化痰祛瘀法中藥調(diào)控lncRNA-TUG1防治動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制研究

李文濤,秦合偉,牛雨晴

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是缺血性心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ),目前對(duì)于缺血性心腦血管疾病的防治不理想,抗血小板、調(diào)血脂、血管介入療法等均難以徹底解決動(dòng)脈再狹窄的根本問(wèn)題[1],中醫(yī)藥的整體觀念、辨證論治、多靶點(diǎn)作用在防治AS方面具有優(yōu)勢(shì)。研究顯示,血管內(nèi)皮細(xì)胞在受外界因素刺激導(dǎo)致?lián)p傷時(shí),引起細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)等分子呈現(xiàn)高表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)單核細(xì)胞與內(nèi)皮的黏附和浸潤(rùn),促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展[2]。在AS的病變過(guò)程中,長(zhǎng)鏈非編碼RNA-TUGl(lncRNA-TUGl)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá),而敲低lncRNA-TUGl表達(dá)能抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,減少低氧及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激下的內(nèi)皮細(xì)胞損傷,降低ICAM-1、VCAM-1表達(dá)水平,抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信號(hào)通路的活化,因此,lncRNA-TUGl參與內(nèi)皮炎癥損傷和AS相關(guān)疾病[3]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn),化痰祛瘀法中藥具有明顯的防治AS的作用[4-8],本研究旨在觀察化痰祛瘀法中藥抗AS的作用機(jī)制是否與靶向調(diào)控lncRNA-TUG1抑制p38 MAPK信號(hào)通路活化及其下游信號(hào)T-p38、p-p38表達(dá),從而抑制炎性反應(yīng)、調(diào)控血脂、保護(hù)血管內(nèi)皮損傷有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)健康雄性載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠60只,體質(zhì)量(20±2)g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006],飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(豫)2016-0009],(22±1)℃恒溫、60%～75%恒濕、12 h循環(huán)照明,自由攝食、飲水。經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核通過(guò),本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案符合安全性和公平性原則,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合國(guó)家對(duì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的有關(guān)要求[4],倫理審核批準(zhǔn)標(biāo)號(hào):20190622。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 研究所用化痰祛瘀法中藥組方為血管軟化丸,組成:山楂30 g,陳皮12 g,清半夏10 g,黃芪30 g,丹參12 g,三七12 g,萊菔子15 g。方中所有中藥均來(lái)源于河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科。按照“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”換算成低、高2個(gè)劑量(43.2 g/kg、86.4 g/kg),分別相當(dāng)于60 kg成人臨床用量等效量的11.6倍和23.3倍,醫(yī)院煎藥房按照要求煎煮成生藥,含量為1.738 g/mL、3.476 g/mL。

1.3 主要試劑 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒(批號(hào):A8203-6,TaKaRa公司),蛋白提取試劑盒(批號(hào):P0027,碧云天公司),MCP-1抗體(批號(hào):ab8015,英國(guó)Abcam公司),VCAM-1抗體(批號(hào):FNab09950,武漢菲恩生物科技有限公司),ICAM-1抗體(批號(hào):FNab04103,武漢菲恩生物科技有限公司),IL-8抗體(批號(hào):ATA31455,武漢益普生物科技有限公司),T-p38抗體(批號(hào):AF869,上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司),p-p38抗體(批號(hào):PL0304503,深圳市豪地華拓生物科技有限公司),熒光二抗(批號(hào):SA00007-2,美國(guó)Proteintech公司),RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào):MR05101M,莫納公司),無(wú)水乙醇(批號(hào):E111963,上海恒斐生物科技有限公司),二甲苯(批號(hào):FT21419yy,上海梵態(tài)生物科技有限公司),磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(批號(hào):JS0722,北京德航五洲科技有限公司),蛋白酶K溶液(批號(hào):YT8625,北京伊塔生物科技有限公司)。

1.4 主要儀器 TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司),MT-200型Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟科技公司),JT-12J型電腦生物組織脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司),HS-B7126-B型包埋機(jī)(沈陽(yáng)恒松科技有限公司),EMUC7型超薄切片機(jī)(德國(guó)Leica公司),光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯北京有限公司),Reichert Ultracut E切片機(jī)(米力光國(guó)際貿(mào)易有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 分組、造模與給藥 ApoE-/-小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后全程給予高脂飼料(含玉米淀粉23.51%、酪蛋白22.18%、可可脂17.19%、蔗糖12.53%、麥芽糊精7.87%、纖維素5.54%、大豆油2.77%、檸檬酸鉀1.83%、磷酸鈣1.44%、膽固醇1.25%、維生素預(yù)混料1.11%、礦物質(zhì)預(yù)混料1.11%、碳酸鈣0.61%、膽酸鈉0.50%、胱氨酸0.33%、膽堿0.22%)喂養(yǎng)。飼養(yǎng)8周造模成功(每組隨機(jī)抽取1只小鼠,可見(jiàn)主動(dòng)脈壁明顯的斑塊形成)后開(kāi)始干預(yù),隨機(jī)分為模型組(每天給予生理鹽水86.4 g/kg)、lncRNA-TUG1拮抗劑組(每天小鼠靜脈注射lncRNA-TUG1拮抗劑30 mg/kg)、化痰祛瘀法低劑量組(每天給予化痰祛瘀法中藥43.2 g/kg)、化痰祛瘀法高劑量組(每天給予化痰祛瘀法中藥86.4 g/kg),每組15只。每天干預(yù)1次,連續(xù)干預(yù)8周。

1.5.2 樣品采集 干預(yù)8周后取材,采集血清檢測(cè)血脂和血清炎性因子水平。取胸腹全長(zhǎng)主動(dòng)脈,其中近心端主動(dòng)脈采用蘇木精-伊紅(HE)染色;其余部分采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)。

1.5.3 血脂檢測(cè) 采用大型生化檢測(cè)儀檢測(cè)各組小鼠血脂4項(xiàng):膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.6 病理學(xué)觀察 收集小鼠近心端主動(dòng)脈,采用HE染色進(jìn)行病理觀察,采用Image Pro Plus 檢測(cè)管腔面積(luminal area,LA)、內(nèi)膜厚度(intima medium thickness,IMT)、斑塊面積(plaque area,PA)、纖維肌性成分(fiber structure,FS)、脂質(zhì)中心面積(cholesterol area,CA)、最小纖維帽厚度(fiber cap thickness,FCT)。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定外周血清ICAM-1、VCAM-1、IL-8和MCP-1等炎性因子水平 采用ELISA法按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中ICAM-1、VCAM-1、IL-8和MCP-1水平。

1.8 RT-PCR檢測(cè)各組主動(dòng)脈lncRNA-TUG1、ICAM-1、VCAM-1相對(duì)表達(dá)量 收集主動(dòng)脈提取總RNA,利用Nanodrop 2000測(cè)定總RNA濃度,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA模板,將熒光染料SYBR Green和目的基因與內(nèi)參GADPH的引物混勻后上機(jī)檢測(cè);反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s,1個(gè)循環(huán);94 ℃ 5 s,58 ℃退火 30 s,35個(gè)循環(huán),72 ℃ 延伸5 min在BIO-RAD Real-Time PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,按照2-△△Ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量[7]。引物序列:lncRNA-TUG1正向引物為5′-GCGTCGTGTACTACTTCGTCG-3′,反向引物為5′-GCGTCGTTACCGAGACTGATT-3′;ICAM-1正向引物為5′-CCGGCATTTACTACTTCGTCG-3′,反向引物為5′-GCTGCTGTACCGAGACCAGCA-3′;VCAM-1正向引物為5′-GCGTCCAAATTTACTCGTCG-3′,反向引物為5′-CAGGGGGGTCCGAGGCAGCA-3′;GAPDH正向引物為5′-AACAGCGTCGGCTCAATATC-3′,反向引物為5′-GGAGTCTTCATGTAGTCTTCCA-3′。

1.9 Western Blot法檢測(cè)主動(dòng)脈p38MAPK信號(hào)通路p38總蛋白(T-p38)及其磷酸化蛋白(p-p38)相對(duì)表達(dá)量 收集血清進(jìn)行處理48 h后的細(xì)胞,提取蛋白,采用二喹啉甲酸法(BCA)蛋白定量法,蛋白電泳、分離、轉(zhuǎn)膜,室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h,用相應(yīng)的一抗(T-p38及p-p38),分別按照1∶200和1∶500孵育,4 ℃過(guò)夜,洗滌后標(biāo)記二抗(滴度1∶200)雜交,采用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)[7],使用Image Lab 4.1圖像分析軟件檢測(cè)T-p38及p-p38印跡條帶凈吸光度值,以β-actin為內(nèi)參,結(jié)果以樣本灰度值/內(nèi)參照灰度值表示。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 動(dòng)物造模鑒定時(shí)每組各處死1只小鼠,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因撕咬致死和灌胃致死6只,采用偏度-峰度檢驗(yàn)法來(lái)判斷離群值,剔除離群值,最后各組納入統(tǒng)計(jì)的小鼠均為10只。

2.2 化痰祛瘀法中藥對(duì)小鼠血脂的影響 模型組與lncRNA-TUG1拮抗劑組TC、TG、LDL-C和HDL-C水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組比較,化痰祛瘀法低劑量組和高劑量組TC、TG、LDL-C水平明顯降低,HDL-C水平明顯升高(P<0.05)。與lncRNA-TUG1拮抗劑組比較,化痰祛瘀法低劑量組和高劑量組TC、TG、LDL-C水平明顯降低,HDL-C水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。化痰祛瘀法低劑量組和高劑量組TC、TG、LDL-C和HDL-C水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖1。

與模型組比較,＊ P<0.05;與lncRNA-TUG1拮抗劑組比較,# P<0.05。圖1 各組小鼠血脂水平比較(n=10)(A為模型組;B為lncRNA-TUG1拮抗劑組;C為化痰祛瘀法低劑量組;D為化痰祛瘀法高劑量組)

2.3 化痰祛瘀法中藥對(duì)小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化程度的影響 光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn),模型組小鼠主動(dòng)脈的管徑變小,管壁厚薄不均勻,內(nèi)膜不光滑,管腔內(nèi)可見(jiàn)明顯的條狀A(yù)S斑塊形成,斑塊內(nèi)可見(jiàn)淺染無(wú)定形物和鈣化顆粒物。lncRNA-TUG1拮抗劑組也可見(jiàn)較小AS斑塊,但病灶表層纖維帽較薄,中膜平滑肌厚度均勻,AS斑塊明顯較模型組小?；奠铕龇ǖ蛣┝?、高劑量組小鼠主動(dòng)脈管徑厚薄雖然不均勻,但未發(fā)現(xiàn)明顯AS斑塊,主動(dòng)脈各層結(jié)構(gòu)清晰,動(dòng)脈粥樣硬化病變程度明顯輕于模型組和lncRNA-TUG1拮抗劑組。詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠主動(dòng)脈病理形態(tài)觀察(HE染色,×200)(A為模型組;B為lncRNA-TUG1拮抗劑組;C為化痰祛瘀法低劑量組;D為化痰祛瘀法高劑量組)

2.4 各組小鼠主動(dòng)脈病理學(xué)檢測(cè)指標(biāo)比較 與模型組比較,lncRNA-TUG1拮抗劑組、化痰祛瘀法低劑量組、化痰祛瘀法高劑量組LA增大,IMT、PA、FS、CA、FCT減小,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與lncRNA-TUG1拮抗劑組比較,化痰祛瘀法低劑量組和化痰祛瘀法高劑量組LA增大,IMT、PA、FS、CA、FCT減小,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?；奠铕龇ǖ蛣┝拷M和化痰祛瘀法高劑量組LA、IMT、PA、FS、CA、FCT比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠主動(dòng)脈病理學(xué)檢測(cè)指標(biāo)比較(±s)

2.5 各組小鼠血清ICAM-1、VCAM-1、IL-8和MCP-1水平比較 與模型組比較,lncRNA-TUG1拮抗劑組、化痰祛瘀法低劑量組和化痰祛瘀法高劑量組小鼠外周血清ICAM-1、VCAM-1、IL-8和MCP-1水平明顯降低(P<0.05);化痰祛瘀法低劑量組和化痰祛瘀法高劑量組小鼠外周血清ICAM-1、VCAM-1、IL-8和MCP-1水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明化痰祛瘀法可能是通過(guò)調(diào)控lncRNA-TUG1降低細(xì)胞液中ICAM-1、VCAM-1、IL-8和MCP-1水平防治AS。詳見(jiàn)圖3。

與模型組比較,＊ P<0.05。圖3 各組小鼠血清ICAM-1、VCAM-1、IL-8和MCP-1水平比較(n=10)(A為模型組;B為lncRNA-TUG1拮抗劑組;C為化痰祛瘀法低劑量組;D為化痰祛瘀法高劑量組)

2.6 化痰祛瘀法對(duì)主動(dòng)脈lncRNA-TUG1、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)的影響 與模型組比較,lncRNA-TUG1拮抗劑組、化痰祛瘀法低劑量組和化痰祛瘀法高劑量組小鼠主動(dòng)脈中l(wèi)ncRNA-TUG1、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平明顯較低(P<0.05)。與lncRNA-TUG1拮抗劑組比較,化痰祛瘀法低劑量組和化痰祛瘀法高劑量組小鼠主動(dòng)脈中l(wèi)ncRNA-TUG1、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)?；奠铕龇ǖ蛣┝拷M和化痰祛瘀法高劑量組小鼠主動(dòng)脈中l(wèi)ncRNA-TUG1、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明化痰祛瘀法可能通過(guò)調(diào)控lncRNA-TUG1降低小鼠主動(dòng)脈ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)防治AS。詳見(jiàn)圖4。

與模型組比較,＊ P<0.05;與lncRNA-TUG1拮抗劑組比較,# P<0.05。圖4 化痰祛瘀法對(duì)主動(dòng)脈lncRNA-TUG1、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)的影響(n=10)(A為模型組;B為lncRNA-TUG1拮抗劑組;C為化痰祛瘀法低劑量組;D為化痰祛瘀法高劑量組)

2.7 化痰祛瘀法對(duì)小鼠主動(dòng)脈T-p38、p-p38蛋白表達(dá)的影響 與模型組比較,lncRNA-TUG1拮抗劑組、化痰祛瘀法低劑量組和化痰祛瘀法高劑量組主動(dòng)脈中T-p38、p-p38蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。與lncRNA-TUG1拮抗劑組比較,化痰祛瘀法低劑量組和化痰祛瘀法高劑量組T-p38、p-p38蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)?；奠铕龇ǖ蛣┝拷M和化痰祛瘀法高劑量組主動(dòng)脈中T-p38、p-p38蛋白表達(dá)水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明化痰祛瘀法可能通過(guò)調(diào)控lncRNA-TUG1降低主動(dòng)脈T-p38、p-p38蛋白表達(dá)防治動(dòng)脈AS。詳見(jiàn)圖5、圖6。

與模型組比較,＊ P<0.05;與lncRNA-TUG1拮抗劑組比較,# P<0.05。圖5 化痰祛瘀法對(duì)主動(dòng)脈T-p38、p-p38蛋白表達(dá)的影響(n=10)(A為模型組;B為lncRNA-TUG1拮抗劑組;C為化痰祛瘀法低劑量組;D為化痰祛瘀法高劑量組)

圖6 各組小鼠主動(dòng)脈T-p38、p-p38蛋白表達(dá)條帶圖(A為模型組;B為lncRNA-TUG1拮抗劑組;C為化痰祛瘀法低劑量組;D為化痰祛瘀法高劑量組)

3 討 論

炎癥反應(yīng)是引起血管內(nèi)皮功能障礙的最常見(jiàn)危險(xiǎn)因素,與TNF-α和白細(xì)胞介素-1(IL-1)的過(guò)表達(dá)有關(guān)[9]。多種因素刺激損傷內(nèi)皮細(xì)胞,高表達(dá)ICAM-1、VCAM-1黏附分子以及IL-8和MCP-1等炎性因子,可引起更嚴(yán)重的內(nèi)皮功能障礙,加劇血管炎癥,導(dǎo)致AS的發(fā)生[2]。研究發(fā)現(xiàn),有39個(gè)lncRNAs參與缺血性心腦血管疾病的發(fā)生,參與AS的病理過(guò)程,lncRNA-TUGl在血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá),而內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋于全身血管的內(nèi)膜,對(duì)維持血管通透性、抗血栓形成、防治AS具有重要的作用[10-11]。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中敲低TUGl表達(dá)能抑制TNF-α刺激下內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,降低ICAM-1、VCAM-1和IL-8和MCP-1等表達(dá)水平,抑制p38 MAPK信號(hào)通路及其下游信號(hào)T-p38、p-p38表達(dá)[12],表明lncRNA-TUGl參與內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和AS的發(fā)生發(fā)展[3]。

AS屬于中醫(yī)學(xué)“脈痹”范疇,痰、瘀等病理產(chǎn)物壅塞脈道,沉積脈壁,痰瘀蓄留不去可形成“脈痹”。本課題組結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論和臨床實(shí)踐,確定“痰瘀阻滯”是AS的主要證型,本研究所用化痰祛瘀法中藥復(fù)方血管軟化丸由保和丸加減化裁而成,該方中山楂消食積滯、活血化瘀,為君藥;陳皮、半夏理氣健脾、化痰散結(jié);黃芪補(bǔ)氣以推動(dòng)血液運(yùn)行;丹參、三七行氣散結(jié)、活血化瘀,共為臣藥,萊菔子理氣消食,為佐藥,諸藥合用,共奏消積化痰、活血化瘀之功。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn),血管軟化丸防治AS與調(diào)控PI3K/AKT/mTOR通路、TLR3/TLR9、miRNA-155、miRNA-181、miRNA-467b等信號(hào)通路有關(guān)[13-17]。本研究旨在觀察化痰祛瘀法中藥抗AS的作用機(jī)制是否與靶向調(diào)控lncRNA-TUG1抑制ICAM-1、VCAM-1表達(dá),抑制p38 MAPK通路活化有關(guān),進(jìn)而揭示中醫(yī)藥防治AS的分子機(jī)制。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),生化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)化痰祛瘀法低劑量組和高劑量組小鼠血清TC、TG和LDL-C水平均降低,HDL-C水平均升高;病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)化痰祛瘀法中藥和lncRNA-TUG1拮抗劑均能夠抑制AS的發(fā)生發(fā)展;lncRNA-TUG1拮抗劑組、化痰祛瘀法低劑量組和高劑量組小鼠外周血清中ICAM-1、VCAM-1、IL-8和MCP-1水平和主動(dòng)脈中l(wèi)ncRNA-TUG1、ICAM-1、VCAM-1、T-p38、p-p38表達(dá)水平低于模型組,表明化痰祛瘀法可能通過(guò)調(diào)控lncRNA-TUG1降低小鼠主動(dòng)脈中l(wèi)ncRNA-TUG1、ICAM-1、VCAM-1、T-p38、p-p38表達(dá)及血清中ICAM-1、VCAM-1、IL-8和MCP-1水平。

綜上所述,化痰祛瘀法防治AS的分子機(jī)制可能與靶向調(diào)控lncRNA-TUG1抑制p38MAPK信號(hào)通路的活化及其下游信號(hào)T-p38、p-p38表達(dá),抑制炎性反應(yīng)、調(diào)控血脂、保護(hù)血管內(nèi)皮損傷有關(guān)。