基于12 個產(chǎn)地的白及凍干片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

徐雨生，滕曉梅，辛文鋒，高明菊，田迎秋，余正勇

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128；2.湖南雜交水稻研究中心雜交水稻國家重點實驗室，長沙 410125；3.文山學(xué)院三七醫(yī)藥學(xué)院，云南 文山 663000）

白及（Bletilla striata）是蘭科白及屬多年生草本植物，色彩豐富、花型端莊典雅、葉態(tài)美觀，具有很高的觀賞價值、藥用價值和經(jīng)濟價值，主要分布在云南省、貴州省、安徽省、陜西省和甘肅?。?-3］。研究表明，莖中白及膠具有增稠、延緩衰老、懸浮、保濕、抗菌和抗腫瘤作用［4］。近年來，白及因其獨特的藥用和保健價值而得到廣泛應(yīng)用。

中藥飲片的干燥方式有多種，按其發(fā)展過程可分為傳統(tǒng)干燥和現(xiàn)代干燥。傳統(tǒng)干燥方法受環(huán)境和技術(shù)的限制，主要是曬干和陰干，操作簡單，無需特殊設(shè)備，經(jīng)濟實惠。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，干燥方法日益多元化、現(xiàn)代化。目前常用的干燥方法包括熱風(fēng)干燥、紅外線干燥、噴霧干燥、真空冷凍干燥等。熱風(fēng)干燥通過吹熱風(fēng)來蒸發(fā)水分［5］，具有傳熱面積大、熱效率高、處理量大、結(jié)構(gòu)簡單、生產(chǎn)能力大、操作方便、投資成本低、工藝簡單、易于控制等優(yōu)點，但需要消耗大量的電能；紅外線干燥利用波長為0.75～40 μm 的紅外線輻射來干燥物料［6］，具有熱損失小、易于控制、傳熱效率高、損失小等優(yōu)點，但設(shè)備操作復(fù)雜且需要消耗大量能量；噴霧干燥具有時間短、得粉率高等優(yōu)點，但對含糖量高的藥物有風(fēng)險［7］；真空凍干中藥材可以避免目標(biāo)成分的氧化變質(zhì)和分解，產(chǎn)品不會出現(xiàn)干縮、變形及褐變現(xiàn)象。因此，真空冷凍干燥技術(shù)可以較好地保存樣品，改善中藥材自身的色、香、味及營養(yǎng)成分，在食品、中草藥和中藥飲片加工中得到深入研究和廣泛應(yīng)用［8，9］。但是從中藥材的飲片處理來看，真空冷凍干燥技術(shù)處于一個空白狀態(tài)。本研究通過對12個地區(qū)的白及凍干片進(jìn)行研究，測定其中的有效成分含量，建立白及新的處理工藝，以期能更清楚地了解凍干處理白及的質(zhì)量，為建立白及凍干片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1）材料。取12 個地區(qū)的白及藥材，經(jīng)凍干處理后切片待用，如表1 所示。

表1 白及產(chǎn)地與批號

2）試劑。無水葡萄糖、乙醇、乙醚、雙［4-（β-D-吡喃葡萄糖氧）芐基］-2-異丁基蘋果酸酯（Militarine）、酚酞、乙腈等均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

UV-800S 型紫外-可見分光光度計，上海越眾儀器設(shè)備有限公司；BP211D 型電子天平，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；DZKW-S-C 型恒溫水浴鍋，上海華璽科學(xué)儀器有限公司；LC-2030 型島津高效液相色譜儀，島津（上海）實驗器材有限公司；十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），寧波鴻普儀器科技有限公司；FA1004 型分析天平，上海光學(xué)儀器廠；KQ3200 型超聲波清洗器，青島精誠儀器儀表有限公司；MB25 型水分測定儀，上海方瑞儀器有限公司；GY-605D 型體視顯微鏡，深圳市光億光學(xué)儀器有限公司；MHY-2000 型薄層色譜系統(tǒng)，北京美華儀科技有限公司；TCXC-1400 型箱式電阻爐，上海仝科電爐設(shè)備有限公司；VYJG-9420 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，杭州億捷科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白及的一般理化鑒別

1）性狀。通過眼觀、手摸、口試等方法，觀察凍干白及片的形狀、大小、表面、顏色、質(zhì)地、斷面、氣味。

2）顯微鑒別。參照白及藥材的纖維特征進(jìn)行試驗，采用粉末制片法，取少量白及凍干片粉末置于載玻片上，滴加水合氯醛數(shù)滴，用酒精燈透化。（盡量用鑷子夾著載玻片）透化多次，慢慢將水合氯醛溶液蒸至近干。再滴加稀甘油，將蓋玻片沿液體邊緣慢慢蓋上，盡量減少氣泡的產(chǎn)生。先用10 倍鏡觀察，再用50 倍鏡觀察，從一角開始慢慢尋找白及粉末中的顯微特征。

3）薄層鑒別。取白及凍干片粉末2 g，放入錐形瓶中，加入20 mL 70%甲醇，在超聲波清洗機中處理30 min，過濾，然后將濾液放入水浴鍋中蒸發(fā)，加入10 mL 去離子水溶解殘渣，用乙醚搖勻提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，在水浴鍋中揮發(fā)至1 mL，作為供試品溶液。取白及對照藥材粉末1 g，用同樣方法制備對照藥材溶液。根據(jù)薄層色譜法通則（0502），分別吸取5 μL 供試品溶液和對照藥材溶液，置于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇（6∶2.5∶1）作為展開劑展開，取出，干燥，用10%硫酸乙醇溶液噴灑。在105 ℃下加熱3～5 min，靜置30～60 min，在紫外光燈（365 nm）下檢視。

1.3.2 基本成分測定

1）水分測定。根據(jù)《中華人民共和國藥典：四部》［10］（簡稱《中國藥典》）水分檢測方法（通則0832，第二法）測定。取白及凍干片粉末2 g，放入稱量瓶，厚度不超過5 mm，放入干燥箱，105 ℃干燥5 h，冷卻30 min后，105 ℃干燥1 h，冷卻后稱量2次，相差不超過5 mg。

2）總灰分含量測定。根據(jù)《中國藥典》［10］總灰分含量測定法（通則2302，第二法）測定。取白及凍干片粉末2 g，放入恒重的小坩堝（通常恒重2 次）。用小電爐慢慢升溫后再灼燒，至完全炭化時，取出放涼，放入烘干機，干燥15 min。當(dāng)馬弗爐溫度逐漸升至600 ℃時，將坩堝放入馬弗爐中，燃燒2 h，然后取出冷卻，稱重。當(dāng)馬弗爐溫度降低至300 ℃時，放入馬弗爐內(nèi)燃燒30 min，使其完全炭化。稱重至恒重。根據(jù)殘渣重量計算白及的總灰分含量。

3）二氧化硫殘留量測定。根據(jù)《中國藥典》［10］二氧化硫殘留量的測定方法（通則2331，第一法）測定。取白及凍干片粉末10 g，放入雙頸圓底燒瓶，加去離子水350 mL。打開回流冷凝器的開關(guān)，將連接到冷凝器上端口的橡膠空氣導(dǎo)管放在100 mL 錐形瓶底部。向錐形瓶中加入50 mL 3%過氧化氫溶液，作為吸收溶液。使用時，向吸收液中加入3 滴甲基紅乙醇液指示劑，用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液滴定至黃色。打開分液漏斗的活塞，取10 mL 鹽酸溶液緩慢流入蒸餾瓶，立即將溶液加入雙頸燒瓶，加熱至沸騰，沸騰90 min 后停止。吸收液冷卻后，在磁力攪拌器上連續(xù)攪拌，用氫氧化鈉溶液滴定至溶液呈黃色，保持20 s，用空白試驗修正滴定結(jié)果［11］。

4）浸出物測定。根據(jù)《中國藥典》［10］醇溶性浸出物測定方法（通則2201，熱浸法）測定。取白及凍干片粉末2 g，放入250 mL 錐形瓶，加入50 mL 50%乙醇，稱重，靜置1 h，然后接回流冷凝器，加熱至沸騰，保持微沸1 h。冷卻后稱重，用50%乙醇補足損失的重量，取濾液25 mL，放入蒸發(fā)皿，105 ℃干燥3 h，冷卻，快速稱重，計算浸出物含量。

1.3.3 總多糖測定

1）對照品溶液制備。稱取10.45 mg 無水葡萄糖，置于10 mL 容量瓶，加去離子水溶解并定容至刻度線，搖勻。

2）供試品溶液制備。取白及凍干片粉末0.200 0 g，放入具塞試管，加入6 mol/L 10 mL 鹽酸、15 mL 去離子水，搖勻，沸水浴加熱30 min，取1～2滴，放在白瓷板上，滴1 滴I-KI 溶液，檢查水解是否完全。如果水解完成，則不會出現(xiàn)藍(lán)色。完全水解，冷卻至室溫，加入1 滴酚酞指示劑，用10%氫氧化鈉溶液滴定至中性，過濾至100 mL 容量瓶，備用。

3）線性關(guān)系。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖溶液（對照品溶液），放入5 個25 mL 具塞比色管中，加入去離子水至2.5 mL 刻度線，搖勻，沸水浴30 min，取1～2 滴置于白瓷板上，加入1 滴I-KI 溶液，檢查水解是否完全。水解完全后，冷卻至室溫后加入1 滴酚酞指示劑，用10%氫氧化鈉溶液滴定至中性，過濾至100 mL 容量瓶，定容搖勻備用。以0.3 mL 去離子水為空白對照，在495 nm 波長下測定吸光度。

4）精密度試驗。取0.3 mL 文山市平壩鎮(zhèn)白及凍干片的供試品溶液，用紫外分光光度儀在495 nm波長下，同一個樣品測定5次，計算平均值。

5）重復(fù)性試驗。取6 份0.500 0 g 文山市平壩鎮(zhèn)白及凍干片粉末，制備供試品溶液，分別吸取0.3 mL供試品溶液至25 mL 容量瓶，加去離子水至2.5 mL，以0.3 mL 去離子水為空白對照，在495 nm 波長下測定每份吸光度，計算總多糖的含量。

6）穩(wěn)定性試驗。取0.3 mL 文山市平壩鎮(zhèn)白及凍干片供試品溶液，在495 nm 波長下，1 h 內(nèi)每10 min 測定1次，測定吸光度。

7）回收試驗。取6 份0.500 0 g 文山市平壩鎮(zhèn)白及凍干片粉末，制備供試品溶液，分別取0.15 mL 供試品溶液于25 mL 容量瓶，加入0.15 mL 葡萄糖溶液，加去離子水至2.5 mL，以0.5 mL 去離子水為空白對照，在495 nm 波長下測定吸光度，計算總多糖的回收率。

8）樣品含量測定。取12 個產(chǎn)地的白及凍干片粉末各0.500 0 g，制備供試品溶液，分別取0.3 mL 供試品溶液于25 mL 容量瓶，加去離子水至2.5 mL，以0.3 mL 去離子水為空白對照，在495 nm 波長下測定吸光度，每個樣品平行操作3份，計算各產(chǎn)地白及凍干片的總多糖含量。

1.3.4 Militarine 含量測定

1）對照品溶液制備。取4.10 mg Militarine（批號CSF201803）于20 mL 容量瓶，用50%乙醇溶解并定容至刻度線，用0.45 μm 微膜過濾，取濾液備用。

2）供試品溶液制備。取0.200 0 g 白及凍干片粉末，放入150 mL 具塞錐形瓶，加入50% 25 mL 乙醇，超聲波處理30 min，取出，放冷，用50%乙醇補足失重，過濾，取續(xù)濾液，0.45 μm 微膜過濾，取濾液備用。

3）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗。色譜柱為Sepax Gp-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長為223 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，流速為1 mL/min，用流動相A（乙腈）和流動相B（0.1%磷酸-去離子水）進(jìn)行梯度洗脫（表2）。

表2 樣品洗脫條件

4）線性關(guān)系考察。分別取0.41、0.82、1.23、1.64、2.05、3.08、4.10、5.13、6.15、7.18 mL Militarine的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液至10 mL 的容量瓶，加50%乙醇定容，制成濃 度為0.041、0.082、0.123、0.164、0.205、0.308、0.410、0.513、0.615、0.718 μg/μL 的溶液，分別取10 μL 上述溶液，記錄色譜圖，以Militarine 的峰高為縱坐標(biāo)，Militarine 實際進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5）樣品含量測定。稱取12 個產(chǎn)地的白及凍干片粉末各0.200 0 g，制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算Militarine 的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 性狀鑒別

根據(jù)圖1 的3 批樣品發(fā)現(xiàn)白及的斷面呈白色、角質(zhì)堅硬、不易破碎；氣微，味苦，嚼起來有黏性。經(jīng)冷凍干燥技術(shù)處理的白及性質(zhì)為表面呈白色或淡黃色的中空泡沫狀薄片；氣微、味苦微甜、有黏性、易碎；斷面類白色、角質(zhì)樣。

圖1 3 批白及樣品

2.2 顯微鏡鑒別

白及凍干片粉末為黃白色。由圖2 可知，在10 nm×10 nm 的電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，草酸鈣針晶團存在于大的圓形黏液細(xì)胞中，或散在各處，針狀晶體長18～88 μm。含硅質(zhì)塊的細(xì)胞很小，位于纖維周圍，垂直排列。纖維束直徑為11～30 μm，木質(zhì)壁，人字形或橢圓形孔紋；梯紋導(dǎo)管、具緣紋孔導(dǎo)管及螺紋導(dǎo)管直徑為10～32 μm，糊化淀粉顆粒無色。

圖2 白及凍干片顯微結(jié)構(gòu)

2.3 薄層色譜測定

與對照藥材比較（圖3）發(fā)現(xiàn)，12 個產(chǎn)地的白及凍干片均出現(xiàn)相同顏色的棕紅色斑點，效果良好。

圖3 白及凍干片薄層色譜

2.4 白及凍干片含水量測定

對12 個產(chǎn)地的白及凍干片粉末含水量進(jìn)行測定。由表3 可知，白及凍干片粉末含水量為1.87%～6.37%，平均含水量為4.48%。

2.5 總灰分含量測定

對12 個產(chǎn)地的白及凍干片總灰分含量進(jìn)行測定，由表4 可知，白及凍干片的總灰分含量為1.70%～4.50%。

表4 白及凍干片總灰分含量測定 （單位：%）

2.6 二氧化硫殘留量測定

根據(jù)中藥材凍干片標(biāo)準(zhǔn)要求，白及凍干片中的二氧化硫殘留量不得超過400 mg/kg。由表5 可知，12 個產(chǎn)地白及凍干片的二氧化硫殘留量均未超過400 mg/kg。由于白及產(chǎn)地豐富，生長環(huán)境不同，白及凍干片中二氧化硫殘留量也不相同。

表5 白及凍干片二氧化硫殘留量測定（單位：mg/kg）

2.7 浸出含量物測定

由表6 可知，12 個產(chǎn)地白及凍干片的乙醇浸出物含量均高于30%，部分地區(qū)白及凍干后乙醇浸出物含量高于40%，故本研究中白及凍干片中的乙醇浸出物含量規(guī)定不低于30%。

表6 白及凍干片浸出物含量測定（單位：%）

2.8 總多糖測定

2.8.1 線性關(guān)系考察 由圖4 可知，以葡萄糖（對照品）溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為y=0.979 3x-0.062 5，R2=0.998 1，對照品溶液的線性關(guān)系好，對照品溶液濃度在0.209～1.045 mg/mL 時線性關(guān)系較好。

圖4 葡萄糖（對照品）溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.8.2 精密度試驗 由表7 可知，5 個文山市平壩鎮(zhèn)白及凍干片樣品的測定結(jié)果相差較小，樣品的RSD為3.21%，表明儀器精密度良好。

表7 精密度試驗結(jié)果

2.8.3 重復(fù)性試驗 由表8 可知，文山市平壩鎮(zhèn)白及凍干片樣品總多糖含量的RSD為6.68 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8.4 穩(wěn)定性試驗 取文山市平壩鎮(zhèn)白及凍干片樣品，在不同的時間測定樣品的吸光度。由表9 可知，在40 min 內(nèi)吸光度波動較小，表明該檢測方法在40 min 內(nèi)穩(wěn)定。

表9 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.8.5 回收率試驗 由表10 可知，取6 份文山市平壩鎮(zhèn)白及凍干片樣品，平均回收率為101.1%，RSD為7.23%，表明該方法穩(wěn)定可靠。

表10 回收率試驗結(jié)果

2.8.6 總多糖測定 由表11 可知，12 個產(chǎn)地的白及凍干片總多糖含量相差不大，含量較穩(wěn)定，總多糖含量的平均值為38.48%。

表11 白及凍干片總多糖含量測定

2.9 Militarine 含量測定

2.9.1 對照品、供試品溶液色譜測定 由圖5 可知，對照品在整個系列中只顯示Militarine 的單峰，不存在其他的雜峰，表明試驗過程中無其他影響，即儀器、試劑、樣品等都符合試驗要求。由圖6 可見，白及凍干片供試品溶液的HPLC 色譜圖有Militarine 對應(yīng)鋒出現(xiàn)，且峰值較好。

圖5 Militarine（對照品）溶液HPLC 色譜

圖6 白及凍干片溶液HPLC 色譜

2.9.2 線性關(guān)系考察 由圖7 可知，回歸方程為y=1000 000x-3 783.9，R2=0.999 9，表明對照品溶液在0.041～0.718 mg/mL 時線性關(guān)系良好。

圖7 Militarine 對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.9.3 樣品含量測定 由表12 可知，12 個產(chǎn)地的白及凍干片Militarine 含量為5.32%～10.73%，其中，云南省普洱市、重慶市、陜西省的白及凍干片Militarine 含量均低于6.00%，湖南省張家界市的白及凍干片Militarine 含量高于9.00%，其余8 個產(chǎn)地的白及凍干片Militarine 含量均在6.00%～9.00%，表明不同產(chǎn)地的白及凍干片Militarine 含量存在一定差異。

表12 白及凍干片Militarine 含量測定

3 小結(jié)與討論

隨著冷凍干燥技術(shù)的發(fā)展，越來越多的人選擇冷凍干燥產(chǎn)品，這種產(chǎn)品可以保持食品的原有形狀，更好地保護(hù)產(chǎn)品中一些熱敏性和不穩(wěn)定的活性成分。本研究以12 個產(chǎn)地的白及凍干片為原料，對白及凍干片的質(zhì)量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地白及凍干片的總多糖與Militarine 含量豐富，新加工工藝能更好地保留有效成分，質(zhì)量符合規(guī)定。

白及凍干片粉末顯微特征明顯，草酸鈣針狀結(jié)晶、纖維束及硅質(zhì)塊細(xì)胞、導(dǎo)管、糊化淀粉塊清晰可見，與白及顯微特征一致，鑒定結(jié)果符合《中國藥典》［10］相關(guān)規(guī)定。本研究發(fā)現(xiàn)12 個產(chǎn)地的白及凍干片含水量均不超過7.00%，與《中國藥典》［10］規(guī)定的白及粉末的含水量不同，這可能與白及的生長環(huán)境、種植方式等有關(guān)；白及凍干片的總灰分含量符合《中國藥典》［10］規(guī)定的限量；白及多糖的含量一直備受關(guān)注，白及多糖的藥效作用也不斷得到證實，本研究結(jié)果表明，12 個產(chǎn)地白及凍干片總多糖含量差異較小但也存在一定的差異，可能與白及的產(chǎn)地和種植方式有關(guān)，為藥材凍干處理方法的研究提供了一定的理論依據(jù)；測定12 個產(chǎn)地的Militarine 含量，并對白及凍干片的質(zhì)量進(jìn)行評價，結(jié)果表明，湖南省張家界市的Militarine 含量最高（10.73%），云南省普洱市的Militarine 含量最低（5.32%），不同產(chǎn)地的白及凍干片Militarine 含量差異較大，說明地域、生長環(huán)境、采收時間等因素影響其內(nèi)在質(zhì)量［12］。