IGF1調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

鄭小妹,林葉飛,張韶瓊,楊潔,陳曼玲

據(jù)統(tǒng)計(jì),卵巢癌是全球第二致命的婦科惡性腫瘤,也是女性癌癥死亡的第八大原因[1]。過(guò)去十年間,卵巢癌患病率持續(xù)增加[2]。由于缺乏有效的早期篩查方法,超75%的卵巢癌患者在確診時(shí)已發(fā)展為晚期[3]。因此探索卵巢癌新的治療靶點(diǎn)對(duì)其診療至關(guān)重要。

胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor-1,IGF1)是一種7 kd的單鏈多肽,可通過(guò)刺激細(xì)胞的有絲分裂、抗凋亡和趨化作用促進(jìn)生物體生長(zhǎng)發(fā)育[4]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),IGF1與癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。IGF1在非小細(xì)胞肺癌[5]、結(jié)腸癌[6]、卵巢癌[7-8]中表達(dá)上調(diào),并與腫瘤的耐藥性、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。然而其在卵巢癌發(fā)病中的機(jī)制缺乏進(jìn)一步的研究。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/AKT信號(hào)通路在許多生理和病理狀況中至關(guān)重要,例如細(xì)胞增殖、血管生成、代謝、分化等過(guò)程[9]。研究發(fā)現(xiàn),在大約70%的卵巢癌中PI3K/AKT通路被激活[10],然而尚不清楚IGF1發(fā)揮作用是否與調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)。本研究旨在分析IGF1在卵巢癌組織中的表達(dá),探索IGF1參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,為將來(lái)進(jìn)一步研究卵巢癌免疫療法提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

選取2019年3月至2021年9月于海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除治療的卵巢癌患者27例,Ⅰ～Ⅱ期14例,Ⅲ期13例。收集切除的卵巢癌組織,取材后立即置于液氮冷凍,保存于-80℃冰箱。所有患者術(shù)前均未接受放化療。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并取得患者知情同意。

1.2 細(xì)胞和主要試劑

人卵巢癌細(xì)胞系Skov-3、Caov-3、PA-1購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù),Recilisib(ON 01210)購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress(MCE),胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Giboco公司,si-NC、si-IGF1及BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,LipofectamineTM 2000、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,細(xì)胞培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司,p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、GAPDH抗體購(gòu)自Abcam公司,qRT-PCR試劑盒(RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green試劑)、CCK8試劑盒購(gòu)自Vazyme公司,胰酶消化液購(gòu)自sigma公司,Transwell小室購(gòu)自Corning公司,GAPDH引物、IGF1引物、PI3K引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞系Skov-3、Caov-3、PA-1使用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng),均置于37 ℃、5%CO2恒溫的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3 d進(jìn)行換液,根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)密度更換新鮮的培養(yǎng)基,當(dāng)細(xì)胞匯集80%左右進(jìn)行傳代培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將以3.5×106個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Skov-3細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)密度至65%～75%時(shí),分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-IGF1,設(shè)置為si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)與si-IGF1組(轉(zhuǎn)染si-IGF1)。嚴(yán)格按照說(shuō)明書,采用Lipofectamine 2000將si-NC、si-IGF1轉(zhuǎn)染至Skov-3細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)IGF1基因表達(dá)水平。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) TRIzol試劑提取人卵巢癌腫瘤組織、癌旁組織以及人卵巢癌細(xì)胞系Skov-3、Caov-3、PA-1中的總RNA,收集RNA樣品,測(cè)定濃度后按照qRT-PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,依次進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。具體為:第一階段,95 ℃ 3 min,1個(gè)循環(huán);第二階段,95 ℃ 12 s,62 ℃ 40 s,95 ℃ 15 s,40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后,2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量,GAPDH作為內(nèi)參基因。Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,交由上海生工生物工程公司合成。qRT-PCR引物序列:GAPDH-F,5-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3,GAPDH-R,5-GCGCCCAATACGACCAAATC-3;IGF1-F,5-ACCTG CCTGGGTGTCCAAAT-3、IGF1-R,5-CGATAGGGACGG GGACTTCT-3;PI3K-F,5-ACCTTAAATGGTGAGCACGGA,PI3K-R,5-GGCCCGCACTGTAACCTATT-3。

1.3.4 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá) 采用RIPA裂解液從組織和細(xì)胞中分別提取總蛋白。使用10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),然后再將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,接著采用5%脫脂奶粉封閉1 h,再加入一抗p-PI3K(1∶1 000),PI3K(1∶1 000),p-AKT(1∶1 000),AKT(1∶1 000),GAPDH(1∶4 000)于4℃冰箱中過(guò)夜孵育。次日,采用TBS將PVDF膜清洗3次后,加入羊抗兔二抗(1∶2 000)于室溫條件下孵育1 h,再使用TBS清洗3次后,加入化學(xué)發(fā)光劑避光孵育3 min,然后將PVDF膜放入成像系統(tǒng)中采集圖片信息,并使用Image J軟件計(jì)算灰度值。

1.3.5 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖水平 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Skov-3細(xì)胞接種于96孔板,每孔細(xì)胞數(shù)為1×104。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,按照之前所述步驟,進(jìn)行細(xì)胞的處理及轉(zhuǎn)染。隨后向每孔細(xì)胞內(nèi)添加10 μL CCK-8溶液,37 ℃條件下孵育4 h后,酶標(biāo)儀測(cè)定450 nmol/L處的光密度(optical density,OD)值作為細(xì)胞的相對(duì)增殖率。

1.3.6 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 取50 μL基質(zhì)膠鋪于8 μm Transwell小室內(nèi),37 ℃培養(yǎng)箱靜置1 h。取各組細(xì)胞,胰酶消化后離心,后用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2×104/mL,接種于Transwell小孔上室,每孔200 μL。下室加入500 μL含10%血清的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室,用4%的多聚甲醛固定15 min,0.1%結(jié)晶紫染色20 min,PBS清洗后在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌患者IGF1、PI3K表達(dá)水平相關(guān)性比較

qRT-PCR結(jié)果顯示,與癌旁組織比較,腫瘤組織IGF1(P=0.001)和PI3K(P=0.001)表達(dá)水平升高,見(jiàn)圖1A;與Ⅰ～Ⅱ期比較,Ⅲ期腫瘤組織中IGF1(P=0.006)和PI3K(P=0.004)表達(dá)水平升高,見(jiàn)圖1B。在腫瘤組織中,IGF1和PI3K的表達(dá)水平呈正相關(guān)(P=0.001),見(jiàn)圖1C。

注:A為癌旁組織和腫瘤組織IGF1和PI3K表達(dá)水平;B為Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ期腫瘤患者腫瘤組織IGF1和PI3K表達(dá)水平;C為IGF1和PI3K表達(dá)水平相關(guān)性分析。與癌旁組織比較,*P<0.05;與Ⅰ～Ⅱ期比較,*P<0.05

2.2 細(xì)胞系選擇和si-IGF1細(xì)胞系構(gòu)建

qRT-PCR結(jié)果顯示,與Caov-3和PA-1細(xì)胞比較,Skov-3細(xì)胞IGF1表達(dá)水平升高(P=0.003、0.005)見(jiàn)圖2A。因?yàn)镾kov-3細(xì)胞中IGF1表達(dá)水平最高,因此后續(xù)選擇Skov-3作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)行敲減IGF1。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-IGF1和si-NC轉(zhuǎn)染至Skov-3細(xì)胞,qRT-PCR結(jié)果顯示,與si-NC組比較,si-IGF1組IGF1基因表達(dá)水平降低(P=0.002),說(shuō)明si-IGF1細(xì)胞系構(gòu)建成功,見(jiàn)圖2B。

注:A為Caov-3、PA-1和Skov-3細(xì)胞中IGF1表達(dá)水平;B為si-IGF1沉默IGF1效率。與Caov-3、PA-1比較,*P<0.05;與si-NC組比較,*P<0.05

2.3 沉默IGF1抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲

CCK8結(jié)果顯示,與si-NC組比較,si-IGF1組細(xì)胞增殖能力降低,在72 h時(shí)表現(xiàn)出顯著性差異(P=0.013),見(jiàn)下頁(yè)圖3A。Transwell結(jié)果顯示,與si-NC組比較,si-IGF1組細(xì)胞侵襲能力降低(P=0.001),見(jiàn)下頁(yè)圖3B。

注:A為si-NC和si-IGF1組細(xì)胞增殖能力;B為si-NC和si-IGF1組細(xì)胞侵襲能力。與si-NC組比較,*P<0.05

2.4 沉默IGF1抑制PI3K/AKT信號(hào)通路

Western blot結(jié)果顯示,與si-NC組比較,si-IGF1組p-PI3K(P=0.002)和p-AKT(P=0.001)蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05),見(jiàn)圖4。

注:與si-NC組比較,*P<0.05

2.5 激活PI3K/Akt信號(hào)通路不影響IGF1表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示,與si-NC組和si-IGF1組比較,si-NC+Recilisib和si-IGF1+Recilisib組p-PI3K(si-NC vs si-NC+Recilisib,P=0.001;si-NC vs si-IGF1+Recilisib,P=0.002;si-IGF1 vs si-IGF1+Recilisib,P=0.001)、p-AKT(si-NC vs si-NC+Recilisib,P=0.001;si-NC vs si-IGF1+Recilisib,P=0.001;si-IGF1 vs si-IGF1+Recilisib,P=0.001)蛋白表達(dá)水平升高,見(jiàn)圖5A。qRT-PCR結(jié)果顯示,與si-NC組比較,si-NC +Recilisib組IGF1基因表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.674);與si-IGF1組比較,si-IGF1 +Recilisib組IGF1基因表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.537),見(jiàn)圖5B。說(shuō)明PI3K/AKT信號(hào)通路不影響IGF1表達(dá),IGF1位于PI3K/AKT信號(hào)通路上游。

注:A為四組細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平;B為四組細(xì)胞中IGF1基因表達(dá)水平。與si-NC組比較,*P<0.05

2.6 激活PI3K/AKT信號(hào)通路拮抗IGF1對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

CCK8結(jié)果顯示,與si-NC組和si-IGF1組比較,si-NC+Recilisib和si-IGF1+Recilisib組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),在72 h時(shí)表現(xiàn)出顯著性差異(si-NC vs si-NC+Recilisib,P=0.023;si-NC vs si-IGF1+Recilisib,P=0.027;si-IGF1 vs si-IGF1+Recilisib,P=0.018),見(jiàn)下頁(yè)圖6A。Transwell結(jié)果顯示,與si-NC組比較,si-NC+Recilisib和si-IGF1+Recilisib組細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)(si-NC vs si-NC+Recilisib,P=0.004;si-NC vs si-IGF1+Recilisib,P=0.007;si-IGF1 vs si-IGF1+Recilisib,P=0.001),見(jiàn)下頁(yè)圖6B。

注:A為四組細(xì)胞增殖能力;B為四組細(xì)胞侵襲能力;與si-NC組比較,*P<0.05

3 討論

卵巢癌是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一,復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高,死亡率呈逐年上升趨勢(shì)[11]。目前卵巢癌治療以手術(shù)治療為主,再輔以放療、化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等綜合治療,但卵巢癌的存活率仍因分期不同有很大差異[12]。因此,探究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,尋找可靠的治療靶點(diǎn),一直是卵巢癌臨床研究的熱點(diǎn)和關(guān)鍵。

在垂體生長(zhǎng)激素的刺激下,IGF1主要在肝臟中產(chǎn)生,具有與胰島素相似的分子結(jié)構(gòu),并能夠在胎兒發(fā)育過(guò)程中調(diào)節(jié)許多組織的生長(zhǎng)和發(fā)育[13]。在女性生殖系統(tǒng)中,IGF1在卵泡發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用,它們負(fù)責(zé)在排卵后修復(fù)上皮組織[14]。卵巢腫瘤細(xì)胞通過(guò)自分泌或旁分泌細(xì)胞因子來(lái)激活上皮細(xì)胞來(lái)源的IGF信號(hào)通路,這可能介導(dǎo)卵巢表面上皮細(xì)胞中不受控制的傷口愈合機(jī)制[15],因此,在卵巢癌患者中,IGF1及其受體在調(diào)節(jié)卵巢表面上皮細(xì)胞的正常生物學(xué)中發(fā)揮重要作用。研究表明,IGFs在卵巢癌患者中高表達(dá),并且還可能與卵巢癌發(fā)生和耐藥性相關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn),與癌旁組織比較,卵巢癌患者的腫瘤組織中IGF1的mRNA表達(dá)水平增加,當(dāng)沉默IGF1時(shí)會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲,這與之前的研究報(bào)道一致,同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌細(xì)胞系中也有顯著的IGF1表達(dá)上調(diào)[17]。以上結(jié)果表明,IGF1可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移等參與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。

PI3K屬于脂質(zhì)激酶家族,AKT是PI3K的直接下游效應(yīng)體,PI3K/AKT是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝和增殖等多種生物學(xué)過(guò)程信號(hào)傳導(dǎo)的重要途徑[18]。當(dāng)細(xì)胞外配體(例如胰島素或胰島素樣生長(zhǎng)因子)與細(xì)胞膜受體(例如酪氨酸激酶受體或G 蛋白偶聯(lián)受體)結(jié)合后,PI3K被激活,催化PIP2磷酸化生成 PIP3,募集AKT和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶 1(phosphoinositol-dependent kinase 1,PDK1)到細(xì)胞膜,激活的AKT磷酸化下游底物,從而調(diào)控細(xì)胞遷移、代謝和周期進(jìn)展[19]。

越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn), PI3K/AKT信號(hào)通路在促進(jìn)癌癥發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用,Du L等[20]研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路可以抑制人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。在結(jié)直腸癌中,PI3K/AKT信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)與結(jié)直腸癌細(xì)胞的耐藥性和肝轉(zhuǎn)移相關(guān),當(dāng)抑制該信號(hào)通路,腫瘤細(xì)胞耐藥性與轉(zhuǎn)移能力均下降[21]。另外,有研究證明,PI3K/AKT信號(hào)通路在卵巢癌腫瘤的形成、癌細(xì)胞遷移、侵襲和化療抵抗中發(fā)揮重要作用[22]。除在卵巢癌發(fā)生中的作用外,PI3K/AKT信號(hào)通路也被證明可以防止卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中原始卵泡的損傷[23]。本研究同樣發(fā)現(xiàn),PI3K表達(dá)水平上調(diào),并與腫瘤分期相關(guān);在腫瘤組織中,IGF1和PI3K的表達(dá)水平呈正相關(guān),這提示IGF1和PI3K之間可能存在相互調(diào)控的作用。既往研究發(fā)現(xiàn),IGF1可以激活 PI3K/AKT 信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)展[24-25]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),沉默IGF1抑制PI3K/AKT信號(hào)通路,而激活PI3K/AKT信號(hào)通路不影響IGF1的表達(dá),但是可以拮抗IGF1對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。以上結(jié)果提示,在卵巢癌的發(fā)展中,PI3K可能受到IGF1的調(diào)控作用,IGF1可能是通過(guò)上調(diào)PI3K的表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖與遷移。

綜上所述,IGF1與PI3K在卵巢癌中高表達(dá),并且具有顯著相關(guān)性。IGF1可能通過(guò)增強(qiáng)PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲,最終介導(dǎo)腫瘤惡化。以上結(jié)果初步明確了IGF1與PI3K/AKT在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用,可為進(jìn)一步探討卵巢癌增殖和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的思路。