRV027 組H9C2 細(xì)胞Cx43(t=-6.052、P=0.003)和β-arrestin(t=-4.748、P=0.0002)的mRNA 表達(dá)量明顯高于Ang Ⅱ組;TRV027 組Cx43(t=-4.529、P=0.012)和β-arrestin(t=-3.148、P=0.019)的mRNA表達(dá)量也高于Ang Ⅱ組。見(jiàn)表2。

    表2 各組H9C2細(xì)胞Cx43和β-arrestin mRNA水平比較(±s)

    表2 各組H9C2細(xì)胞Cx43和β-arrestin mRNA水平比較(±s)

    分組Cx43β-arrestin對(duì)照組0.012±0.0050.0006±0.0001 Ang Ⅱ組0.005±0.0030.0002±0.0001 TRV027 組0.015±0.0010.0006±0.0001 AngⅡ+TRV027 組0.018±0.0010.0009±0.0002

    2.3 各組免疫熒光相對(duì)表達(dá)量比較根據(jù)熒光效果圖及半定量分析可見(jiàn),與對(duì)照組相比,Ang Ⅱ組Cx43、β-arrestin 的綠色熒光強(qiáng)度降低;與Ang Ⅱ組相比,Ang Ⅱ+TRV027 組Cx43、β-arrestin 的綠色熒光強(qiáng)度升高。熒光半定量分析結(jié)果顯示,Ang Ⅱ組H9C2 細(xì)胞Cx43(t=7.038、P=0.00002)和β-arrestin(t=11.926、P=0.000001)的熒光相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組;Ang Ⅱ+TRV027 組H9C2細(xì)胞Cx43(t=-14.049、P=0.00001)和β-arrestin(t=-6.517、P=0.00003)的熒光相對(duì)表達(dá)量明顯高于Ang Ⅱ組;TRV027 組Cx43(t=-4.856、P=0.001)和β-arrestin(t=-11.426、P=0.00001)的熒光相對(duì)表達(dá)量也高于Ang Ⅱ組。見(jiàn)圖2、表3。

    表3 各組H9C2 細(xì)胞Cx43 和β-arrestin 的螢光相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

    表3 各組H9C2 細(xì)胞Cx43 和β-arrestin 的螢光相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

    分組Cx43β-arrestin對(duì)照組48.49±3.3065.19±1.71 Ang Ⅱ組28.35±3.7032.75±4.39 TRV027 組40.73±2.4264.26±1.88 AngⅡ+TRV027 組59.70±1.1351.61±2.42

    圖2 各組H9C2 細(xì)胞Cx43 和β-arrestin 熒光效果圖

    3 討論

    心血管疾?。–ardiovascular disease,CVD)的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)仍然呈上升趨勢(shì),是全球死亡和導(dǎo)致殘疾的主要原因[12]。而RAS 的過(guò)度激活可以通過(guò)誘發(fā)炎癥、細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)重構(gòu),造成心臟和血管損傷,是CVD 發(fā)病及病情惡化的重要因素之一[13,14]。Ang Ⅱ作為RAS 的重要活性成分發(fā)揮了核心作用,例如Ang Ⅱ可引起動(dòng)脈血管收縮以及鈉水潴留,促進(jìn)高血壓、心律失常、心肌梗死、心力衰竭等CVD 的發(fā)生發(fā)展。而Ang Ⅱ主要依賴(lài)于和細(xì)胞膜表面高度特異受體的結(jié)合而發(fā)揮作用,目前已知的Ang Ⅱ受體亞型主要有兩種,AT1R 和AT2R,二者都屬于G 蛋白偶聯(lián)受體,其中AT1R 是Ang Ⅱ發(fā)揮作用的主要受體[15]。當(dāng)Ang Ⅱ和AT1R 結(jié)合后,通過(guò)激活下游的G 蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)通路,在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮著收縮血管、調(diào)節(jié)血壓和水鈉平衡等作用。在高血壓、充血性心力衰竭等CVD 的治療中廣泛使用的Ang Ⅱ轉(zhuǎn)換酶抑制劑和AT1R 阻斷劑就是通過(guò)限制Ang Ⅱ的產(chǎn)生或者阻斷Ang Ⅱ與AT1R 受體的結(jié)合來(lái)發(fā)揮療效。因此,阻斷Ang Ⅱ的作用進(jìn)而抑制RAS 的過(guò)度激活,對(duì)CVD 的防治具有重要意義。

    Cx43 作為縫隙連接的主要蛋白,其數(shù)量減少和分布異常與心律失常、心力衰竭、高血壓等疾病相關(guān)[16~18]。研究發(fā)現(xiàn),Ang Ⅱ可以通過(guò)減少心肌細(xì)胞Cx43 的表達(dá),增加Ⅰ型膠原蛋白的含量,從而導(dǎo)致心臟間質(zhì)纖維化[5~7]。Ang Ⅱ還可以通過(guò)下調(diào)大鼠心房組織中Cx43 的表達(dá),加重心房纖維化程度[19]。有學(xué)者在大鼠心肌梗死模型中發(fā)現(xiàn),梗死區(qū)Cx43的表達(dá)降低,而給予VX765(一種caspase-1 抑制劑)上調(diào)了Cx43 的表達(dá)后,心肌梗死后大鼠心臟細(xì)胞間的信息傳遞得到了改善[20]。另有研究顯示,在大鼠心肌梗死后給予Ang Ⅱ受體拮抗劑(氯沙坦),梗死區(qū)的Ang Ⅱ水平明顯降低,而Cx43 在心肌組織不同區(qū)域表達(dá)增高,說(shuō)明Ang Ⅱ的激活導(dǎo)致了Cx43 的表達(dá)降低[8]。在人體實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),給予晚期心衰患者心內(nèi)膜注射過(guò)表達(dá)Cx43 可以提高注射段心肌運(yùn)動(dòng)能力和生存能力[21]。以上研究說(shuō)明Ang Ⅱ可以下調(diào)心臟組織中Cx43 的表達(dá),而通過(guò)阻斷Ang Ⅱ可以改善Cx43 的異常表達(dá),進(jìn)而對(duì)心臟產(chǎn)生保護(hù)作用。而本研究結(jié)果顯示Ang Ⅱ可以降低大鼠心肌細(xì)胞Cx43 的表達(dá),這與以上研究結(jié)論相似,表明Ang Ⅱ可能通過(guò)下調(diào)心肌細(xì)胞Cx43的表達(dá)來(lái)影響心肌細(xì)胞功能。

    TRV027 作為新型的AT1R 偏向性配體,一方面,TRV027 能夠競(jìng)爭(zhēng)性阻斷Ang Ⅱ與AT1R 的結(jié)合,抑制Ang Ⅱ通過(guò)AT1R 介導(dǎo)的下游G 蛋白偶聯(lián)信號(hào)通路對(duì)心血管系統(tǒng)的作用;另一方面,TRV027可以選擇性的激活β-arrestin 介導(dǎo)的非G 蛋白偶聯(lián)信號(hào)通路,發(fā)揮正性肌力作用,改善心臟功能[9~11]。TRV027 選擇性激活β-arrestin 蛋白在病理環(huán)境中比普通AT1R 阻斷劑有更好地保護(hù)心臟和脈管系統(tǒng)的作用[22,23]。既往研究發(fā)現(xiàn),給自發(fā)性高血壓大鼠中樞輸注TRV027 可降低基線(xiàn)平均動(dòng)脈壓,降低血管對(duì)Ang Ⅱ的反應(yīng)性[11]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究顯示,TRV027 通過(guò)與AT1R 結(jié)合、激活β-arrestin 在新生小鼠心臟中以劑量依賴(lài)性方式起到了長(zhǎng)效正性肌力作用[24]。有學(xué)者證明了TRV027 在人體中的安全性和可耐受性,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)TRV027 可以降低穩(wěn)定性心力衰竭患者的平均動(dòng)脈壓[25,26]。這說(shuō)明TRV027 能夠通過(guò)阻斷Ang Ⅱ與AT1R 的結(jié)合抑制Ang Ⅱ發(fā)揮作用,同時(shí)激活β-arrestin 信號(hào)通路對(duì)心臟和脈管系統(tǒng)起到保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示TRV027 提高了Ang Ⅱ下調(diào)的心肌細(xì)胞Cx43 的表達(dá),也提高了β-arrestin 蛋白的表達(dá),機(jī)制可能是TRV027 在抑制Ang Ⅱ作用的同時(shí)激活了β-arrestin信號(hào)通路,從而改善了Cx43 的異常表達(dá)。

    本研究結(jié)果表明,Ang Ⅱ可以降低大鼠心肌細(xì)胞中Cx43、β-arrestin 的表達(dá),而TRV027 可以改善這一作用,增加大鼠心肌細(xì)胞中Cx43 和β-arrestin 的表達(dá)。因此,TRV027 可能通過(guò)阻斷Ang Ⅱ與AT1R 結(jié)合、激活β-arrestin 通路,上調(diào)心肌細(xì)胞中Cx43 的表達(dá),改善心肌細(xì)胞功能。

    本研究?jī)H限于在心肌細(xì)胞當(dāng)中進(jìn)行干預(yù),沒(méi)有對(duì)Ang Ⅱ介導(dǎo)的下游信號(hào)通路及β-arrestin 相關(guān)通路進(jìn)行驗(yàn)證,缺少對(duì)心肌細(xì)胞功能和損傷相關(guān)檢測(cè),而且未從動(dòng)物層面來(lái)探討TRV027 的作用,后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)上述問(wèn)題重點(diǎn)研究,進(jìn)一步驗(yàn)證TRV027對(duì)心肌細(xì)胞及心血管系統(tǒng)的作用機(jī)制。

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