細(xì)胞學(xué)P16、HR-HPV、液基細(xì)胞學(xué)預(yù)測高級(jí)別宮頸癌前病變的分層研究

趙芳,馬德勇,王婷婷,張巖,董穎,趙健*

宮頸癌是全球女性第四高發(fā)的惡性腫瘤,盡管宮頸癌病因明確,宮頸癌疫苗逐漸普及,但疫苗效益滯后,現(xiàn)階段高質(zhì)量的宮頸癌篩查仍然是降低我國宮頸癌病死率的最有效手段之一[1]。常用的宮頸細(xì)胞學(xué)檢查(LBP)和高危HPV檢測都有各自的弊端,且疫苗時(shí)代一定程度上帶來了HPV疫苗覆蓋的基因分型感染率的下降,宮頸癌篩查策略也需作出相應(yīng)調(diào)整。因此急需反映宮頸癌真實(shí)進(jìn)展情況的生物標(biāo)志物,以優(yōu)化篩查策略,提高識(shí)別高級(jí)別癌前病變的效能。

P161INK4a(P16)是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑,其過度表達(dá)可以作為HPV感染整合到宿主染色體的標(biāo)記,并反映HPV感染所致的細(xì)胞異常增殖狀態(tài)[2]。目前有兩種P16檢測方法,一種是組織病理學(xué)P16,其作為輔助診斷方法廣泛應(yīng)用于更精準(zhǔn)地判斷高級(jí)別病變[3]。但組織學(xué)P16標(biāo)本獲取需在有創(chuàng)的陰道鏡活檢下取宮頸活組織標(biāo)本進(jìn)行,我國陰道鏡從業(yè)人員不足和技術(shù)不平衡在一定程度上限制了P16在高級(jí)別宮頸病變識(shí)別的優(yōu)勢。另一種是細(xì)胞學(xué)P16,使用宮頸癌篩查的LBP檢測后剩余的標(biāo)本進(jìn)行,無創(chuàng),近幾年逐漸受到宮頸病變醫(yī)生的認(rèn)可。美國陰道鏡和子宮頸病理協(xié)會(huì)提出基于風(fēng)險(xiǎn)分層的陰道鏡檢查[4],并對有潛在高級(jí)別病變風(fēng)險(xiǎn)的女性進(jìn)行管理。本研究對大樣本的宮頸癌篩查細(xì)胞學(xué)、高危HPV以及細(xì)胞學(xué)P16結(jié)果進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層分析,評估其對高級(jí)別病變的預(yù)測意義,以期為我國疫苗后時(shí)代宮頸癌篩查提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

募集2018年1月至2019年7月在北京大學(xué)第一醫(yī)院宮頸病變門診年齡21～69歲有性生活的非妊娠期、非哺乳期女性900例,采用液基細(xì)胞學(xué)聯(lián)合HR-HPV檢測進(jìn)行宮頸癌初篩,并在液基細(xì)胞殘余標(biāo)本中進(jìn)行細(xì)胞學(xué)P16檢測。所有參加初篩的受試者宮頸完整,無宮頸病變手術(shù)史,無宮頸癌放化療史。所有入組對象簽署知情同意書,本研究遵守《赫爾辛基宣言》并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑來源

LBP檢測試劑來自美國The SurePath liquid‐based cytology system(BD Diagnostics),Tripath,Burlington,NC。P16免疫細(xì)胞化學(xué)染色的細(xì)胞保存液和試劑盒來自廣州江元醫(yī)療科技有限公司全自動(dòng)免疫細(xì)胞染色機(jī)(JY-6000)配套試劑。HR-HPV試劑為中國潮州凱普生物技術(shù)有限公司HHM-2型醫(yī)用核酸分子快速雜交儀配套的HPV分型檢測試劑盒。

1.3 宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本收集及檢測

由專門醫(yī)師進(jìn)行病例采集后暴露宮頸,按照規(guī)范操作分別采集2份宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本,一份進(jìn)行LBP和P16檢測,另一份進(jìn)行HR-HPV檢測。

1.3.1 LBP檢測結(jié)果判讀 按照宮頸細(xì)胞學(xué)Bethesda分類系統(tǒng)(TBS)標(biāo)準(zhǔn)[5],鱗狀細(xì)胞分為未見上皮病變或惡性病變(NILM)、未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮(ASCUS)、不除外高度病變的不典型鱗狀上皮(ASC-H)、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)。ASCUS及其以上稱為細(xì)胞學(xué)異常。

1.3.2 P16檢測 將LBP剩余的標(biāo)本按試驗(yàn)要求制成薄層細(xì)胞片并染色,由同一名經(jīng)驗(yàn)豐富的細(xì)胞學(xué)診斷醫(yī)師盲法判讀結(jié)果。顯微鏡下,在1個(gè)及以上細(xì)胞核或細(xì)胞漿呈棕色或棕黃色為P16陽性,未見染色判讀為陰性。

1.3.3 HR-HPV檢測 用HybriMax技術(shù)檢測15種常見的高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68)和6種低危型(6、11、42、43、44、cp8304)等共21種HPV亞型。15種高危型均為陰性判讀為HR-HPV陰性,反之則為HR-HPV檢測陽性。

1.4 陰道鏡檢查和活檢病理組織學(xué)

LBP結(jié)果≥LSIL、HPV16或18陽性、其他高危陽性且LBP為ASCUS即轉(zhuǎn)診陰道鏡檢查。由具有豐富經(jīng)驗(yàn)的細(xì)胞病理醫(yī)生采用3%～5%醋酸試驗(yàn)程序,在陰道鏡檢查異常部位取活檢,或者在血液循環(huán)豐富區(qū)域取活檢,必要時(shí)頸管內(nèi)膜診刮(ECC)[6]。

活檢組織學(xué)標(biāo)本常規(guī)HE染色,同時(shí)行P16和Ki67兩項(xiàng)免疫組化染色(Roche抗P16鼠單克隆抗體、Dako抗Ki67鼠單克隆抗體),由2名高年資病理醫(yī)生判讀結(jié)果。按2014年第四版WHO女性生殖器腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[7]分為正常、LSIL(宮頸上皮內(nèi)廇變CIN1)、HSIL(CIN2和CIN3)、宮頸浸潤癌。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

分層:組織病理學(xué),CIN2及以上為研究終點(diǎn),包括CIN2、CIN3和宮頸浸潤癌,即CIN2+。將篩查結(jié)果分層,① 細(xì)胞學(xué)LBP分為3層:ASCUS及以上為異常結(jié)果,高級(jí)別(ASC-H、HSIL、AGC-NOS/FN)、低級(jí)別(ASCUS、LISL)、正常。② HPV分3層:16/18型、其他型別陽性、陰性。③ P16分兩層:陽性、陰性。計(jì)算不同組合的亞組進(jìn)展為CIN2+的風(fēng)險(xiǎn),即CIN2+的患者數(shù)量與該亞組所有患者總數(shù)的比值。采用SAS 9.6軟件統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料采用頻率描述,應(yīng)用Clopper-Perrson計(jì)算率的(95%CI)值,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

共收集到有效病例900例,年齡為21～69歲,平均(40.57±10.77)歲。其中細(xì)胞學(xué)判讀為ASCUS及以上為218例;HPV陽性356例,HPV陰性544例;細(xì)胞學(xué)P16陽性212例,陰性688例;病理組織學(xué)CIN2級(jí)53例,CIN3級(jí)71例,宮頸癌5例。

2.1 LBP、HR-HPV以及細(xì)胞學(xué)P16不同組合亞組中發(fā)生CIN2+的風(fēng)險(xiǎn)

共有18個(gè)亞組,見表1,按照發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)排序,在亞組A1～A3組發(fā)生CIN2+的風(fēng)險(xiǎn)較高且大于60.0%,分別是93.1%(95%CI:0.772-0.992)、85.5%(95%CI:0.742-0.931)和68.4%(95%CI:0.434-0.874)。亞組A4～A8發(fā)生CIN2+風(fēng)險(xiǎn)較高,在28.5%～50.0%之間,分別為42.9%(95%CI:0.177-0.711)、42.9%(95%CI:0.218-0.660)、40.1%(95%CI:0.191-0.639)、33.4%(95%CI:0.008-0.906)和28.6%(95%CI:0.084-0.581)。A9～A12發(fā)生CIN2+風(fēng)險(xiǎn)較低(低于15%),A13～A18組別中未發(fā)現(xiàn)CIN2+。同時(shí)可看出,排序后發(fā)生CIN2+風(fēng)險(xiǎn)與P16排序一致,P16陰性病例無CIN2+發(fā)生。反而A4組(LBP高級(jí)別、HPV陰性、P16陽性患者14例)出現(xiàn)6例CIN2+,說明HPV陰性預(yù)測值低于P16。P16僅在A7組(LBP高級(jí)別、HPV陰性、P16陰性患者)漏診1例CIN2+,HPV也同時(shí)在這1例患者發(fā)生漏診。

表1 LBP、HR-HPV以及細(xì)胞學(xué)P16不同組合亞組中發(fā)生CIN2的風(fēng)險(xiǎn)

2.2 LBP、HR-HPV不同組合亞組中發(fā)生CIN2+的風(fēng)險(xiǎn)

共有9個(gè)亞組,見下頁表2,按照發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)排序,在亞組B1～B4組發(fā)生CIN2+的風(fēng)險(xiǎn)較高且大于40.0%,分別是87.1%(95%CI:0.702-0.964)、85.5%(95%CI:0.742-0.931)、50.0%(95%CI:0.299-0.701)和41.2%(95%CI:0.184-0.671)。亞組B5～B6發(fā)生CIN2+風(fēng)險(xiǎn)較低,分別為18.8%(95%CI:0.089-0.326)和15.9%(95%CI:0.082-0.267)。B7～B9發(fā)生CIN2+風(fēng)險(xiǎn)更低(低于5%),B9組(LBP正常、HPV陰性)發(fā)生CIN2+風(fēng)險(xiǎn)僅為0.006%(95%CI:0.001-0.018)。但在B4組(LBP高級(jí)別、HPV陰性17例)病例中,HPV漏診7例,提示LBP高級(jí)別特異度良好。

表2 LBP、HR-HPV不同組合亞組中發(fā)生CIN2的風(fēng)險(xiǎn)

2.3 HR-HPV、P16不同組合亞組中發(fā)生CIN2+的風(fēng)險(xiǎn)

共有6個(gè)亞組,見下頁表3,按照發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)排序,在亞組C1組和C2組發(fā)生CIN2+的風(fēng)險(xiǎn)較高且大于60.0%,分別是73.5%(95%CI:0.639-0.818)、61.9%(95%CI:0.488-0.739)。亞組C3發(fā)生CIN2+風(fēng)險(xiǎn)較低,為21.3%(95%CI:0.107-0.357),此組患者為HPV漏診CIN2+病例。C4～C6組發(fā)生CIN2+風(fēng)險(xiǎn)更低(低于5%),C6組(P16陰性、HPV陰性)發(fā)生CIN2+風(fēng)險(xiǎn)僅為0.002%(95%CI:0.000-0.011)。提示HPV、P16均具有優(yōu)秀的陰性預(yù)測值,相比較P16的陽性預(yù)測價(jià)值更高。

表3 HR-HPV、P16不同組合亞組中發(fā)生CIN2的風(fēng)險(xiǎn)

2.4 LBP、P16不同組合亞組中發(fā)生CIN2+的風(fēng)險(xiǎn)

共有6個(gè)亞組,見下頁表4,按照發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)排序,在亞組D1組和D2組發(fā)生CIN2+的風(fēng)險(xiǎn)較高且大于40.0%,分別是81.9%(95%CI:0.732-0.887)、47.8%(95%CI:0.329-0.631)。亞組D3和D4發(fā)生CIN2+風(fēng)險(xiǎn)較D1、D2低,為26.2%(95%CI:0.158-0.391)和20.0%(95%CI:0.005-0.716),在D4組患者中P16漏診CIN2+ 1例。D5～D6組發(fā)生CIN2+風(fēng)險(xiǎn)更低(低于2%),D4～D6組(P16陰性共688例)者中僅4例發(fā)生CIN2+。提示P16的陰性預(yù)測值優(yōu)異。

表4 LBP、P16不同組合亞組中發(fā)生CIN2的風(fēng)險(xiǎn)

3 討論

LBP和高危HPV檢測是目前常用的宮頸癌篩查方法,LBP特異度高,但受制于細(xì)胞學(xué)病理醫(yī)生技術(shù)水平及染色等差異,一致性差,敏感性低,HPV相較LBP更客觀、靈敏度高,故在篩查中的有效性得到廣泛認(rèn)可,并逐漸處于宮頸癌篩查的主導(dǎo)地位,但特異度不足,不能識(shí)別持續(xù)感染,導(dǎo)致過度轉(zhuǎn)診陰道鏡,引起不必要的恐慌,浪費(fèi)社會(huì)醫(yī)療資源。

理想的篩查策略是投入最少,但盡可能多地篩出癌前病變,減少漏診,減少陰道鏡檢查的次數(shù)。研究已經(jīng)明確持續(xù)的HR-HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要因素,HPV具有很好的陰性預(yù)測價(jià)值,可以保證很低的宮頸癌發(fā)生率,因此世界范圍內(nèi)宮頸癌篩查策略逐漸由以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的細(xì)胞學(xué)篩查轉(zhuǎn)至分子生物學(xué)檢測的HR-HPV檢測或包含HR-HPV檢測的策略[8]。

HR-HPV16/18以外型別陽性、LBP陰性在6～12個(gè)月后復(fù)查,HPV16/18陽性、其他型別陽性和LBP異常(ASCUS及異常)時(shí)轉(zhuǎn)診陰道鏡。LBP為LSIL及以上無論是否HPV陽性、ASCUS且HR-HPV陽性直接轉(zhuǎn)診陰道鏡[9]。2019年更新了指南提出“采用基于風(fēng)險(xiǎn)”的管理策略,根據(jù)患者的既往病史及當(dāng)前的檢查結(jié)果判斷發(fā)生CIN3的風(fēng)險(xiǎn)是否達(dá)到4.0%或更高,作為掌握轉(zhuǎn)診陰道鏡的指征[10]。

陰道鏡檢查活檢是宮頸癌三階梯治療中至關(guān)重要的一環(huán),根據(jù)陰道鏡所見在可疑病變組織取活檢,但是否活檢、活檢具體部位、是否連續(xù)活檢等具有一定主觀性,其次患者絕經(jīng)與否、轉(zhuǎn)化區(qū)類型等均可能影響陰道鏡醫(yī)生的判斷,比如宮頸癌時(shí)的出血壞死干擾導(dǎo)致漏診,而陰道微生態(tài)影響、脫落細(xì)胞等導(dǎo)致不必要部位活檢過度診療。陰道鏡的本質(zhì)目的是尋找可疑高級(jí)別病變的部位取活檢,可檢出大部分宮頸表面異常的病灶,但對于頸管的病灶、或?qū)m頸表面因炎癥或化生干擾的病灶,識(shí)別起來可能出現(xiàn)決策困難,但以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的細(xì)胞學(xué)可以提高高級(jí)別病變的檢出率。此外,從腫瘤生成的機(jī)制來講,由于HR-HPV的噬上皮特性,感染宮頸上皮表層細(xì)胞,未整合到宿主染色體時(shí),HR-HPV會(huì)隨宿主上皮細(xì)胞脫落被清除,成為一過性感染,如果足量的病毒通過免疫逃逸,進(jìn)入宮頸黏膜裂口感染宮頸黏膜基底層細(xì)胞,造成整合,并經(jīng)多因素促癌刺激導(dǎo)致宮頸基底層細(xì)胞呈現(xiàn)單克隆增生[11],當(dāng)增殖超過上皮厚度300 μm的無血管的閾值、細(xì)胞聚集成2～3 mm細(xì)胞團(tuán),新生血管形成,最終導(dǎo)致腫瘤。因此除了發(fā)現(xiàn)細(xì)胞異形性之外,異常血管也是高級(jí)別病變的表現(xiàn)形式,在陰道鏡檢查中如果無陽性的陰道鏡所見,則需要在血液循環(huán)豐富區(qū)域連續(xù)活檢,必要時(shí)頸管搔刮[12]。事實(shí)上,細(xì)胞學(xué)和HR-HPV檢測結(jié)果對宮頸癌前病變和宮頸癌有預(yù)測意義,并對后續(xù)的活檢有一定指導(dǎo)作用[13],但陰道鏡醫(yī)師不能局限于此,也需提高專業(yè)技能,重視陰道鏡所見,識(shí)別出高級(jí)別病變和宮頸癌。但由于細(xì)胞學(xué)依賴病理醫(yī)生的技術(shù)水平,不同中心的質(zhì)控存在差異導(dǎo)致判讀缺乏一致性,漏診率高[14]。而HR-HPV盡管有較高的靈敏度,但特異度低,細(xì)胞學(xué)和HR-HPV對陰道鏡活檢部的指導(dǎo)價(jià)值并未達(dá)到預(yù)期。

基于風(fēng)險(xiǎn)分層角度預(yù)測CIN2+的發(fā)生,本研究發(fā)現(xiàn), P16參與的篩查方案A、C、D組分層可見,按照發(fā)生CIN2+發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)由高到低排序,基本與P16符合,P16陽性者發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高,提示了P16具有優(yōu)秀的陰性預(yù)測值。在A組(LBP、HR-HPV、P16組合)中,僅在A7組(LBP高級(jí)別、HR-HPV陰性、P16陰性患者)漏診1例CIN2+, A1～A10 P16陽性發(fā)生CIN2+風(fēng)險(xiǎn)由93.1%～11.5%,而P16陰性發(fā)生率不足5.0%。在亞組A1～A3組(即LBP、P16、HR-HPV三項(xiàng)均陽性)發(fā)生CIN2+的風(fēng)險(xiǎn)較高且大于60.0%,分別是93.1%、85.5%和68.4%,提示此類病例陰道鏡檢查時(shí)需格外重視,避免活檢不足導(dǎo)致漏診。在B組(LBP和HR-HPV組合中),B1和B2組,LBP高級(jí)別、HR-HPV其他型別陽性組發(fā)生CIN2+風(fēng)險(xiǎn)略高于LBP陽性16/18陽性組,分別為87.1%和85.5%,因此兩者均陽性陰道鏡時(shí)需要格外加強(qiáng)注意,但與其他研究HPV 16/18陽性發(fā)生CIN2+風(fēng)險(xiǎn)高的結(jié)果略有差異[15],但也有流行病學(xué)研究表明其他12種發(fā)生CIN2+的風(fēng)險(xiǎn)高于HPV 16/18[16],與本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相似。B4和B3組比較,LBP高級(jí)別、HR-HPV陰性組發(fā)生CIN2+風(fēng)險(xiǎn)低于LBP低級(jí)別、HPV 16/18陽性組,說明16/18預(yù)示發(fā)生CIN2+風(fēng)險(xiǎn)高,與既往研究相似[17]。在亞組D1組(LBP高級(jí)別和P16陽性)和D2(LBP低級(jí)別和P16陽性)組發(fā)生CIN2+的風(fēng)險(xiǎn)較高且大于40.0%,分別是81.9%、47.8%。D4(P16陰性和LBP高級(jí)別)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也僅為20.0%,D4～D6組(P16陰性共688例)患者中僅4例發(fā)生CIN2+。

細(xì)胞學(xué)P16通過抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞蛋白R(shí)B蛋白磷酸化發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期的作用。RB基因產(chǎn)物可降調(diào)P16的表達(dá),在正常細(xì)胞中為低表達(dá),在HPV轉(zhuǎn)染的上皮細(xì)胞內(nèi),HPV功能蛋白E7導(dǎo)致RB功能失活,抑制釋放導(dǎo)致P16過度表達(dá),因此作為新一代生物學(xué)標(biāo)志物,代表HPV感染轉(zhuǎn)化,早于細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生異常被檢測出進(jìn)而實(shí)現(xiàn)宮頸癌早診。對組織病理學(xué)高級(jí)別病變判讀有爭議時(shí),以P16陽性判讀為HSIL,反之為LSIL[18]。P16與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切,一定程度上反映疾病的嚴(yán)重程度,并且其高表達(dá)代表了病毒活動(dòng)期,轉(zhuǎn)染力、增殖力強(qiáng),預(yù)示惡性腫瘤的高度侵襲性[19],可用于監(jiān)測疾病治療效果和預(yù)測預(yù)后。在臨床實(shí)際操作中,細(xì)胞學(xué)P16的采樣流程與LBP同步,對形態(tài)學(xué)依賴小,具有很好的可重復(fù)性,在一定程度上有可能取代LBP。

本研究前期數(shù)據(jù)[20]顯示CIN2+患者P16陽性表達(dá)率顯著高于LSIL和宮頸正常者,并隨著宮頸病變的嚴(yán)重程度呈正相關(guān),一定程度上可以預(yù)測疾病的嚴(yán)重程度,隨著宮頸病變程度的加重,P16的陽性率成增高趨勢。P16陽性可用來警示疾病進(jìn)展高風(fēng)險(xiǎn),指導(dǎo)高級(jí)別病變的預(yù)后。即使P16單篩作為宮頸癌篩查初篩方案,也表現(xiàn)出優(yōu)秀的特異度和靈敏度[21]。因此在陰道鏡檢查時(shí),尤其要關(guān)注P16陽性病例,合并其他兩項(xiàng)異常時(shí),更需要關(guān)注陰道鏡所見,在宮頸異常表現(xiàn)部位充分活檢,以提高高級(jí)別病變的檢出率,減少漏診。相反,P16陰性病例,由于P16的陰性預(yù)測值很高,陰道鏡無陽性發(fā)現(xiàn)則減少盲目活檢,避免不必要的宮頸損傷。

目前許多宮頸癌篩查中心尚未普及細(xì)胞學(xué)P16,綜合評估細(xì)胞學(xué)P16參與的篩查策略的文獻(xiàn)較少,現(xiàn)有的不同篩查中心篩查策略存在差異,研究結(jié)果也不同,本研究入組對象均進(jìn)行了三項(xiàng)篩查,陽性者轉(zhuǎn)診陰道鏡,因此僅進(jìn)行了一項(xiàng)篩查即轉(zhuǎn)診陰道鏡的患者沒有納入研究,可能存在一定的選擇偏倚,有待進(jìn)一步研究糾正。

總之,基于LBP、細(xì)胞學(xué)P16、HR-HPV不同組合在陰道鏡檢查中評估女性發(fā)生CIN2+的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測可用于臨床風(fēng)險(xiǎn)分層管理,有助于陰道鏡醫(yī)生在檢查中除了陰道鏡所見以外,參考已知的檢查結(jié)果進(jìn)行精準(zhǔn)陰道鏡活檢和判讀,有助于CIN2+病例的檢出,減少誤診和降低漏診率,在我國高質(zhì)量的細(xì)胞學(xué)篩查資源極度匱乏的情況下,推廣較HPV相比更能反映HPV感染持續(xù)狀態(tài)和鱗狀細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的P16臨床應(yīng)用,便于因地制宜地選擇相應(yīng)的篩查策略,以適應(yīng)現(xiàn)階段篩查需求。