益生菌的不同組合體外抗幽門螺桿菌作用的實(shí)驗(yàn)研究

管愛星,黃玉存,黃干榮,覃艷春,羅家錙,黃亮,黃衍強(qiáng),黃贊松,5

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣西 百色 533000;3. 廣西病原微生物耐藥防控科技創(chuàng)新合作基地,廣西 百色 533000;4. 廣西高校耐藥微生物感染防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 百色 533000;5. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,廣西 百色 533000)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是存在于人胃當(dāng)中的有害細(xì)菌,人群感染率約50%,是導(dǎo)致胃炎、胃潰瘍等消化疾病的主要病原微生物[1],同時(shí)也是胃癌的高危因素[2]。感染它后可按Correa提出的炎癌轉(zhuǎn)化模式(胃炎-萎縮-腸化生-癌前病變)導(dǎo)致胃癌的發(fā)生[3]。根除H.pylori能有效治療胃炎、胃潰瘍等消化道疾病,并且可以降低胃癌發(fā)病率、阻止癌前病變的進(jìn)展[4]。根除H.pylori治療方法主要是含抗生素的四聯(lián)療法[5],然而隨著抗生素的使用,其產(chǎn)生的耐藥逐漸升高,且指南推薦的10～14 d的抗生素治療,會(huì)造成腸道菌群失調(diào)等不良反應(yīng)[6- 7]。近年來發(fā)現(xiàn),根除H.pylori時(shí),添加益生菌能有效提高根除率、減輕腸道菌群失調(diào)等胃腸道不良反應(yīng)[8]。有研究表明,益生菌及其代謝產(chǎn)物也具有一定的抗H.pylori效果[9-11],但具體的抑菌效果不明確,特別是聯(lián)合抑菌的效果,什么組合抑菌最佳或者抑菌圈的直徑是多少等不清楚。因此,本研究先檢測單個(gè)益生菌的抑菌效果,再探討不同組合的抑菌效果,以尋找最佳的組合方式。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品及試劑 甲硝唑(上海麥克林生化科技股份有限公司)、阿莫西林(先聲藥業(yè)集團(tuán)有限公司)、左氧氟沙星(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司)、克拉霉素(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司)、營養(yǎng)肉湯(杭州百思生物技術(shù)有限公司BS1002)、營養(yǎng)瓊脂(杭州百思生物技術(shù)有限公司BS1101)、 MRS肉湯(青島海博生物技術(shù)有限公司,貨號HB0384-1)、MRS瓊脂(青島海博生物技術(shù)有限公司,貨號HB0384-5)、Brain Heart infusion(BHI)培養(yǎng)基(OXOID,貨號CM1135B)、Columbia blood Agar base(培養(yǎng)基(OXOID,lot2179850)、TPY瓊脂(青島海博生物技術(shù)有限公司,貨號HB0397)、小牛血清[平睿生物科技(北京)有限公司]。

1.1.2菌株H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株26695及H.pylori耐藥菌株159、286由右江民族醫(yī)學(xué)院耐藥微生物感染防治研究中心提供;益生菌(枯草芽孢桿菌、彎曲乳酸桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌、長雙歧桿菌)來源于右江民族醫(yī)學(xué)院耐藥微生物感染防治研究中心。

1.1.3主要儀器 三氣培養(yǎng)箱(Binder model CB16

0,Germany)、恒溫震蕩培養(yǎng)箱(上海智城分析儀器制造有限公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)、多功能酶標(biāo)儀(BioTek,America)、離心機(jī)(湘南湘儀有限公司)、紫外分光光度儀(HITACHI,Japan)、超低溫冰箱(海爾DW-86L388A),電冰箱(海爾BCD-601WDPR)、生物安全柜(山東博科科學(xué)儀器有限公司)、生物顯微鏡(廣州明美光電技術(shù)有限公司)、全立式高壓滅菌器(GR60DP)、電熱古風(fēng)干燥箱(DHT-G1358)、精細(xì)天平(OHAUS)、移液槍(艾本德)等。

1.2方法

1.2.1配制培養(yǎng)基 稱取MRS瓊脂培養(yǎng)基33.1 g溶于500 mL蒸餾水中,營養(yǎng)瓊脂16.5 g溶于500 mL蒸餾水中,高壓滅菌鍋121 ℃滅菌30 min,冷卻至50 ℃傾倒100 mm平板; 稱取哥倫比亞培養(yǎng)基13.3 g溶于270 mL蒸餾水中,高壓滅菌鍋121 ℃滅菌30 min,冷卻至50 ℃,再加入占總體積10%的小牛血清,輕搖混勻后傾倒平板,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)菌培養(yǎng) 從-80 ℃超低溫冰箱取出H.pylori菌株,待其融化后離心,取沉淀涂于的哥倫比亞培養(yǎng)基上,置于三氣培養(yǎng)箱(85%氮?dú)狻?%氧氣、10%二氧化碳)37 ℃ 恒溫培養(yǎng)3～4 d。從-80 ℃超低溫冰箱取出彎曲乳酸桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌、長雙歧桿菌、枯草芽孢桿菌,待其自然融化,離心,取沉淀分別涂于MRS瓊脂、哥倫比亞培養(yǎng)基、TPY固體培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d。

1.2.3菌懸液的制備 取少許對數(shù)生長期的H.pylori菌落,加入含10%血清的BHI培養(yǎng)基中,1 mL移液器吹打混勻,三氣培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃震蕩培養(yǎng)2～3 d,獲得H.pylori菌懸液;取少許處于對數(shù)期的彎曲乳酸桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌、長雙歧桿菌、枯草芽孢桿菌,分別放入MRS培養(yǎng)基、TPY培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)12～48 h,獲得益生菌菌懸液。

1.2.4H.pylori藥敏檢測 將抗菌藥物阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星分別配成1 mg/mL;將細(xì)菌96孔板第一孔先加培養(yǎng)基173.6 μL,再加6.4 μL抗菌藥物,倍比稀釋至第8孔;取已準(zhǔn)備的H.pylori菌懸液,調(diào)整度OD600為0.3(1.0×108CFU/mL),稀釋10倍,為1.0×107CFU/mL備用;再取稀釋的菌懸液10 μL加至第1～8孔,同時(shí)設(shè)陽性和陰性對照孔,置于三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h,以完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度作為MIC,并根據(jù)中國抗生素應(yīng)用指南,判定H.pylori對抗生素敏感(S)或耐藥(R)。

1.2.5益生菌對H.pylori抑制實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1H.pylori鋪板 如1.2.4所述,將H.pylori菌懸液稀釋為1.0×106CFU/mL;取100 μL加入含10%小牛血清的哥倫比亞培養(yǎng)基上,無菌接種環(huán)密涂,再置于三氣培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)3～4 h。

1.2.5.2單種益生菌抑制H.pylori將枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、嗜酸乳桿菌、彎曲乳桿菌、長雙歧桿菌,分調(diào)整菌液濃度OD600為0.3(1.0×108CFU/mL),稀釋1 000倍,為1.0×105CFU/mL,備用;分別取準(zhǔn)備好的枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、嗜酸乳桿菌、彎曲乳桿菌、長雙歧桿菌菌懸液2 μL,滴加于經(jīng)過培養(yǎng)3～4 h后的哥倫比亞培養(yǎng)基上,小心平移,重新放入三氣培養(yǎng)箱內(nèi),37 ℃共培養(yǎng)2～3 d。測量并記錄益生菌對H.pylori的抑菌圈的直徑。

1.2.5.3兩種益生菌組合抑制H.pylori將備好的1.0×105CFU/mL枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、彎曲乳桿菌、嗜酸乳桿菌,以枯草芽孢桿菌+糞腸球菌、枯草芽孢桿菌+嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌+彎曲乳酸桿菌、糞腸球菌+彎曲乳桿菌、糞腸球菌+嗜酸乳桿菌、彎曲乳酸桿菌+嗜酸乳酸桿菌菌種的6種組合,并按20∶1、10∶1、1∶1、1∶10、1∶20比例的菌量配成組合益生菌液,充分混勻成混懸液,取2 μL混懸液滴加于涂有H.pylori的哥倫比亞培養(yǎng)基上,小心平移,重新放入三氣培養(yǎng)箱內(nèi),37 ℃培養(yǎng)2～3 d,測量并記錄兩種益生菌聯(lián)合后對H.pylori的抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1H.pylori菌株藥敏檢測結(jié)果 根據(jù)CLSI藥敏實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(2022),H.pylori菌株26695為標(biāo)準(zhǔn)菌株,其對阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星的藥敏結(jié)果均敏感;菌株159、286為多重耐藥菌株,對阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星中的兩種及兩種以上的抗生素耐藥。見表1。

表1 H.pylori菌株對抗生素的MIC 單位:μg/mL

2.2單獨(dú)使用益生菌對H.pylori的抗菌作用 檢驗(yàn)單種的益生菌抑制H.pylori生長時(shí),對于標(biāo)準(zhǔn)菌株26695,枯草芽孢桿菌的抑制效果最好,糞腸球菌次之(見表2、圖1),嗜酸乳桿菌和彎曲乳桿菌的抑菌效果相當(dāng)(P>0.05);對于耐藥菌株(159和286),枯草芽孢桿菌的抑菌效果也是最佳(見表2、圖1),嗜酸乳桿菌和彎曲乳桿菌的抑菌效果相當(dāng)(P>0.05),長雙歧桿菌和蠟樣芽孢桿菌與H.pylori共培養(yǎng)時(shí),未見其產(chǎn)生抑菌效果。

表2 益生菌單獨(dú)對H.pylori的抑菌圈直徑 單位:mm

HP26695標(biāo)準(zhǔn)株 HP286耐藥株

2.3單獨(dú)或者聯(lián)合使用兩種益生菌對H.pylori的抑菌效果 如圖2所示,枯草芽孢桿菌+糞腸球菌1∶1混合比單獨(dú)的枯草芽孢桿菌抑制H.pylori效果較好。如表3所示,枯草芽孢桿菌+糞腸球菌、枯草芽孢桿菌+嗜酸乳桿菌1∶1混合的抑制H.pylori效果較好。

注:A.枯草芽孢桿菌+糞腸球菌;B.糞腸球菌+彎曲

表3 聯(lián)合益生菌對H.pylori的抑制作用

2.4不同比例的枯草芽孢桿菌+糞腸球菌聯(lián)合抑制H.pylori效果 對于耐藥菌株159、286,與枯草芽孢桿菌∶糞腸球菌=1∶1比較,枯草芽孢桿菌∶糞腸球菌=20∶1、枯草芽孢桿菌∶糞腸球菌=10∶1抑菌圈直徑增大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與枯草芽孢桿菌∶糞腸球菌=1∶10比較,枯草芽孢桿菌∶糞腸球菌=20∶1、枯草芽孢桿菌∶糞腸球菌=10∶1抑菌圈直徑增大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與枯草芽孢桿菌∶糞腸球菌=1∶20比較,枯草芽孢桿菌∶糞腸球菌=20∶1、枯草芽孢桿菌∶糞腸球菌=10∶1抑菌圈直徑增大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但是枯草芽孢桿菌∶糞腸球菌=20∶1與枯草芽孢桿菌∶糞腸球菌=10∶1比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 枯草芽孢桿菌+糞腸球菌不同比例對H.pylori的抑菌圈直徑 (n=3,單位:mm)

2.5不同比例的枯草芽孢桿菌+嗜酸乳桿菌聯(lián)合抑制H.pylori的效果 對于耐藥菌株159、286,與枯草芽孢桿菌∶嗜酸乳桿菌=1∶20比較,枯草芽孢桿菌∶嗜酸乳桿菌=20∶1、枯草芽孢桿菌∶嗜酸乳桿菌=10∶1、枯草芽孢桿菌∶嗜酸乳桿菌=1∶1的抑菌圈直徑明顯增大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但是枯草芽孢桿菌∶嗜酸乳桿菌=20∶1、枯草芽孢桿菌∶嗜酸乳桿菌=10∶1、枯草芽孢桿菌∶嗜酸乳桿菌=1∶1之間的抑菌圈直徑大小差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5、見圖3。

表5 枯草芽孢桿菌+嗜酸乳桿菌對H.pylori抑菌圈直徑 (n=3,單位:mm)

注:A.枯草芽孢桿菌∶嗜酸乳桿菌=20∶1;B.枯草芽孢桿菌∶嗜酸乳桿菌=10∶1;C.枯草芽孢桿菌∶嗜酸乳桿菌=1∶1;D.枯草芽孢桿菌∶嗜酸乳桿菌=1∶10;E.枯草芽孢桿菌∶嗜酸乳桿菌=20∶1;F.枯草芽孢桿菌;G.嗜酸乳桿菌。

3 討論

H.pylori是消化系統(tǒng)的致病菌,自1983年Marshall等首次從胃炎患者中分離培養(yǎng)成功后,就開始用抗生素根除治療H.pylori[12]。但隨著抗生素廣泛應(yīng)用,H.pylori的耐藥性逐漸增加,開發(fā)有效的抗H.pylori藥物是亟待解決的問題[13]。益生菌作為對人體有益的細(xì)菌,能通過細(xì)菌的相互競爭、分泌抗菌物質(zhì)、阻止病原菌黏附等多種途徑發(fā)揮抗菌效果[14],是解決H.pylori耐藥的有效途徑。相關(guān)研究表明,乳酸菌分泌的抗菌成分在體外發(fā)揮抗H.pylori效果[15],另外乳桿菌還能通過共聚集發(fā)揮抗H.pylori作用[16],具有替代抗生素治療H.pylori的潛能。研究比較深入的還有羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等,都具有一定的抗H.pylori作用,其抗H.pylori作用的機(jī)制與其能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)有關(guān)[17-18]。另外,雖然有研究表明雙歧桿菌也具有一定的協(xié)同抗H.pylori作用[19],但本研究通過長雙歧桿菌滴加于涂有H.pylori的哥倫比亞培養(yǎng)基內(nèi),放置三氣培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng),并未見有抗菌效果,原因可能是微氧環(huán)境下長雙歧桿菌不能生長,無抗菌代謝物質(zhì)產(chǎn)生。本研究在比較單種益生菌對H.pylori的抗菌效果時(shí)發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌具有良好的抗菌效果?？紤]到菌群構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng),本研究首次用兩種益生菌的聯(lián)合,檢測包含有枯草芽孢桿菌的益生菌聯(lián)合對H.pylori抗菌效果。發(fā)現(xiàn)兩種益生菌的組合比單一使用枯草芽孢桿菌的抑菌效果更明顯,這可能與細(xì)菌之間的相互作用及枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抗菌代謝產(chǎn)物有關(guān)。在選擇兩種益生菌組合時(shí),枯草芽孢桿菌+嗜酸乳桿菌的組合與枯草芽孢桿菌+糞腸球菌的組合對H.pylori耐藥菌種的抑制效果相當(dāng),但前者對H.pylori敏感菌株的抑菌效果更好,具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn):①單種益生菌中,枯草芽孢桿菌對敏感或耐藥H.pylori均具有較好抑制作用,聯(lián)合益生菌的抑菌效果優(yōu)于單獨(dú)使用;②枯草芽孢桿菌+嗜酸乳桿菌聯(lián)合時(shí),對H.pylori抗菌效果更佳,尤其是對臨床耐藥菌株。本研究為益生菌治療H.pylori感染提供了新的思路,尤其是為益生菌對H.pylori耐藥的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。