NLRP3—Caspase-1—IL-1β通路在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷中作用研究①

王顯鶴,張 洋,楊玲霞,王 嬌,梅 梅,聶 影,李 蕊

(1.佳木斯大學(xué),黑龍江 佳木斯 154007;2.齊齊哈爾市第一醫(yī)院,黑龍江 齊齊哈爾 161005;3.深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院,廣東 深圳 518172)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是指圍產(chǎn)期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停而導(dǎo)致胎兒或新生兒腦損傷。研究表明,炎癥在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生及發(fā)展過程中具有重要作用[1]。另外新生兒腦缺氧缺血后神經(jīng)炎癥引發(fā)先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答,而作為先天性免疫的重要組成成分炎癥小體與腦損傷的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性,其中NLRP3炎癥小體具有核心作用[1]。本文主要研究NLRP3炎癥小體通路在新生大鼠HIE發(fā)生發(fā)展過程中的作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

健康清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠120只,生后7d,2:1雌雄比例合籠(長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司);兔源NLRP3抗體(Abcam生物工程公司)、鼠源Caspase-1抗體(SANTA CRUZ生物工程公司)、鼠源IL-1β抗體(SANTA CRUZ生物工程公司)。

1.2 模型制作

參照改良Rice-Vannuncci法制備HIE模型。恒溫的37℃缺氧箱,將缺氧后的新生鼠放回母鼠身邊常規(guī)喂養(yǎng)。缺血缺氧后出現(xiàn)自發(fā)前爪伸直障礙、站立不穩(wěn)、翻身困難、夾尾反應(yīng)、四肢抖動或抽搐者納入實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

將7d齡SD大鼠,隨機(jī)分組:空白對照組(Control組)、假手術(shù)組(Sham組)及缺氧缺血性腦損傷組(HIE組)各40只。每組實(shí)驗(yàn)開始6h、48h、72h和7d時間點(diǎn)檢測。HIE組:手術(shù)暴露右側(cè)頸總動脈(RCCA),永久結(jié)扎RCCA近、遠(yuǎn)心端并剪斷結(jié)扎線中間血管后缺氧處理。Sham組:手術(shù)僅暴露分離的RCCA,不做結(jié)扎缺血,不做缺氧處理。Control組:不做任何處置。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

新生大鼠HIE組與Sham組及Control組比較,HIE組不同時間點(diǎn)的NLRP3、Caspase-1和IL-1β水平均明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且NLRP3、Caspase-1和IL-1β在HIE組 6 h均可見水平增高,隨著時間延長表達(dá)逐漸增加,7 d表達(dá)最明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.1 腦組織中NLRP3蛋白表達(dá)測定

見表1。

表1 各組SD新生大鼠腦組織不同時間點(diǎn)NLRP3的表達(dá)

2.2 腦組織Caspase-1蛋白表達(dá)測定

見表2。

表2 各組SD新生大鼠腦組織不同時間點(diǎn)Caspase-1的表達(dá)

2.3 腦組織中IL-1β蛋白表達(dá)測定

見表3。

表3 各組SD新生大鼠腦組織不同時間點(diǎn)IL-1β的表達(dá)

3 討論

新生兒缺氧缺血性腦損傷是新生兒腦損傷最常見的形式,是由圍產(chǎn)期窒息所引起,可導(dǎo)致全世界23%～25%新生兒死亡。HIE的病理生理過程是因血流量減少和腦組織缺氧所致。缺氧缺血導(dǎo)致新生大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞活化[2]。有研究表明,缺氧缺血會誘發(fā)周圍免疫系統(tǒng)和腦實(shí)質(zhì)的炎癥反應(yīng),在介導(dǎo)神經(jīng)元死亡中起關(guān)鍵作用[3]。神經(jīng)元死亡可直接導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化,進(jìn)而引起炎性介質(zhì)(促炎性細(xì)胞因子和趨化因子)大量釋放造成神經(jīng)元凋亡。此外,活化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和炎癥介質(zhì)導(dǎo)致外周免疫細(xì)胞的募集和活化,從而釋放神經(jīng)毒性物質(zhì)進(jìn)一步增強(qiáng)神經(jīng)元死亡。

相關(guān)研究證實(shí),HIE的大鼠造模成功后2h可檢測到小膠質(zhì)細(xì)胞被激活[4]。小膠質(zhì)細(xì)胞是由早期神經(jīng)元死亡激活的,在觸發(fā)神經(jīng)炎癥中起核心作用。HIE后以M1型小膠質(zhì)細(xì)胞激活為特征,進(jìn)而導(dǎo)致繼發(fā)性神經(jīng)元死亡和腦損傷。引起M1激活的最有效機(jī)制之一為IL-1β和IL-18的釋放。Caspase-1對這兩種促炎因子的成熟和分泌至關(guān)重要,在HIE后在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。Liu等研究表明Caspase-1缺乏會明顯減輕新生小鼠缺氧缺血后腦損傷[5]。IL-1受體拮抗劑和IL-1β的使用分別對新生兒腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用和神經(jīng)毒性作用[6]。而NLRP3炎癥小體是活化Caspase-1,控制IL-1β釋放的上游信號因子。因此本實(shí)驗(yàn)建立新生HIE Rice-Vannucci模型[7]進(jìn)一步探究NLRP3炎癥小體通路在新生大鼠缺氧缺血性腦病中的作用機(jī)制。

Tschopp團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)并揭示了炎癥小體與組織損傷、先天免疫過程和Caspase-1之間的關(guān)鍵聯(lián)系[8]。炎癥小體復(fù)合物具有三個主要成分:胞質(zhì)模式識別受體、Caspase-1和促進(jìn)兩者之間相互作用的銜接蛋白。NLRP3炎癥小體激活需要兩個信號過程。信號1:TLR配體脂多糖(LPS)可通過誘導(dǎo)IL-1β的轉(zhuǎn)錄和翻譯,同時激活NLRP3炎癥小體。信號2:ATP等可觸發(fā)炎癥小體復(fù)合物的形成,引起Caspase-1的活化以及IL-1β、IL-18的裂解和釋放。離子紊亂、線粒體功能障礙和ROS產(chǎn)生等各種刺激導(dǎo)致NLRP3活化的事實(shí),表明NLRP3炎癥小體可充當(dāng)細(xì)胞損傷或應(yīng)激的傳感器。CNS對IL-1β、IL-18信號特別敏感,Caspase-1的活化以及隨后的細(xì)胞因子釋放加重了免疫病理性疾病,導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[9,10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:不同組別NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達(dá),Sham組與Control組各時間點(diǎn)Caspase-1表達(dá)比較差異無顯著意義(P>0.05);HIE組與Sham組及Control組對比Caspase-1蛋白水平明顯增加(P<0.01)。不同時間點(diǎn)NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達(dá),Sham組6h、48h、72h及7d各時間點(diǎn)比較,差異無顯著意義(P>0.05);Control組6h、48h、72h及7d各時間點(diǎn)比較,差異無顯著意義(P>0.05);HIE 48h、72h組與HIE 6h組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),HIE 72h組與HIE 48h組比較差異無顯著性意義(P>0.05),HIE 7d組與其余各時間點(diǎn)HIE組相比差異均有顯著意義(P<0.01)。HIE組NLRP3、Caspase-1、IL-1β水平明顯高于對照組,HIE發(fā)病早期6h后NLRP3、Caspase-1、IL-1β開始增加,隨時間變化表達(dá)逐漸增加,HIE后7天達(dá)到高峰。結(jié)果表明NLRP3、Caspase-1、IL-1β參與了新生SD大鼠缺氧缺血后原發(fā)與繼發(fā)性腦損傷,表達(dá)水平越高,腦損傷程度越重,但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)證實(shí)NLRP3炎癥小體及下游因子Caspase-1、IL-1β參與新生大鼠HIE的發(fā)生發(fā)展過程,其表達(dá)與腦損傷程度相關(guān),為靶向治療新生兒HIE提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但其上游激活途徑、是否有其他炎癥小體參與、不同時間段及腦組織表達(dá)部位是否存在差異、炎癥小體抑制劑是否能減輕HIE等仍需進(jìn)一步研究。