基于液相色譜-質(zhì)譜法技術(shù)的膿毒癥代謝標(biāo)志物研究①

黃荔豐,黃雙蓮,蔡志仕,徐文鑫,黃仲慶,張春斌

(1 漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院,福建 漳州 363000;2 福建省漳州市醫(yī)院急診科,福建 漳州 363000)

膿毒癥發(fā)生率高,而且由于早期無特殊癥狀,在臨床上很容易漏診以及誤診,并且病死率高,醫(yī)療花費(fèi)高,嚴(yán)重威脅人類生命健康,降低患者生存質(zhì)量[1]。目前幾乎沒有生物標(biāo)志物可以準(zhǔn)確診斷早期膿毒癥以及預(yù)測患者的預(yù)后情況。隨著系統(tǒng)生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展,利用小分子代謝產(chǎn)物等對(duì)早期膿毒癥患者風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后進(jìn)行評(píng)估得到越來越多的研究。本研究應(yīng)用LC/MS技術(shù)的正離子模式對(duì)成人早期膿毒癥患者和健康成人的外周血進(jìn)行監(jiān)測,運(yùn)用PCA、OPLS-DA、單變量統(tǒng)計(jì)分析等多種統(tǒng)計(jì)方法對(duì)兩者代謝物質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,找出差異,探索尋找早期膿毒癥患者潛在的血清代謝標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019-03～2021-02漳州市醫(yī)院急診科及急診病房收治的膿毒癥20例患者作為膿毒癥組,同期健康體檢者20例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《國家嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克治療指南(2012)》;(2)發(fā)病年齡>18歲;(3)臨床及實(shí)驗(yàn)室資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并嚴(yán)重肝腎疾病;(2)合并惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病或感染性疾病;(3)長期接受激素或免疫抑制劑治療。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑

Waters公司ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1mm× 100mm, 1.7μm)色譜柱,Thermo Fisher Scientific公司Vanquish超高液相色譜儀。

1.2.2 血樣采集

所有研究對(duì)象均于清晨采集隔夜空腹外周血,采集的血樣置于無抗凝劑的真空采血管中,2500rpm離心10min后取上清液置于新EP管中,-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 血清代謝物檢測

取樣本50μL于1.5mL EP管中,加入200μL提取液(甲醇:乙腈=1:1,含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物),渦旋混勻30s, 超聲10min(冰水浴);將樣品4℃,12000rpm離心15min,取上清于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測,所有樣品另取等量上清混合成QC樣品上機(jī)檢測。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理和分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后,使用R程序包(內(nèi)核為XCMS)進(jìn)行峰識(shí)別、峰提取、峰對(duì)齊和積分等處理,然后與BiotreeDB(V2.1)自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋,算法打分的Cutoff值設(shè)為0.3,再通過 R(v3.3.2)XCMS 程序分析獲得質(zhì)核比(mass to charge ratio, m/z)、保留時(shí)間(retention time,rt)、峰面積(intensity)等信息的數(shù)據(jù)矩陣;同時(shí)進(jìn)行峰面積的批次歸一化和標(biāo)準(zhǔn)化處理。使用SIMCA軟件(V16.0.2),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換加中心化格式化處理,然后進(jìn)行自動(dòng)建模分析[2]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用PCA、OPLS-DA對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類,去除重復(fù)性差的樣本和異常樣本,并得到變量投影重要度(variable importance in the projection, VIP) 值。采用t檢驗(yàn)得到P值,并且根據(jù)P值和VIP值篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異代謝物。通過HMDB、Metlin等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配注釋獲取差異代謝物準(zhǔn)確信息,進(jìn)行代謝物結(jié)構(gòu)鑒定。經(jīng)層次聚類(hierarchical clustering)分析形成熱圖,觀察兩組之間的差異代謝產(chǎn)物分類情況。通過ROC曲線進(jìn)一步評(píng)價(jià)并篩選潛在的生物標(biāo)記物。采用 KEGG 數(shù)據(jù)庫對(duì)差異性代謝物進(jìn)行通路富集分析(P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。所有統(tǒng)計(jì)分析和繪圖均采用 R 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

本研究共納入40例標(biāo)本,膿毒癥組20例,對(duì)照組20例。膿毒癥組男12例,女8例,平均(60.05±17.87)歲。對(duì)照組男15例,女5例,平均(51.15±11.51)歲。兩組年齡及性別等資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),見表1。

表1 膿毒癥組和對(duì)照組基本資料對(duì)比(n=20)

2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

PCA分析結(jié)果顯示,膿毒癥組與對(duì)照組分布在不同的區(qū)域(圖1A),表明病變后血清代謝物組成發(fā)生較大差異。進(jìn)一步構(gòu)建正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA),得到相應(yīng)的散點(diǎn)分布圖(圖1B),由圖可知,各樣品組內(nèi)有很好的聚集性,而兩組之間又有很強(qiáng)的分離性。

圖1 兩組血清代謝組學(xué)PCA(A)及OPLS-DA分散點(diǎn)圖

2.3 差異代謝物的篩選

基于OPLS-DA模型,以VIP>1,P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn),并利用HMDB、Metlin等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗(yàn)證,最終得到差異代謝物135個(gè)。為了更直觀表示這些化合物含量的變化,采用熱圖進(jìn)行表示(圖2),從結(jié)果可以看出病變組血清代謝物發(fā)生了較大改變。計(jì)算135個(gè)差異代謝物在兩組實(shí)驗(yàn)間的倍數(shù)關(guān)系(Fold change)值,設(shè)定Fold change>5.00或<0.2,找到 17個(gè)重要差異代謝物(表 2),并且鑒定出 4個(gè)內(nèi)源性代謝物:5’-甲硫腺苷,異亮氨酸丙氨酸,潑尼松龍和甾體。

圖2 膿毒癥組對(duì)健康組的層次聚類分析熱力圖

表2 膿毒癥組與健康組血樣中的重要差異代謝物鑒定結(jié)果

2.4 代謝通路分析

經(jīng) KEGG 數(shù)據(jù)庫對(duì)膿毒癥患者差異性代謝物的代謝通路進(jìn)行分析。結(jié)果顯示兩組主要差異性代謝物富集于7條代謝途徑:嘧啶代謝,精氨酸和脯氨酸代謝、氮代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝,亞油酸代謝、硫代謝、色氨酸代謝(圖3)。根據(jù)代謝通路的P值及影響力值,嘧啶代謝可能是代謝物差異相關(guān)性最高的關(guān)鍵通路(P=0.0052)。

圖3 代謝通路分析結(jié)果

3 討論

膿毒癥患者機(jī)體以代謝亢進(jìn)、高分解代謝狀態(tài)及靜息能量消耗增加為主要的代謝特點(diǎn)[3],三大營養(yǎng)物質(zhì)(糖、蛋白質(zhì)和脂肪)及其代謝產(chǎn)物比例發(fā)生顯著變化。而通過研究膿毒癥患者早期代謝產(chǎn)物的改變,有助于早期診斷膿毒癥。而代謝組學(xué)的出現(xiàn)為研究膿毒癥患者整體代謝譜的變化提供了新的契機(jī)[4]。本次研究通過運(yùn)用LC-MS聯(lián)用技術(shù)測定成人膿毒癥患者與健康人員代謝產(chǎn)物,通過PCA分析和O-PLS-DA分析可見兩組樣本代謝產(chǎn)物差異顯,而且處于95%置信區(qū)間,提示兩組樣本的代謝產(chǎn)物具有顯著差異性。將代謝物質(zhì)經(jīng)二級(jí)質(zhì)譜定性匹配分析及ROC曲線分析,最終鑒定出 4個(gè)內(nèi)源性代謝物:5’-甲硫腺苷、異亮氨酸丙氨酸、潑尼松龍和甾體。

5甲基硫腺苷(5'-Methylthioadenosine MTA)是一種天然存在的含硫核苷,存在于所有哺乳動(dòng)物組織中。MTA作為一種代謝物,可以轉(zhuǎn)化為蛋氨酸,在血漿中的含量為11mmol/L[5～7]。MTA主要通過多胺生物合成途徑由S腺苷甲硫氨酸產(chǎn)生抑制產(chǎn)物。該化合物僅由MTA磷酸化酶代謝,產(chǎn)生5甲基硫代核糖1磷酸和腺嘌呤,分別是蛋氨酸和嘌呤補(bǔ)救途徑中的關(guān)鍵步驟。MTA已被證明可以影響許多細(xì)胞的關(guān)鍵反應(yīng)包括基因表達(dá)、增殖、分化和凋亡的調(diào)節(jié)。MTA可以增強(qiáng)沙門氏菌感染后的細(xì)胞死亡,這歸因于其作為蛋氨酸前體的作用[6]。MTA 還具有甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑作用[8,9],可以在干擾素反應(yīng)過程中抑制 Stat1甲基化[10]。MTA在LPS刺激后具有可以阻斷TNF-a的產(chǎn)生[7,10,11]。Peter A Keyel[12]的研究表明MTA 通過腺苷受體重新編程TLR激活途徑以促進(jìn)炎癥的消退。所有這些都顯示MTA與炎癥介質(zhì)生成相關(guān)的信號(hào)通路[13]相關(guān)。鄭浩等研究報(bào)告也顯示甲硫腺苷與新生兒膿毒癥具有相關(guān)性[14]。本次研究中發(fā)現(xiàn)5’-甲硫腺苷(MTA)在兩組之間有顯著差異,膿毒癥患者明顯升高,與上述研究相符。

膿毒癥時(shí)蛋白質(zhì)分解增加,其中支鏈氨基酸利用率增加,同時(shí)精氨酸的利用率下降,機(jī)體對(duì)芳香族氨基酸的清除率下降,導(dǎo)致血液中精氨酸及芳香族氨基酸增加,支鏈氨基酸下降。本次研究中早期膿毒癥患者異亮氨酸丙氨酸升高,與上述理論不符合,考慮可能是標(biāo)本量少,存在誤差。

潑尼松龍片屬于糖皮質(zhì)激素的藥物,能夠?qū)辜?xì)菌內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體的刺激反應(yīng),減輕細(xì)胞損傷,保護(hù)機(jī)體。甾體是具有環(huán)戊烷多氫菲的基本骨架結(jié)構(gòu)的一類天然化學(xué)成分,廣泛存在于自然界中。對(duì)于這兩種物質(zhì)與膿毒癥的相關(guān)性,國內(nèi)外研究甚少,仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述,LC-MS聯(lián)用技術(shù)可以用于膿毒癥患者代謝譜的研究,MTA等4種代謝物在膿毒癥患者有顯著差異,而MTA有成為早期診斷膿毒癥血清標(biāo)志物的可能性。今后仍需對(duì)差異的代謝產(chǎn)物進(jìn)一步研究,并深入闡述其生物學(xué)意義。本次研究不足之處病例少,多數(shù)膿毒癥患者年齡較大,且可能合并多種疾病,可能造成結(jié)果偏差較大,仍需增加樣本量進(jìn)一步研究;并且由于經(jīng)費(fèi)所限,僅做了正離子檢測,未做負(fù)離子檢測,亦可能影響結(jié)果。