緊密連接相關蛋白在變應性鼻炎小鼠模型中的表達研究

鄭少川,瞿申紅,張少杰,鐘自玲,張力行,程熹喬,莫麗萍,吳迪

(1. 右江民族醫(yī)學院,廣西 百色 533000;2. 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸科,廣西 南寧 530000;3. 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院病理科,廣西 南寧 530000)

變應性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是耳鼻咽喉科的常見疾病,影響全球10%～40%的人口,在世界范圍內(nèi)造成巨大的醫(yī)療負擔[1-2]。AR的發(fā)病機制涉及Th1/Th2細胞失衡[3]、炎癥細胞的激活和IgE所介導的免疫反應[4-5]。羧肽酶A3(carboxypeptidase A3,CPA3)是一種含鋅蛋白水解酶,由肥大細胞合成并存儲于分泌顆粒中,并隨肥大細胞脫顆粒而釋放至鼻腔黏膜[7]。多項研究支持CPA3參與了變應性氣道疾病的發(fā)生與發(fā)展[8-9]。呼吸上皮能為機體提供物理、功能和免疫屏障,使得機體免受外界有害物質(zhì)的傷害,緊密連接(tight junction,TJ)是消化道及呼吸道黏膜上皮的強細胞間連接[10],黏膜緊密連接的破壞是變應性疾病發(fā)生與發(fā)展的重要原因[11-12]。在本研究中,我們構建了卵清蛋白(ovalbumin,OVA)誘導的小鼠AR模型,通過常規(guī)病理、免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)和實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR ,RT-qPCR) 等技術來評估小鼠鼻黏膜炎癥程度及緊密連接相關蛋白的表達變化,并初步探究其與CPA3之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1實驗動物 6周齡雌性Balb/c小鼠28只,體重約為13～17 g ,購買于廣東維通利華實驗動物技術有限公司,并飼養(yǎng)在廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2主要試劑 見表1。

表1 實驗使用的主要試劑

1.3模型建立 將小鼠隨機分成Control組和AR組,基礎致敏階段:AR組小鼠于第1天、第8天、第15天腹腔注射25 μL OVA(1%)和25 μL氫氧化鋁混合液,激發(fā)階段:在第22天～第28天使用1% OVA 進行滴鼻激發(fā),1次/日,每側鼻孔15 μL ,Control組用等量的PBS替換OVA進行基礎致敏和激發(fā)。在最后一次滴鼻激發(fā)24 h后處死小鼠,收集小鼠血清和鼻黏膜組織待后續(xù)實驗。

1.4行為學觀察 最后1次經(jīng)鼻PBS或OVA激發(fā)后,使用盲法由兩名觀察者記錄小鼠的抓鼻及打噴嚏的次數(shù),每只小鼠觀察15 min。

1.5RT-qPCR檢測 體式顯微鏡下剝離小鼠鼻黏膜,運用傳統(tǒng)Trizol法提取鼻黏膜總RNA,使用MightyScript第一鏈cDNA合成Master Mix進行RNA反轉(zhuǎn)錄,使用2X SG Fast qPCR預混液(低Rox)進行基因擴增。相關引物序列,見表2。

表2 相關引物序列

1.6組織病理學 取小鼠鼻部,仔細剔除鼻骨周圍軟組織,隨后經(jīng)過脫鈣、固定、常規(guī)包埋和切片后,再進行PAS、HE、IHC及甲苯胺藍染色。

2 結果

2.1小鼠行為觀察 為了確定鼻腔癥狀的變化,觀察了最后一次滴鼻激發(fā)后小鼠的打噴嚏和抓鼻頻率,發(fā)現(xiàn)AR小鼠表現(xiàn)出明顯的打噴嚏和抓鼻頻率,與Control組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),見圖1。

注:A.打噴嚏次數(shù);B.抓鼻次數(shù)。***P<0.001。

2.2OVA的經(jīng)鼻激發(fā)誘導了鼻腔嗜酸性粒細胞浸潤和杯狀細胞增生 完整的纖毛有助于鼻腔分泌物的正常排出,與Control組相比,AR組小鼠鼻黏膜纖毛排列紊亂,部分黏膜出現(xiàn)纖毛缺失。通過ImageJ對鼻黏膜HE染色和PAS染色進行評估,結果顯示AR組小鼠鼻黏膜出現(xiàn)了明顯的嗜酸性粒細胞浸潤(見圖2A),杯狀細胞顯著增生、肥大(見圖2B),其中杯狀細胞主要在中鼻甲和鼻中隔中下部的黏膜表層,而嗜酸性粒細胞則彌散浸潤在鼻黏膜的固有層。

注:A.Control組和AR組的HE染色,箭頭所示為嗜酸性粒細胞;B.Control組和AR組的PAS染色,箭頭所示為杯狀細胞;C.每個隨機視野嗜酸性粒細胞計數(shù);D.每個隨機視野杯狀細胞計數(shù)。***P<0.001。

2.3小鼠鼻黏膜中Claudin-1、Claudin-4、JAM-A及ZO-1的表達 為了評估OVA誘導的鼻腔炎癥對鼻黏膜緊密連接及其相關蛋白的影響,評估了Claudin-1、Claudin-4、JAM-A及ZO-1的表達變化,與Control組相比,AR組鼻黏膜Claudin-1、Claudin-4 基因表達水平顯著下降(見圖3A、圖3B),且JAM-A的蛋白表達水平顯著低于Control組(見圖3C、圖3E),但并未觀察到ZO-1蛋白表達的顯著改變(見圖3D、圖3F)。

注: A和B分別為小鼠鼻黏膜Claudin-1、Claudin-4 相對基因表達;C和D分別為JAM-A和ZO-1的免疫組織化學染色(原始放大倍數(shù)400×);E和F分別為JAM-A和ZO-1的平均光密度值定量。 ***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05,ns :無意義。

2.4小鼠鼻黏膜肥大細胞浸潤及CPA3表達的變化 為了評估肥大細胞的浸潤情況,使用甲苯胺藍對鼻黏膜組織切片進行染色,發(fā)現(xiàn)AR組鼻腔黏膜固有層大量的肥大細胞浸潤(見圖4A),肥大細胞的數(shù)量明顯大于Control組(見圖4B),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。對鼻黏膜組織進行RT-qPCR檢測后發(fā)現(xiàn)AR組CPA3 mRNA表達顯著高于Control組(見圖4C)。

注:A.小鼠鼻黏膜甲苯胺藍染色,箭頭所示為肥大細胞(原始放大倍數(shù)400×);B.每個隨機視野肥大細胞計數(shù);C.鼻黏膜CPA3的相對表達量。***P<0.001,**P<0.01

3 討論

AR是一種常見的鼻黏膜過敏性疾病,癥狀包括鼻癢、鼻塞、流清涕和打噴嚏[13],影響到全球10%～40%的人口,而且通常會持續(xù)一生,嚴重影響患者的學習、工作和生活[14]。AR的發(fā)病是一個復雜的過程,研究表明Th1/Th2細胞失衡[13]、多種炎癥細胞的活化和IgE所介導的免疫反應均參與其中[4-5]。羧肽酶A3是一種含鋅蛋白水解酶,由肥大細胞合成并存儲于分泌顆粒中,并隨肥大細胞脫顆粒而釋放至鼻腔黏膜[7],多項研究支持CPA3參與了變應性氣道疾病的發(fā)生與發(fā)展[8-9],但具體機制尚未明確。有研究表明具有蛋白酶活性的日本雪松導致了鼻黏膜上皮屏障的破壞,并證明了重組蛋白酶抑制劑rhCystatin SN可以逆轉(zhuǎn)上皮屏障的損傷[15],因此CPA3的鼻黏膜釋放可能是上皮屏障損傷的重要原因之一。呼吸上皮提供物理、功能和免疫屏障,保護機體免受吸入環(huán)境顆粒的潛在傷害[10],當上皮屏障受到損害時,可能會激活針對外源性過敏原、微生物和污染物的免疫炎癥反應,反復的外源性刺激導致了鼻黏膜的慢性炎癥,而黏膜下炎癥本身將繼續(xù)維持上皮屏障的受損和開放狀態(tài),使得機體持續(xù)受到過敏原、污染物、微生物及其酶和毒素等的持續(xù)傷害,導致惡性循環(huán)[16]。TJ是消化道及呼吸道黏膜上皮的強細胞間連接,是細胞旁通透性的關鍵調(diào)控因子,在對吸入的病原體產(chǎn)生限速屏障方面至關重要[10]。TJ包括跨膜蛋白和胞內(nèi)蛋白,TJ跨膜蛋白主要包括Claudins、Occludin、junctional adhesion molecules (JAMs),負責在細胞間隙建立強連接。TJ細胞質(zhì)蛋白主要包括ZO-1、ZO-2、ZO-3、MUPP-1、PAR-3、PAR-6等,主要作用是作為與肌動蛋白細胞骨架連接的媒介[17]。本研究成功建立了OVA誘導的典型AR小鼠模型,模型組小鼠具有明顯的打噴嚏及抓鼻子等AR癥狀。有研究表明Th2型細胞因子會導致杯狀細胞的增生和黏液分泌的增加[15],通過對小鼠鼻黏膜進行HE和PAS染色,發(fā)現(xiàn)AR小鼠鼻黏膜大量嗜酸性粒細胞浸潤和杯狀細胞增生。為了探究OVA誘導的鼻腔炎癥對鼻黏膜CPA3及TJ相關蛋白的影響,本研究觀察了Claudin-1、Claudin-4、JAM-A和ZO-1的表達變化,發(fā)現(xiàn)AR組TJ跨膜蛋白Claudin-1、Claudin-4和JAM-A的表達下降,這證明了OVA誘導的鼻腔炎癥導致了TJ的破壞。但本研究并未發(fā)現(xiàn)TJ胞內(nèi)蛋白Z0-1表達與Control組有顯著性差異,這可能提示導致TJ破壞的因素來自上皮細胞外的鼻腔或黏膜固有層。本研究證實了AR小鼠鼻黏膜固有層肥大細胞數(shù)量的上升和CPA3 mRNA的高表達,其與TJ的破壞同時出現(xiàn)在AR小鼠的鼻黏膜,因此推測CPA3可能通過鼻黏膜TJ的破壞參與AR的發(fā)病,這一點還需要更進一步的研究來驗證。

總之,本研究成功建立了OVA誘導的AR小鼠模型,并證實了AR小鼠鼻黏膜上皮TJ的破壞和CPA3的高表達,預測CPA3可能是鼻黏膜TJ損傷的重要原因。這需要進一步的研究驗證。