南蛇藤提取物通過PDCD5對異位子宮內(nèi)膜細胞增殖和凋亡的影響

許素娥,徐迪,郭愛香

子宮內(nèi)膜異位癥是臨床常見的婦科疾病,與育齡婦女月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、慢性盆腔疼痛等有關(guān),子宮內(nèi)膜是子宮內(nèi)壁的組成部分,與雌、孕激素有關(guān),可隨月經(jīng)周期等發(fā)生變化[1]。據(jù)統(tǒng)計,育齡婦女中約有10%～15%患有子宮內(nèi)膜異位癥,是一種復雜綜合征,主要特征是依賴雌激素的慢性炎癥[2]。有研究發(fā)現(xiàn),異位子宮內(nèi)膜細胞惡性增殖和抗凋亡降低是子宮內(nèi)膜異位癥的主要病理機制,也是導致子宮內(nèi)膜容受性下降、不易懷孕的原因[3-4]。南蛇藤是衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物,其根、莖、葉、果均可入藥,具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等多種藥理活性[5]。有研究顯示,南蛇藤提取物抗腫瘤作用明顯,如可以抑制宮頸癌細胞增殖和促進其凋亡[6],但是其在子宮內(nèi)膜異位癥中的研究尚不明確。程序性細胞死亡因子5(programmed cell death factor 5,PDCD5)與腫瘤等疾病發(fā)展密切相關(guān),有研究顯示,PDCD5在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜細胞內(nèi)低表達,下調(diào)PDCD5能夠抑制異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞凋亡和促進細胞增殖[7]。目前多數(shù)研究涉及南蛇藤提取物在腫瘤中的作用機制,但尚未有研究報道其應用于臨床的方案和指導?；诖?本研究通過體外培養(yǎng)分離人異位子宮內(nèi)膜細胞,探討南蛇藤提取物可能通過調(diào)控PDCD5對人異位子宮內(nèi)膜細胞增殖和凋亡的影響,以期為臨床應用南蛇藤提取物治療子宮內(nèi)膜異位癥提供更多循證支持。

1 材料方法

1.1 藥物和主要試劑

南蛇藤購于廣州致信藥業(yè);將南蛇藤莖粉碎成粉,稱取適量樣品,加入95%乙醇溶液150 L,回流提取3次,每次180 min,回收乙醇,加水分散浸膏,加入石油醚、乙酸乙酯進行萃取,重復3次,用水沖洗后,真空壓縮獲得南蛇藤乙酸乙酯提取物。加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)試劑稀釋調(diào)整成50 mg/L,用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

Ⅰ型膠原酶購于上海百賽生物;DMSO購于美國Sigma公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于美國Gibco公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol試劑盒購于美國Invitrogen公司;si-NC、si-PDCD5、引物由上海生工生物設計完成;MTT試劑盒、凋亡試劑盒購于上海貝博生物;p21抗體、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體、PDCD5抗體、GAPDH抗體購于上海煊翎生物;二抗購于武漢博士德公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購于美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 選取在荷澤市中醫(yī)醫(yī)院治療并進行腹腔鏡手術(shù)、病理檢測為子宮內(nèi)膜異位癥的5例患者,患者在術(shù)前3個月內(nèi)沒有服用任何激素藥物,手術(shù)切除的異位子宮內(nèi)膜組織置于凍存管內(nèi)放入液氮罐轉(zhuǎn)運,保存至超低溫冰箱。本研究獲得了本院倫理委員會批準,患者均簽署知情同意書。

1.2.2 分離培養(yǎng)人異位子宮內(nèi)膜細胞 參照文獻[8]:分離培養(yǎng)人異位子宮內(nèi)膜細胞(human ectopic endometrial cells,HEEC),采用PBS沖洗干凈異位子宮內(nèi)膜組織,去掉血漬,將其剪碎成1 cm3大小,然后加入1.5 mL的胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶于室溫下消化60 min,經(jīng)過100目過篩,除去未消化的組織,然后經(jīng)過1 000 r/min離心10 min,收集上清液。將分離獲得的細胞接種在培養(yǎng)皿內(nèi),加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,放在37℃、5%體積分數(shù)的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài),待傳代培養(yǎng)細胞穩(wěn)定后用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞分組 取HEEC細胞分別用0、20、40、80 μg/mL南蛇藤提取物處理,記為南蛇藤提取物各劑量組,其中南蛇藤提取物0 μg/mL組用DMSO處理,為對照組;按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將pcDNA、pcDNA-PDCD5轉(zhuǎn)染細胞中,記為pcDNA組、pcDNA-PDCD5組;將si-NC、si-PDCD5轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi),用80 μg/mL的南蛇藤提取物處理細胞,記為南蛇藤提取物+si-NC組和南蛇藤提取物+si-PDCD5組。

1.2.4 MTT檢測細胞增殖 取經(jīng)過處理的各組HEEC細胞并接種至96孔板中,每孔接種3×105個,分別培養(yǎng)48 h、72 h后,加入20 μL的MTT試劑,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,然后再加入150 μL的DMSO試劑,低速震蕩至結(jié)晶溶解,酶標儀490 nm處檢測細胞光密度OD值。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取經(jīng)過處理的各組HEEC細胞并接種至6孔板內(nèi),每孔接種2×105個,培養(yǎng)48 h,沖洗細胞并制備單細胞懸液,根據(jù)凋亡試劑盒說明書,取5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI與細胞懸液混勻,暗室反應15 min,置于流式細胞儀上檢測細胞凋亡的變化。

1.2.6 Western blot檢測p21、Bcl-2、Bax、PDCD5蛋白表達 用RIPA裂解各組HEEC細胞獲得細胞的總蛋白,根據(jù)BCA法檢測定量蛋白濃度,然后經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳處理,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,采用5%脫脂奶粉封閉培養(yǎng)1 h。加入一抗p21(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、PDCD5(1∶500)和GAPDH(1∶1 000),4℃過夜培養(yǎng),加入帶有標記的二抗(1∶2 000)于37℃培養(yǎng)1 h,在膜上滴加化學發(fā)光試劑顯影、曝光,采用Quantity One軟件分析處理膠片,以GAPDH為內(nèi)參,分析目的蛋白的表達。

1.2.7 RT-qPCR檢測PDCD5 mRNA的表達量 用TRIzol試劑提取各組HEEC細胞內(nèi)總RNA,在酶標儀A260/A280處檢測RNA濃度和純度,且比值在1.8～2.0之間。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA,配置反應體系0.5 μLcDNA、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、5 μL SYBR、3.5 μL無酶水,然后進行PCR擴增反應。以GAPDH為內(nèi)參,用2-ΔΔCt公式計算PDCD5mRNA的表達量。PDCD5正向引物為5′-ACAGATGGCAAGATATGGACA-3′,下游引物為5′-TCCTAGACTTGTTCCGTTAAG-3′。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度南蛇藤提取物對HEEC細胞增殖的影響

MTT和Western blot實驗結(jié)果顯示,南蛇藤提取物各劑量組的細胞OD值(48 h、72 h)顯著降低,p21蛋白表達顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 不同濃度南蛇藤提取物對HEEC細胞增殖的影響

圖1 不同濃度南蛇藤提取物對HEEC細胞p21蛋白的影響

2.2 不同濃度南蛇藤提取物對HEEC細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)和Western blot實驗結(jié)果顯示,南蛇藤提取物各劑量組的細胞凋亡率顯著增加,Bcl-2蛋白表達顯著降低,Bax蛋白表達顯著增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2和下頁圖2。

圖2 不同濃度南蛇藤提取物對HEEC細胞凋亡的影響

表2 不同濃度南蛇藤提取物對HEEC細胞凋亡的影響

2.3 不同濃度南蛇藤提取物對HEEC細胞內(nèi)PDCD5表達的影響

RT-qPCR和Western blot實驗結(jié)果顯示,南蛇藤提取物各劑量組的PDCD5 mRNA和蛋白表達顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見下頁表3和圖3。

圖3 不同濃度南蛇藤提取物對HEEC細胞內(nèi)PDCD5蛋白表達的影響

表3 不同濃度南蛇藤提取物對HEEC細胞內(nèi)PDCD5表達的影響

2.4 過表達PDCD5對HEEC細胞增殖、凋亡的影響

與pcDNA組相比,pcDNA-PDCD5組的PDCD5 mRNA和蛋白表達顯著增加,OD值顯著降低,細胞凋亡率顯著增加,p21、Bax蛋白表達顯著增加,Bcl-2蛋白表達顯著降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見下頁表4和圖4。

圖4 過表達PDCD5對HEEC細胞增殖、凋亡的影響

表4 過表達PDCD5對HEEC細胞增殖、凋亡的影響

2.5 南蛇藤提取物通過PDCD5對HEEC細胞增殖、凋亡的影響

與南蛇藤提取物+si-NC組相比,南蛇藤提取物+si-PDCD5組的PDCD5 mRNA和蛋白表達顯著降低,OD值顯著增加,細胞凋亡率顯著降低,p21、Bax蛋白表達顯著降低,Bcl-2蛋白表達顯著增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見下頁表5和75頁圖5。

圖5 南蛇藤提取物通過PDCD5對HEEC細胞增殖、凋亡的影響

表5 南蛇藤提取物通過PDCD5對HEEC細胞增殖、凋亡的影響

3 討論

中醫(yī)學認為子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制是“血瘀”,氣血失調(diào)、郁怒傷肝、臟腑失調(diào)等引起血行遲滯、氣機不暢[9]。南蛇藤是中國傳統(tǒng)中藥,具有活血消腫、清熱解毒、祛風等功效,民間常用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎、牙痛、閉經(jīng)、跌打損傷等疾病[10-11]。南蛇藤化學成分含量豐富,有萜類、黃酮類、醇類等活性成分,對癌細胞有抑制增殖和促進其凋亡的作用[12-13]。有研究結(jié)果顯示,南蛇藤提取物能抑制胃癌細胞的增殖和促進細胞凋亡,上調(diào)Bax蛋白表達,下調(diào)Bcl-2蛋白表達,呈濃度依賴性[14]。

在食管鱗癌研究中,南蛇藤提取物呈劑量效應抑制食管鱗癌細胞的增殖,并誘導細胞的凋亡[15]。以上均說明南蛇藤提取物對腫瘤的抑制作用,但尚不清楚其在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用。因此,本研究選取不同濃度的南蛇藤提取物處理人異位子宮內(nèi)膜細胞,用于探討南蛇藤提取物對人異位子宮內(nèi)膜細胞增殖和凋亡的作用,結(jié)果顯示,南蛇藤提取物呈劑量依賴性降低人異位內(nèi)膜細胞的OD值,促進細胞的凋亡,上調(diào)p21、Bax蛋白表達,下調(diào)Bcl-2蛋白表達,說明南蛇藤提取物可能通過增加p21、Bax蛋白表達及降低Bcl-2蛋白表達對人異位子宮內(nèi)膜細胞起到抑制增殖和促進凋亡的作用。

PDCD5位于染色體19q12～q13區(qū)域,是凋亡相關(guān)基因的成員之一,分布較為廣泛,在多種癌細胞內(nèi)低表達,如肺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌等[16]。Li PH等[17]研究結(jié)果顯示,PDCD5在白血病細胞系內(nèi)表達下調(diào),過表達PDCD5能抑制細胞增殖,誘導細胞凋亡,p53、Bax蛋白表達上調(diào),Bcl-2蛋白表達下調(diào)。Gao M等[18]研究結(jié)果顯示,在高分化子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)PDCD5蛋白表達下調(diào),與腫瘤的分化程度密切相關(guān)。PDCD5蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥中低表達,與癌癥分期顯著相關(guān),提示PDCD5與子宮內(nèi)膜異位癥密切相關(guān)[19]。本研究顯示,采用不同濃度的南蛇藤提取物處理人異位內(nèi)膜細胞后,PDCD5 mRNA和蛋白表達劑量依賴性上升,實驗結(jié)果進一步顯示,過表達PDCD5能抑制人異位子宮內(nèi)膜細胞增殖和誘導凋亡,將si-PDCD5轉(zhuǎn)染至人異位子宮內(nèi)膜細胞后會增加南蛇藤提取物組的細胞OD值,降低細胞凋亡率,下調(diào)p21、Bax蛋白表達,上調(diào)Bcl-2蛋白表達,提示南蛇藤提取物可能通過調(diào)控PDCD5的表達影響人異位子宮內(nèi)膜細胞增殖和凋亡。

綜上所述,南蛇藤提取物可能通過上調(diào)PDCD5表達抑制人異位子宮內(nèi)膜細胞增殖,促進細胞凋亡。PDCD5是凋亡相關(guān)基因,在多種癌細胞內(nèi)低表達,過表達PDCD5可能通過增加p21、Bax蛋白表達及降低Bcl-2蛋白表達,來抑制人異位子宮內(nèi)膜細胞增殖,促進細胞凋亡。本研究為進一步明確南蛇藤提取物對人異位子宮內(nèi)膜細胞增殖和凋亡的影響,延緩子宮內(nèi)膜異位癥病情發(fā)生發(fā)展提供潛在治療靶點。