基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建SIRT6基因敲除的A549肺腺癌細(xì)胞系

吳龍俊云,趙立峰,蘭翼君,趙雯莉,楊波,李也鵬

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西 百色 533000;3. 右江民族醫(yī)學(xué)院,廣西 百色 533000)

肺癌的發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中高居首位,并有繼續(xù)上升的趨勢(shì)[1]。其中非小細(xì)胞肺癌在肺癌中占有很大的比重,達(dá)到80%～85%,而作為非小細(xì)胞肺癌最常見(jiàn)的病理類型,肺腺癌近年來(lái)發(fā)病率持續(xù)上升,早期即可出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,大部分患者在就診時(shí)已是中晚期,預(yù)后很差[2-3]。因此,探索肺腺癌新的分子靶點(diǎn),為肺腺癌患者制定新的治療策略至關(guān)重要。作為人肺腺癌上皮細(xì)胞系的一員,A549細(xì)胞與Ⅱ型肺泡細(xì)胞非常相似,包括形態(tài)、結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物組成。因此,A549 細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于模擬Ⅱ型肺泡細(xì)胞反應(yīng)的研究[4-6]。Sirtuin家族是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性酶家族。已有研究表明,Sirtuin家族成員具有去乙?；揎椂喾N蛋白的功能,因此其能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,參與細(xì)胞基因組穩(wěn)定性、分化、衰老、凋亡、新陳代謝等多種重要的病理、生理過(guò)程,進(jìn)而影響多種腫瘤的形成和發(fā)展過(guò)程[7-8]。Sirtuin 6(SIRT6)是Sirtuin家族成員之一,具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、新陳代謝、端粒的完整性和維護(hù)基因組穩(wěn)定性的作用,在糖尿病、肥胖、心臟病、衰老和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演十分重要的角色[9]。CRISPR/Cas9是一種精準(zhǔn)高效的新型編輯技術(shù),Cas9可以對(duì)靶基因組進(jìn)行剪切,形成 DNA 的雙鏈斷裂,DNA修復(fù)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)造成移碼突變,使靶標(biāo)基因失去功能,從而實(shí)現(xiàn)基因敲除[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng),借助慢病毒載體構(gòu)建SIRT6基因敲除的人肺腺癌A549細(xì)胞株,將為更深入探索SIRT6在肺腺癌的功能機(jī)制提供基礎(chǔ)條件。

1 材料與方法

1.1生物材料 人肺腺癌細(xì)胞A549,1640培養(yǎng)基(biosharp)、DMEM 培養(yǎng)基(biosharp)、慢病毒(上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)、Polybrene(上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)、Primer(上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)、Oligo引物(上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)。

1.2主要試劑 胎牛血清(biocell)、嘌呤霉素、胰酶、SIRT6抗體、DNA試劑盒、PDVF膜、lip3000。

1.3主要儀器 低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(杭州申花科技有限公司)、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-rad)、電泳儀(Bio-rad)、倒置顯微鏡(Leica 公司)、PCR儀器(Biometra)、酶標(biāo)儀(SpectraMax/iD5)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1設(shè)計(jì)靶點(diǎn)的sgRNA序列 利用CRISPR-Cas9靶點(diǎn)制作原理,設(shè)計(jì)3種不同并符合實(shí)驗(yàn)要求的sgRNA-SIRT6序列(sgRNA-SIRT6-27、sgRNA-SIRT6-28、sgRNA-SIRT6-29),見(jiàn)表1。以設(shè)計(jì)的sgRNA序列為模板,在模板鏈的5′端添加堿基CACCg,互補(bǔ)鏈的3′端補(bǔ)加堿基C,5′端添加堿基aaac,確保3種sgRNA-SIRT6都能與BbsⅠ酶切后的SIRT6質(zhì)粒形成的黏性末端互補(bǔ),設(shè)計(jì)的寡核苷酸鏈合成序列,見(jiàn)表2 。SIRT6單鏈DNA Oligo由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司設(shè)計(jì)及合成。

表1 sgRNA序列

表2 sgRNA oligo序列

1.4.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 利用合成的sgRNA-SIRT6 Oligo經(jīng)梯度降溫PCR退火形成雙鏈sgRNA。95 ℃水浴15 min,然后冷卻至室溫,經(jīng)梯度降溫PCR退火形成帶黏性末端的雙鏈sgRNA,將退火產(chǎn)物稀釋200倍使用。由限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切載體質(zhì)粒,取Vector plasmid 1 μL,10X Buffer Tango 2 μL,DTT (20 mM)1 μL,BsmBI 1 μL,加ddH2O補(bǔ)至20 μL,經(jīng)過(guò)37 ℃酶切3 h得到線性化載體DNA,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收。取線性化的載體DNA 50 ng/μL,退火的雙鏈 DNA 0.5 μL,10×T4 Buffer 1 μL,EG4000 1 μL,T4 DNA Ligase 1 μL,加ddH2O補(bǔ)至10 μL,16 ℃連接3 h獲得酶切連接產(chǎn)物。將酶切連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)至大腸桿菌TOP10感受態(tài)菌體內(nèi),將其均勻地涂布在含氨芐西林(Amp)的固態(tài)培養(yǎng)基上,24 h后挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定,得到陽(yáng)性克隆后測(cè)序,得到序列正確的表達(dá)sgRNA的過(guò)表達(dá)慢病毒質(zhì)粒。擴(kuò)增序列正確的克隆菌液,用中小量質(zhì)粒提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取質(zhì)粒,送檢測(cè)序。

1.4.3sgRNA-SIRT6慢病毒包裝 用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞,以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度約5.0×106細(xì)胞/15 mL,接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí),取SIRT6-sgRNA重組質(zhì)粒DNA溶液16 μg和25 μL Lenti-Easy Packaging Mix與相應(yīng)體積的Opti-MEM混合均勻,總體積為1.5 mL,室溫下溫育15 min,將混合液滴加入至293T細(xì)胞培養(yǎng)液中,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),孵育6 h后棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基,緩慢加入含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基 20 mL,于 37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。收集轉(zhuǎn)染后48 h的293T細(xì)胞上清液;離心,加入病毒保存液,輕輕反復(fù)吹打重懸;離心后取上清液獲得病毒溶液,行滴度測(cè)試。

1.4.4sgRNA-SIRT6慢病毒感染細(xì)胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選 將A549種于6孔板中,細(xì)胞量為105。24 h后更換培養(yǎng)基并加入慢病毒進(jìn)行感染,設(shè)置陰性對(duì)照,6孔板終體積為2 mL,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。加入嘌呤霉素篩選細(xì)胞,待陰性對(duì)照細(xì)胞死完,轉(zhuǎn)移細(xì)胞到6 cm皿繼續(xù)篩選。取上述少量細(xì)胞,DNA提取試劑盒提取DNA并測(cè)序,測(cè)序引物見(jiàn)表3。細(xì)胞正常胰酶消化,吹打成單細(xì)胞,移入96,24/6孔板繼續(xù)培養(yǎng),并收取蛋白。

表3 Real-time PCR引物列表

1.4.5單克隆細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞正常胰酶消化,200×g離心5 min后,吹打成單細(xì)胞,計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞,并將細(xì)胞加入到10 mL培養(yǎng)基中,吹打均勻,96孔板每孔加入100 μL細(xì)胞懸液,使每孔細(xì)胞0.5個(gè)左右。24 h后觀察細(xì)胞貼壁情況及形態(tài),在單克隆孔中補(bǔ)加100 μL培養(yǎng)基。細(xì)胞長(zhǎng)滿96孔板按此程序:經(jīng)傳代到24孔板,6孔板到擴(kuò)大培養(yǎng),并收取蛋白樣品做WB,凍存細(xì)胞。

1.4.6Western Blot檢測(cè)細(xì)胞SIRT6蛋白表達(dá) 選取對(duì)照A549細(xì)胞與過(guò)表達(dá)的A549細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,PBS清洗后用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白并用BCA法進(jìn)行蛋白定量,每個(gè)樣各取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,電泳后轉(zhuǎn)至 PVDF 膜,濕轉(zhuǎn)120 min,5%BSA 搖床封閉1 h。一抗、二抗孵育,加入曝光底物進(jìn)行曝光。以GAPDH為內(nèi)參,檢測(cè)SIRT6蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1基因敲除表達(dá)載體的鑒定 重組質(zhì)?；驕y(cè)序結(jié)果顯示在酶切位點(diǎn)之間插入的片段位置、方向及序列分別與3個(gè)sgRNA(sgRNA-SIRT6-27、sgRNA-SIRT6-28、sgRNA-SIRT6-29)序列一致,靶向 SIRT6基因的sgRNA序列成功插入載體 ,證明過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。見(jiàn)圖1。

注:A.質(zhì)粒sgRNA-SIRT6-27;B.質(zhì)粒sgRNA-SIRT6-28;C.質(zhì)粒sgRNA-SIRT6-29。

2.2SIRT6敲除的人肺腺癌A549細(xì)胞DNA測(cè)序鑒定 嘌呤霉素篩選慢病毒感染后細(xì)胞,進(jìn)行單克隆培養(yǎng),提取細(xì)胞基因組DNA,并對(duì)3個(gè)單克隆(SIRT6-27、SIRT6-28、SIRT6-29)進(jìn)行PCR和測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果表明3個(gè)單克隆擴(kuò)增的PCR片段大小約為400 bp左右,SIRT6-27和SIRT6-29擴(kuò)增的PCR片段與原始序列相比,未見(jiàn)堿基改變,而SIRT6-28的PCR片段有明顯的堿基突變,而且峰圖顯示突變點(diǎn)處出現(xiàn)套峰。見(jiàn)圖2。

2.3SIRT6基因敲除后A549細(xì)胞內(nèi)SIRT6蛋白表達(dá) 將成功敲除SIRT6基因的A549細(xì)胞進(jìn)行單克隆培養(yǎng),收取蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)SIRT6蛋白表達(dá),以未感染的A549細(xì)胞系作為對(duì)照,Western Blot顯示經(jīng)SIRT6基因敲除后的A549細(xì)胞內(nèi)SIRT6蛋白不表達(dá),說(shuō)明 SIRT6基因敲除成功,見(jiàn)圖3。

注:SIRT6-28測(cè)序結(jié)果與原基因序列比對(duì)分析,“▲”表示突變的堿基;“△”表示峰圖出現(xiàn)套峰。

注:蛋白在第一次和第二次背景雜帶多,第三次WB結(jié)果正常。

3 討論

SIRT6是一種同時(shí)具有單ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶、脫脂酰化酶和去乙?；傅亩喙δ艿鞍踪|(zhì),這三種酶促特性構(gòu)成了SIRT6調(diào)節(jié)各種生理和病理過(guò)程的能力的基礎(chǔ)[11]。SIRT6可以通過(guò)調(diào)控人體諸多病理、生理過(guò)程,從而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[10]。一些研究認(rèn)為,SIRT6是一種抑癌基因。一項(xiàng)在膀胱癌的研究發(fā)現(xiàn),T4分期與T2相比,SIRT6的表達(dá)明顯降低,低SIRT6表達(dá)增加H3K9的乙酰化以及Glut1和PDK1的水平,增強(qiáng)糖酵解,并增加腫瘤細(xì)胞的增殖能力[12]。在鼻咽癌中,SIRT6過(guò)表達(dá)導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2的水平降低,但增加裂解的半胱天冬酶-3和促凋亡蛋白Bax的水平。高水平的SIRT6抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)并促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡[13],而SIRT6在人膠質(zhì)瘤中也被認(rèn)為是一種抗癌基因[14]。然而,在某些惡性腫瘤中,SIRT6被證實(shí)是一種促癌基因。在骨肉瘤中,SIRT6表達(dá)上調(diào)增加了腫瘤的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和死亡風(fēng)險(xiǎn),是骨肉瘤患者預(yù)后不良因素[15]。而在甲狀腺癌的研究也顯示,SIRT6上調(diào)與甲狀腺癌患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期差以及體外PTC細(xì)胞遷移和侵襲增強(qiáng)有關(guān)[16]。且SIRT6除了在不同腫瘤中發(fā)揮不同的作用以外,還可以在同一種腫瘤中發(fā)揮雙重作用。有研究表明,在結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和血液腫瘤中,SIRT6在腫瘤的不同發(fā)育階段或不同細(xì)胞系中發(fā)揮著相反的作用[11]。目前,SIRT6在非小細(xì)胞肺癌的研究比較廣泛,但在肺腺癌的研究比較少見(jiàn)。WANG J等[17]的研究表明,放療可促進(jìn)SIRT6蛋白介導(dǎo)的RBBP8脫乙酰化的發(fā)生,進(jìn)而提高吉非替尼的療效。由此可見(jiàn),SIRT6在肺腺癌中可能是一種抑癌基因,但是,SIRT6在肺腺癌的作用機(jī)制仍未明確。此外,SIRT6在諸多腫瘤中的研究顯示出相互矛盾的結(jié)果。因此,構(gòu)建SIRT6基因敲除的A549細(xì)胞系,對(duì)于進(jìn)一步探索SIRT6在肺腺癌的作用機(jī)制具有十分重要的意義。

CRISPR/Cas9是一種穩(wěn)定、高效、簡(jiǎn)單且廣泛使用的新型基因編輯技術(shù)。CRISPR/Cas9在2013年被成功應(yīng)用于真核生物和細(xì)胞之后[18-19],該技術(shù)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展,目前已被廣泛用于農(nóng)業(yè)[20]、生物材料[21]、醫(yī)學(xué)[22]等諸多領(lǐng)域。CRISPR/Cas9作為新興的基因編輯工具,具有操作簡(jiǎn)便、編輯高效、通用性廣等優(yōu)勢(shì),因而被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。有研究表明,CRISPR/Cas9 技術(shù)在惡性腫瘤[23]、心血管系統(tǒng)疾病[24]、免疫系統(tǒng)疾病[25]、遺傳性疾病[26]以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病[27]等臨床醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中取得快速的發(fā)展。尤其在腫瘤診斷和治療方面,CRISPR/Cas9 可以進(jìn)行腫瘤模型構(gòu)建、腫瘤演化機(jī)制研究、分子診斷、生物治療以及分子靶向藥物的研發(fā)與篩選,為腫瘤的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供新的技術(shù)保障[28]。毫無(wú)疑問(wèn),CRISPR/Cas9被證明是一種革命性的工具,在諸多領(lǐng)域的研究顯示出顯著的效果,但其也有自身的局限性。在本實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)CRISPR/Cas9技術(shù)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則,選擇了3個(gè)sgRNA進(jìn)行研究,但最終只有SIRT6-28符合后續(xù)的研究,因此該技術(shù)的基因編輯效率有待提高。而其他較為突出的問(wèn)題是脫靶效應(yīng)、脫氧核糖核酸損傷毒性和免疫毒性[29],相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和自身不斷的完善,CRISPR/Cas9技術(shù)的缺陷終將得到改進(jìn)。

本研究通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù),設(shè)計(jì)并篩選了針對(duì)SIRT6敲除的sgRNA,然后將sgRNA-SIRT6序列與載體鏈接,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒并包裝,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞中,篩選單克隆細(xì)胞進(jìn)行鑒定。目前鑒定細(xì)胞系基因成功敲除的主要方法有3種:①DNA測(cè)序結(jié)果是否存在基因突變;②Western Blot檢測(cè)蛋白是否表達(dá);③實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)檢測(cè)細(xì)胞mRNA是否表達(dá)。部分學(xué)者采用單一方法進(jìn)行驗(yàn)證基因敲除模型構(gòu)建是否成功[30],而更多學(xué)者選擇其中多種方法進(jìn)行聯(lián)合鑒定[31-32]。本研究使用了DNA測(cè)序和Western Blot檢測(cè)蛋白兩種方法聯(lián)合鑒定。測(cè)序結(jié)果表明PCR片段有明顯的基因突變,而Western Blot結(jié)果顯示敲除后的A549細(xì)胞內(nèi)無(wú)SIRT6蛋白表達(dá),證明敲除SIRT6基因的A549 穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功。

綜上所述,本研究成功構(gòu)建了sgRNA-SIRT6重組質(zhì)粒,同時(shí)成功敲除了人肺腺癌A549細(xì)胞系中的SIRT6基因,為深入研究SIRT6在肺腺癌的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。