LSD1抑制劑聯(lián)合順鉑對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞功能影響的研究

李蒙蒙,張麗榮,彭軍,陳瑩瑩,李廣太*

近年來(lái),隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展,腫瘤內(nèi)部的調(diào)控機(jī)制漸趨清晰,表觀遺傳學(xué)中的組蛋白甲基化以及乙?；揎棇?duì)多種腫瘤基因的表達(dá)造成影響,從而控制腫瘤的進(jìn)程[1]。在腫瘤發(fā)生中常伴隨基因甲基化或組蛋白甲基化的缺失[2-3]。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1,LSD1)是一種表觀遺傳酶,它能催化組蛋白H3K4 位點(diǎn)去甲基化、參與多種腫瘤基因的激活,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系,目前已成為研究的熱點(diǎn)。LSD1與多種癌癥預(yù)后相關(guān),并且已被建議作為腫瘤的治療靶點(diǎn)[4-7]。研究表明,LSD1抑制劑對(duì)晚期宮頸癌增殖及轉(zhuǎn)移的治療起到重要作用[8],可通過(guò)對(duì)宮頸癌抑癌基因的甲基化,實(shí)現(xiàn)宮頸癌基因的轉(zhuǎn)錄沉默,增強(qiáng)宮頸癌的治療效果[9]。

本研究通過(guò)LSD1抑制劑OGL002和順鉑聯(lián)合作用于宮頸癌CaSki細(xì)胞系,檢測(cè)LSD1以及其下游組蛋白的表達(dá)水平,最終通過(guò)比較單用藥和聯(lián)合用藥對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡水平的影響,從表觀遺傳學(xué)闡明聯(lián)合用藥的作用效果,以期為晚期復(fù)發(fā)宮頸癌患者的精準(zhǔn)靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人類宮頸癌細(xì)胞系CaSki購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。LSD1特異性抑制劑OGL002購(gòu)自美國(guó)Selleck Chemicals公司,注射用凍干型順鉑購(gòu)自齊魯制藥有限公司,鼠源GAPDH單克隆抗體、兔源LSD1單克隆抗體、兔源H3單克隆抗體、兔源H3K4me1單克隆抗體、兔源H3K4me2單克隆抗體、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將CaSki細(xì)胞培養(yǎng)于恒溫培養(yǎng)箱中,細(xì)胞培養(yǎng)基選擇含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。每3 d更換細(xì)胞培養(yǎng)基,維持細(xì)胞濃度約為1×106個(gè)/mL。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組:對(duì)照組,OGL002組,順鉑組,OGL002+順鉑組。實(shí)驗(yàn)中OGL002組濃度為10 μmol/L,順鉑濃度為2 μmol/L。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將培養(yǎng)的CaSki細(xì)胞以103個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔板,放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中4 h。之后更換培養(yǎng)基,對(duì)照組加入正常培養(yǎng)基,OGL002組加入含有抑制劑的培養(yǎng)基,順鉑組加入含順鉑的培養(yǎng)基,OGL002+順鉑組加入含抑制劑和順鉑的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,到達(dá)時(shí)間后每孔加入10 μL MTT繼續(xù)培養(yǎng)3 h,最后每孔加入150 μL DMSO,酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定吸光度,在測(cè)定中進(jìn)行了6次重復(fù)。

1.2.3 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 將CaSki細(xì)胞接種于六孔板中,細(xì)胞貼壁后,按照組別用藥物處理48 h,之后更換含有10% FBS的1640培養(yǎng)基。14 d后,用甲醇固定細(xì)胞并用結(jié)晶紫(0.1%)染色,拍攝菌落圖。

1.2.4 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 待細(xì)胞長(zhǎng)滿后,離心收集,調(diào)整細(xì)胞濃度,每組分別按照組別用對(duì)應(yīng)的含藥培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將200 μL細(xì)胞懸液用移液槍均勻地轉(zhuǎn)移到Transwell小室,將小室放于24孔板中,下室加入含10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。之后用甲醛固定下室細(xì)胞,用結(jié)晶紫染色。采用顯微鏡對(duì)穿孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),作為細(xì)胞侵襲能力的指標(biāo)。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將CaSki細(xì)胞接種于六孔板中,細(xì)胞貼壁后,分別更換為含藥培養(yǎng)基作用,48 h后離心收集,重懸細(xì)胞后取5×105個(gè)細(xì)胞,加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI,作用10 min后離心,重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)LSD1的表達(dá) 將CaSki細(xì)胞接種于六孔板中,細(xì)胞貼壁后用藥物處理48 h,收集細(xì)胞, Trizol法提取RNA,NanoDrop-2000測(cè)量RNA濃度。之后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,Q-PCR法擴(kuò)增cDNA片段,序列:LSD1上游5’ CGACTTCCCCATGACCGAAT 3’,下游5’GAGTGGCTTCAAACGTCAGC3’,GAPDH上游5’ ATGGCCTTCCGTGTTCCTACC3’,下游5’ CCTGCTTCA CCACCTTCTTGATG 3’。

1.2.7 Western blot檢測(cè)LSD1以及H3K4me1和H3K4me2蛋白的表達(dá) 如前所述離心收集藥物作用后的細(xì)胞,按照RIPA裂解液法提取細(xì)胞總蛋白,通過(guò)BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量,之后向蛋白中加入Lodding buffer,煮沸后使蛋白質(zhì)變性。提前配制電泳凝膠,根據(jù)蛋白定量的值,每孔加入40 μg樣本上樣,注意用Lodding buffer補(bǔ)齊體積,上樣電泳,轉(zhuǎn)膜,之后封閉2 h,兔單抗LSD1(1∶1 000),鼠單抗GAPDH(1∶1 000),H3K4me1(1∶2 000),H3K4me2(1∶2 000),H3(1∶3 000),室溫孵育2 h,之后用TBST洗3次,每次5 min,二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h,TBST洗3次,顯色曝光,Tanon 4200R 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描,Image J 軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示OGL002組、順鉑組與對(duì)照組相比,細(xì)胞增殖的水平明顯下降,并且OGL002+順鉑組細(xì)胞增殖水平最低,說(shuō)明OGL002抑制劑以及順鉑作用于宮頸癌細(xì)胞都可以降低宮頸癌細(xì)胞的增殖,并且二者聯(lián)合用藥對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制作用最大(n=6,***P<0.001)。見(jiàn)下頁(yè)圖1。

圖1 各藥物處理組CaSki細(xì)胞增殖比例柱形圖

2.2 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

為了充分驗(yàn)證OGL002和順鉑聯(lián)合用藥對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響,我們接著進(jìn)行了集落形成實(shí)驗(yàn),OGL002組、順鉑組與對(duì)照組相比,細(xì)胞增殖水平顯著降低,并且OGL002+順鉑組為最低,進(jìn)一步確定二者聯(lián)合用藥對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制作用最大(n=6,**P<0.01,***P<0.001),見(jiàn)下頁(yè)圖2。

圖2 各藥物處理組CaSki細(xì)胞集落形成圖

2.3 Transwell檢測(cè)細(xì)胞的侵襲

Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示,OGL002組和順鉑組與對(duì)照組相比,CaSki細(xì)胞的侵襲水平降低,OGL002+順鉑組為最低(n=6,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001),說(shuō)明抑制劑聯(lián)合順鉑作用降低了宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力,如圖3。

圖3 各藥物處理組CaSki細(xì)胞侵襲圖

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡

為了驗(yàn)證聯(lián)合用藥對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響,我們采用流式細(xì)胞檢測(cè)儀細(xì)胞凋亡, OGL002組和順鉑組與對(duì)照組相比,CaSki細(xì)胞的凋亡水平增加,OGL002+順鉑組凋亡水平高于其它組(n=6,*P<0.05;**P<0.01),說(shuō)明抑制劑以及順鉑增加了CaSki細(xì)胞的凋亡,見(jiàn)下頁(yè)圖4。

圖4 各藥物處理組CaSki細(xì)胞凋亡圖

2.5 Q-PCR法檢測(cè)LSD1基因的表達(dá)量

為了深入探究OGL002抑制劑和順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞影響的分子機(jī)制,我們對(duì)各組LSD1基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),OGL002組和順鉑組與對(duì)照組相比,LSD1基因表達(dá)水平會(huì)明顯降低,OGL002+順鉑組為最低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6,P<0.01),說(shuō)明抑制劑聯(lián)合順鉑降低了LSD1基因的表達(dá),見(jiàn)下頁(yè)圖5。

圖5 各組LSD1基因表達(dá)比例柱形圖

2.6 Western法檢測(cè)LSD1以及下游H3K4me1、H3K4me2蛋白的表達(dá)

OGL002組和順鉑組與對(duì)照組相比,細(xì)胞中LSD1表達(dá)水平降低,而其下游H3K4me1、H3K4me2的表達(dá)升高,其中OGL002+順鉑組差別最大(n=6,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001),說(shuō)明抑制劑以及順鉑都實(shí)現(xiàn)了LSD1蛋白水平的降低以及下游組蛋白甲基化水平升高。見(jiàn)圖6。

3 討論

表觀遺傳學(xué)中的組蛋白甲基化及乙?；揎椨绊懥硕喾N腫瘤基因的表達(dá)從而影響了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[1]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)多種表觀遺傳標(biāo)記的酶可作為癌癥治療的潛在靶點(diǎn)[11]。目前認(rèn)為染色質(zhì)修飾在腫瘤中占有重要地位[12],通過(guò)對(duì)組蛋白進(jìn)行去甲基化修飾以在染色質(zhì)調(diào)控中行使功能。乙?；ǔＥc轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)[13],而組蛋白甲基化作為激活或抑制轉(zhuǎn)錄的標(biāo)記,其對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響主要是由殘基甲基化的位置和程度決定的[14]。越來(lái)越多的證據(jù)表明表觀遺傳酶LSD1在腫瘤基因的表達(dá)和調(diào)控中起著重要的作用[15-16],LSD1可以使組蛋白賴氨酸H3K4 位點(diǎn)去甲基化從而在腫瘤分子信號(hào)通路中調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移。目前已發(fā)現(xiàn)LSD1通過(guò)組蛋白去甲基化影響宮頸癌細(xì)胞的生理過(guò)程,與腫瘤預(yù)后和分化相關(guān)[17]。一些研究表明表觀基因組的變化對(duì)于宮頸癌的治療起著重要的作用,LSD1抑制劑可通過(guò)對(duì)宮頸癌抑癌基因的甲基化,實(shí)現(xiàn)宮頸癌基因的轉(zhuǎn)錄沉默,增強(qiáng)宮頸癌的治療效果,有望成為新的宮頸癌治療靶點(diǎn)[4,9,18]。

順鉑屬于鉑金屬絡(luò)合物的一種治療癌癥的非特異性藥物。以鉑類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是婦科惡性腫瘤的基本化療方案,其聯(lián)合紫杉醇或貝伐珠單抗以治療轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的晚期宮頸癌[10],但對(duì)于晚期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的宮頸癌治療效果并不理想,且常可能會(huì)誘導(dǎo)耐藥和不良作用的產(chǎn)生[19],因此探索聯(lián)合用藥的癌癥治療方案對(duì)于控制癌癥的進(jìn)展以及良好的預(yù)后都具有重要意義。

本研究采用LSD1的特異性抑制劑OGL002和抗癌藥物順鉑作用于宮頸癌細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,OGL002和順鉑分別單獨(dú)應(yīng)用均可抑制宮頸癌CaSki細(xì)胞的增殖和侵襲,但二者的聯(lián)合作用效果比單獨(dú)作用效果更加明顯,對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲抑制的水平更高,同時(shí)也使凋亡水平顯著上調(diào)。

我們進(jìn)一步驗(yàn)證了LSD1以及下游組蛋白甲基化水平對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞的影響,發(fā)現(xiàn)OGL002組和順鉑組與對(duì)照組相比,LSD1基因表達(dá)水平會(huì)明顯降低,OGL002+順鉑組為最低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明OGL002抑制劑聯(lián)合順鉑降低了LSD1基因的表達(dá)。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)其下游H3K4me1、H3K4me2的表達(dá)升高,其中以O(shè)GL002+順鉑組差別最大,說(shuō)明抑制劑以及順鉑都實(shí)現(xiàn)了LSD1蛋白水平的降低以及下游組蛋白甲基化水平升高,但二者的聯(lián)合應(yīng)用更增強(qiáng)了這種效應(yīng)。

腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲能力越強(qiáng),凋亡水平越低,腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率越大,所以目前針對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲增殖和凋亡的檢測(cè)是研究的熱點(diǎn),我們對(duì)LSD1以及下游組蛋白表達(dá)改變的細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡水平進(jìn)行檢測(cè),顯示隨著LSD1表達(dá)水平的降低,細(xì)胞的增殖侵襲能力同時(shí)降低,而細(xì)胞的凋亡水平升高,提示通過(guò)改變宮頸癌細(xì)胞中的組蛋白修飾對(duì)宮頸癌細(xì)胞的表觀遺傳功能產(chǎn)生了影響,從表觀遺傳學(xué)角度闡明了LSD1抑制劑OGL002在宮頸癌中的作用,為后續(xù)宮頸癌的靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),我們正擬行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以尋找新的宮頸癌治療靶點(diǎn)和更進(jìn)一步的循證支持。