速康寧滴眼液和速康寧滴鼻液的生物檢查方法適用性研究▲

雷 宇 秦銀燕 何成章 陸 華 陳貞伶

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,廣西南寧市 530021)

生物檢查方法是考察藥物制劑療效及安全性的一種重要方法?！吨腥A人民共和國(guó)藥典(2015年版)》[1]明確要求對(duì)藥品的微生物檢查方法需要進(jìn)行適用性試驗(yàn),使檢查結(jié)果更具可比性,接近于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。速康寧滴眼液和速康寧滴鼻液是廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院自行生產(chǎn)的醫(yī)院制劑,多年的臨床應(yīng)用實(shí)踐表明這兩種藥物的安全性好,療效顯著。速康寧滴眼液和速康寧滴鼻液的處方成分相同,主要成分包含硫酸慶大霉素、地塞米松磷酸鈉等。由于上述制劑本身具有很強(qiáng)的抑菌作用,建立適宜的生物學(xué)檢查方法以保證制劑的藥品質(zhì)量,具有重要意義。本研究參照《中華人民共和國(guó)藥典(2015年版)》[1]及相關(guān)文獻(xiàn)[2]的相關(guān)要求進(jìn)行了系列實(shí)驗(yàn)研究,初步探討速康寧滴眼液和速康寧滴鼻液的生物學(xué)檢查方法,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材 料

1.1 儀器 BSC-1600ⅡA2型生物潔凈安全柜、SW-CJ-ICU型凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),LDZF-50L-Ⅱ型立式高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠),DHP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱、MJ-250-Ⅱ型霉菌恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),101-2AS型鼓風(fēng)干燥箱(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司),HTY-601型智能集菌儀、PY220型集菌培養(yǎng)器(杭州泰林生物技術(shù)股份有限公司)。

1.2 供試品 速康寧滴眼液(規(guī)格:10 mL/支;批號(hào):20190722、20190723、20190724)、速康寧滴鼻液(規(guī)格:10 mL/支;批號(hào):20190717、20190718、20190719)均由廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)用菌株 金黃色葡萄球菌[菌號(hào):CMCC(B)26003;批號(hào):E0009B;有效期至2021-01-28)]、銅綠假單胞菌 [菌號(hào):CMCC(B)10104;批號(hào):E0042B;有效期至2021-01-01)]、大腸埃希菌[菌號(hào):CMCC(B)44102;批號(hào):E0019B;有效期至2021-04-18)]、枯草芽孢桿菌[菌號(hào):CMCC(B)63501;批號(hào):E0020B;有效期至2021-04-18]、白色念珠菌[菌號(hào):CMCC(F)98001;批號(hào):E0047B;有效期至2021-07-22]、黑曲霉菌[菌號(hào):CMCC(F)98003;批號(hào):E0054B;有效期至2021-09-21]均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;生孢梭菌[菌號(hào):CMCC(B)64941,批號(hào):190726,有效期至2020-07-25]購(gòu)自北京三藥科技開發(fā)公司。

1.4 培養(yǎng)基和試劑 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào):180524)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):180820)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):180719)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號(hào):180731)、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(批號(hào):180621)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號(hào):180801)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):180412)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):180327)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):190402)、無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH為7.0,批號(hào):181213)均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;含0.05%(體積比)聚山梨酯80的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH為7.0)、0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液、含0.1%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液均為廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室自配。以上培養(yǎng)基均符合《中華人民共和國(guó)藥典(2015年版)》[1]中的適用性試驗(yàn)相關(guān)規(guī)定,可用于無(wú)菌檢查和微生物限度檢查。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌懸液的制備

2.1.1 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌菌懸液的制備:將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物分別接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取上述培養(yǎng)物1 mL加到9 mL含0.05%(體積比)聚山梨酯80的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,按10倍遞減稀釋1×105至1×107倍,制成菌落數(shù)在50～100 CFU/mL的菌懸液。

2.1.2 生孢梭菌菌懸液的制備:將生孢梭菌新鮮培養(yǎng)物接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基,在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取上述培養(yǎng)物1 mL加到9 mL含0.05%(體積比)聚山梨酯80的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,按10倍遞減稀釋1×105至1×107倍,制成菌落數(shù)在50～100 CFU/mL的菌懸液。

2.1.3 白色念珠菌菌懸液的制備:將白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基,在(23±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,取上述培養(yǎng)物1 mL加到9 mL含0.05%(體積比)聚山梨酯80的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,按10倍遞減稀釋1×105至1×107倍,制成菌落數(shù)在50～100 CFU/mL之間的菌懸液。

2.1.4 黑曲霉菌菌懸液的制備:將黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基,在(23±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,取上述培養(yǎng)物加到3～5 mL含0.05%(體積比)聚山梨酯80的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,用無(wú)菌玻璃棒或接種環(huán)輕輕將孢子洗脫,然后用管口帶有無(wú)菌薄紗布的吸管吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi),取上述孢子懸液1 mL加到9 mL含0.05%(體積比)聚山梨酯80的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,按10倍遞減稀釋1×10-2至1×10-5倍,制成菌落數(shù)在50～100 CFU/mL之間的菌懸液。

2.2 菌懸液計(jì)數(shù) 取2.1中的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的菌懸液1 mL分別注入90 mm的無(wú)菌平皿,再注入15～20 mL不超過(guò)45 ℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基至培養(yǎng)皿,迅速混勻,每種實(shí)驗(yàn)菌平行制備2皿。在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。取2.1中的生孢梭菌菌懸液1 mL注入含30 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的試管,平行制備2管,在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。取2.1中的白色念珠菌菌懸液、黑曲霉菌菌懸液各1 mL注入含18 mL 45 ℃沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿,每種實(shí)驗(yàn)菌平行制備2皿,在(23±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)菌的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

2.3 速康寧滴眼液無(wú)菌檢查方法適用性試驗(yàn)及結(jié)果

2.3.1 薄膜過(guò)濾法沖洗操作步驟:以0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液和含0.1%(體積比)聚山梨酯80的 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為沖洗劑。采用智能集菌儀和集菌培養(yǎng)器進(jìn)行采樣,每膜最大載樣量為50 mL。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典(2015年版)》[1]相關(guān)規(guī)定,以大腸埃希菌、生孢梭菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌作為實(shí)驗(yàn)菌,各實(shí)驗(yàn)菌逐一進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(1)第1次預(yù)實(shí)驗(yàn)。以0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,每次沖洗量為100 mL,每膜沖洗3次,共300 mL。按規(guī)定觀察至第5天時(shí),供試品陽(yáng)性組的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌管的溶液仍澄清,未見目標(biāo)菌株生長(zhǎng),表明用上述方法仍不能消除供試品對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的干擾,因此,篩選出金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為敏感菌進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。(2)第2次預(yù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)第1次預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為敏感菌,操作同“第1次預(yù)實(shí)驗(yàn)”,以0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為沖洗液,分別以400 mL、500 mL作為總沖洗量,依次進(jìn)行沖洗,每次每膜沖洗量為100 mL。每膜總沖洗量為400 mL時(shí),按規(guī)定觀察至第5天,供試品陽(yáng)性組仍未見2種敏感菌生長(zhǎng)。每膜總沖洗量為500 mL時(shí),供試品陽(yáng)性組的金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)至第4天時(shí),可見微弱生長(zhǎng),按規(guī)定觀察至第5天時(shí)可見供試品陽(yáng)性組的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)良好,但枯草芽孢桿菌管溶液仍澄清,仍未見目標(biāo)菌生長(zhǎng),因此,篩選出枯草芽孢桿菌作為敏感菌進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。(3)第3次預(yù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)第2次預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步篩選出枯草芽孢桿菌作為敏感菌,以含0.1%(體積比)聚山梨酯80的 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,分別以300 mL、400 mL、500 mL作為總沖洗量,依次進(jìn)行沖洗,每次每膜沖洗量為100 mL。每膜總沖洗量為500 mL時(shí),按規(guī)定觀察至第5天時(shí),供試品陽(yáng)性組試管渾濁,枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)良好。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.3.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)分組:(1)供試品陽(yáng)性組。取30支速康寧滴眼液作為供試品,使用兩套無(wú)菌集菌培養(yǎng)器吸取至濾筒內(nèi),每套培養(yǎng)器濾過(guò)15支速康寧滴眼液,按薄膜過(guò)濾法進(jìn)行過(guò)濾。按2.3.1方法逐一進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),每次預(yù)實(shí)驗(yàn)中的最后一次沖洗劑中加入1 mL 50～100 CFU/mL的實(shí)驗(yàn)菌菌懸液,過(guò)濾結(jié)束后,在接種大腸埃希菌、生孢梭菌、金黃色葡萄球菌的濾筒內(nèi)加入100 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基,將其置于(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在接種枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的濾筒內(nèi)加入100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,將其置于(23±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間均為5 d,每隔24 h觀察1次。(2)沖洗劑陽(yáng)性組。取當(dāng)次實(shí)驗(yàn)用的沖洗劑替代供試品,按“供試品陽(yáng)性組”同法操作。(3)陽(yáng)性組。取兩套無(wú)菌集菌培養(yǎng)器,不濾過(guò)供試品或沖洗劑。在其中一套無(wú)菌集菌培養(yǎng)器中直接加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基100 mL,分別接種1 mL 50～100 CFU/mL的大腸埃希菌、生孢梭菌、金黃色葡萄球菌的菌懸液至濾筒內(nèi);另一套直接加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL,分別接種1 mL 50～100 CFU/mL的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌懸液至濾筒內(nèi)。(4)供試品本底菌組。按“供試品陽(yáng)性組”同法操作,但取當(dāng)次實(shí)驗(yàn)用的沖洗劑替代菌懸液。(5)陰性組。操作同“供試品本底菌組”,但取當(dāng)次實(shí)驗(yàn)用的沖洗劑替代供試品。

2.3.3 結(jié)果判斷:在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),供試品陽(yáng)性組、陽(yáng)性組、沖洗劑陽(yáng)性組溶液均出現(xiàn)渾濁,且出現(xiàn)渾濁時(shí)間相近,供試品本底菌組、陰性組溶液均澄清,則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合規(guī)定。若陰性組溶液渾濁且確認(rèn)有菌生長(zhǎng),則認(rèn)為實(shí)驗(yàn)無(wú)效[1]。本實(shí)驗(yàn)用6株規(guī)定實(shí)驗(yàn)菌對(duì)供試品逐一進(jìn)行加菌實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,以0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,總沖洗量為300 mL時(shí),以大腸埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌作為實(shí)驗(yàn)菌的供試品陽(yáng)性組、陽(yáng)性組、沖洗劑陽(yáng)性組的溶液均出現(xiàn)渾濁,供試品本底菌組、陰性組溶液均澄清,說(shuō)明對(duì)以上實(shí)驗(yàn)菌株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合規(guī)定,但金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符合規(guī)定。因此,第2次預(yù)實(shí)驗(yàn)以金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為敏感菌,并將總沖洗量加到500 mL,結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合規(guī)定,而枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍不符合規(guī)定。第3次預(yù)實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌作為敏感菌,用含0.1%(體積比)聚山梨酯80的 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,每膜總沖洗量為500 mL時(shí)結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合規(guī)定,見表2。

表2 速康寧滴眼液薄膜過(guò)濾法預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們對(duì)3個(gè)不同批次(20190722、20190723、20190724)的速康寧滴眼液供試品進(jìn)行適用性驗(yàn)證,其結(jié)果與預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全一致,提示該方法重復(fù)性好,可作為速康寧滴眼液無(wú)菌檢查方法。

2.4 速康寧滴鼻液微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)及結(jié)果

2.4.1 傾注平皿法預(yù)實(shí)驗(yàn)(1 mL/皿):(1)供試液的制備。① 取供試品10 mL,加入無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至90 mL,制得①液(1 ∶10供試液);②?、僖?0 mL,加入無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液80 mL,制得②液(1 ∶20供試液);③取①液50 mL,加入無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液50 mL,制得③液(1 ∶50供試液)。(2)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。① 供試品陽(yáng)性組。取7個(gè)實(shí)驗(yàn)管,每管加入供試液9.9 mL。其中,5管分別加入0.1 mL(<104CFU/mL)的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌懸液,混勻,取1 mL混合液注入平皿(平行制備2皿),再向平皿中注入15～20 mL溫度不超過(guò)40 ℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,混勻,凝固后倒置,放于(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。另2管分別加入0.1 mL(<104CFU/mL)的白色念珠菌、黑曲霉菌的菌懸液,混勻,取1 mL混合液注入1個(gè)平皿,平行制備2皿,再向平皿中注入15～20 mL溫度不超過(guò)40 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,混勻,凝固后倒置,放于(23±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d。② 陽(yáng)性組。取無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液,其他步驟同“供試品陽(yáng)性組”。③ 供試品本底菌組。取無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代菌懸液,其他步驟同“供試品陽(yáng)性組”。④ 陰性組。取無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液,其他步驟同“供試品本底菌組”。第1次預(yù)實(shí)驗(yàn)中,分別取供試品原液、① 液作為供試液,以金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌5種實(shí)驗(yàn)菌作為需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)的代表菌,以白色念珠菌、黑曲霉菌2種實(shí)驗(yàn)菌作為霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的代表菌,各實(shí)驗(yàn)菌逐一進(jìn)行微生物回收實(shí)驗(yàn)。第2次預(yù)試驗(yàn)中,分別?、谝?、③液作為供試液,根據(jù)第1次實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌作為敏感菌進(jìn)一步行加菌回收實(shí)驗(yàn)。(3)結(jié)果判斷[6]。各實(shí)驗(yàn)菌菌數(shù)回收率均在50%～200%范圍內(nèi),提示所采用的方法適用于該制劑的實(shí)驗(yàn)菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢查。若陰性組有菌生長(zhǎng),則認(rèn)為實(shí)驗(yàn)無(wú)效。實(shí)驗(yàn)菌菌數(shù)回收率=(供試品陽(yáng)性組平均菌落數(shù)-供試品本底菌組平均菌落數(shù))/陽(yáng)性組平均菌落數(shù)×100%。本研究結(jié)果提示,采用傾注平皿法(1 mL/皿),把供試品稀釋成1 ∶50的供試液對(duì)需氧菌總數(shù)項(xiàng)進(jìn)行加菌回收實(shí)驗(yàn),3株敏感實(shí)驗(yàn)菌(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)的菌數(shù)回收率均>50%,該方法可作為該制劑的需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)的檢查方法,但由于供試品的稀釋比例較大,本底菌同時(shí)也會(huì)被稀釋,存在不被檢出的風(fēng)險(xiǎn),不建議采用此方法檢測(cè)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌。另使用1 ∶10供試液進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù),白色念珠菌、黑曲霉菌的菌數(shù)回收率均>50%,故該方法可作為霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的檢查方法。見表3。

表3 速康寧滴鼻液傾注平皿法預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 薄膜過(guò)濾法預(yù)實(shí)驗(yàn):根據(jù)2.4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用傾注平皿法檢測(cè)方法時(shí),存在需氧菌不被檢出的風(fēng)險(xiǎn),因此采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)。用①液作為供試液,每膜過(guò)濾供試液10 mL,以篩選出來(lái)的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌作為敏感菌,以0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或含0.1%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,對(duì)各敏感菌逐一進(jìn)行微生物回收實(shí)驗(yàn),其中每種沖洗劑均分別以400 mL、500 mL作為總沖洗量,依次沖洗濾膜,每次100 mL。分組及操作步驟同速康寧滴眼液的薄膜過(guò)濾法。結(jié)果顯示,以0.9%無(wú)菌氯化鈉作為沖洗劑,每膜沖洗量加至500 mL時(shí),銅綠假單胞菌回收率仍<50%。因此,改用含0.1%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,每膜沖洗量加至500 mL時(shí),結(jié)果顯示銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌數(shù)回收率均>50%,見表4。

表4 速康寧滴鼻液薄膜過(guò)濾法預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 速康寧滴鼻液微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)及結(jié)果:為檢驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)方法的可行性,本研究取3個(gè)批次的速康寧滴鼻液(20190717、20190718、20190719),采用薄膜過(guò)濾法,用含0.1%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,每膜沖洗總量為500 mL,以金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌作為代表菌,對(duì)需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢查方法進(jìn)行適用性試驗(yàn);采用傾注平皿法(1 mL/皿),取1 ∶10供試液,以白色念珠菌、黑曲霉菌作為代表菌,對(duì)霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢查方法進(jìn)行適用性試驗(yàn)。結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)菌回收率均在50%～200%,與預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,表明該檢查方法的重復(fù)性好,驗(yàn)證方法可靠。見表5、表6。

表5 3個(gè)批次速康寧滴鼻液薄膜過(guò)濾法適用性試驗(yàn)結(jié)果

表6 3個(gè)批次速康寧滴鼻液傾注平皿法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 速康寧滴鼻液控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)及結(jié)果 根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典(2015年版)》[1]相關(guān)規(guī)定,鼻用制劑對(duì)控制菌的要求為每1 g、1 mL、10 cm2的供試品不得檢出大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。速康寧滴鼻液的控制菌檢查方法主要用于在符合上述規(guī)定的條件下,檢查本供試品中是否存在大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。 因此,對(duì)速康寧滴鼻液的控制菌檢查方法進(jìn)行適用性試驗(yàn),以達(dá)到去除供試品的抑菌成分對(duì)實(shí)驗(yàn)菌干擾的目的,確認(rèn)所選用的方法是否適用于速康寧滴鼻液的控制菌檢查。

2.5.1 金黃色葡萄球菌:(1)供試品陽(yáng)性組。① 直接接種法。取2.4.1制備的①液(1 ∶10供試液)10 mL和菌落數(shù)為50～100 CFU/mL的金黃色葡萄球菌的菌懸液1 mL,分別接種至100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。② 薄膜過(guò)濾法。取2.4.1制備的①液(1 ∶10供試液)10 mL,以含0.1%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,按2.3.1中有關(guān)薄膜過(guò)濾法的操作方法,分別以400 mL、500 mL作為總沖洗量,依次進(jìn)行沖洗,每膜每次沖洗100 mL,過(guò)濾結(jié)束后,用無(wú)菌鑷子將濾膜取出,分別接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。(2)陽(yáng)性對(duì)照組。用無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液,其余操作同供試品陽(yáng)性組。(3)供試品本底菌組:用無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌懸液,其余操作同供試品陽(yáng)性組。(4)陰性組:用無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液、菌懸液,其余操作同供試品陽(yáng)性組。(5)選擇與分離培養(yǎng)。取上述各組的液體培養(yǎng)物,接種至含甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上,再在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。(6)結(jié)果判斷。在含甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上,如果沒有符合金黃色葡萄球菌形態(tài)特征的菌落生長(zhǎng),則判定為未檢出,反之則判定為檢出。

2.5.2 銅綠假單胞菌:(1)分組。用銅綠假單胞菌替代2.5.1中的金黃色葡萄球菌,分組和操作同2.5.1。(2)選擇與分離培養(yǎng)。取各組的液體培養(yǎng)物,劃線于含溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上,再在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。(3)氧化酶試驗(yàn)。將無(wú)菌的濾紙片放在平皿上,用無(wú)菌玻璃棒在上述平板蘸取生長(zhǎng)的菌落涂于紙片上,再滴加2滴新配制的1%二鹽酸N,N-二甲基對(duì)苯二胺試液,若在30 s內(nèi)培養(yǎng)物變成粉紅色并且逐漸變紫紅色,則判定為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性,反之則為陰性。(4)結(jié)果判斷。在含溴化十六烷基二甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上,如果沒有符合銅綠假單胞菌形態(tài)特征的菌落生長(zhǎng),則判定為未檢出,反之則判定為檢出。

2.5.3 大腸埃希菌:(1)分組。用大腸埃希菌替代2.5.1中的金黃色葡萄球菌,分組和操作同2.5.1。(2)選擇與分離培養(yǎng)。取各組的液體培養(yǎng)物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基,在(43±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取麥康凱液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物劃線于含麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板,在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。(3)結(jié)果判斷。在含麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上,如果沒有符合大腸埃希菌形態(tài)特征的菌落生長(zhǎng),則判定為未檢出,反之則判定為檢出。

2.5.4 速康寧滴鼻液控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果:第1次預(yù)實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)法(直接接種法),用金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌作為實(shí)驗(yàn)菌,按2.5.1、2.5.2、2.5.3進(jìn)行操作,對(duì)各實(shí)驗(yàn)菌逐一進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,在接種至100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL體積的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,陽(yáng)性組均檢出3種實(shí)驗(yàn)菌株,陰性組均無(wú)菌生長(zhǎng),供試品陽(yáng)性組均未檢出3種實(shí)驗(yàn)菌。見表7。第2次預(yù)實(shí)驗(yàn)采用薄膜過(guò)濾法,實(shí)驗(yàn)分組及實(shí)驗(yàn)菌同第1次預(yù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,每膜總沖洗量為400 mL,供試品陽(yáng)性組的3種實(shí)驗(yàn)菌均仍未見檢出;每膜總沖洗量為500 mL,供試品陽(yáng)性組均能檢出3種實(shí)驗(yàn)菌株。另取3個(gè)批次(20190717、20190718、20190719)速康寧滴鼻液樣品按上述方法進(jìn)行控制菌檢查方法適用性試驗(yàn),結(jié)果顯示,3個(gè)批次供試品陽(yáng)性組均能檢出相應(yīng)的目標(biāo)菌,說(shuō)明驗(yàn)證方法可靠。

表7 速康寧滴鼻液控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

與2010年版的《中華人民共和國(guó)藥典》相比,2015年版的《中華人民共和國(guó)藥典》生物檢查法在檢查方法和指導(dǎo)原則上均有較大的修訂,變更內(nèi)容涵蓋所用培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)用菌、加菌方式及判定標(biāo)準(zhǔn)等[1-2]。因此,原有的生物檢查法已不能滿足新版藥典的檢驗(yàn)要求。本研究根據(jù)新版藥典的要求,針對(duì)速康寧滴眼液和滴鼻液建立新的生物限度檢查方法。

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典(2015年版)》規(guī)定,應(yīng)對(duì)眼用制劑進(jìn)行無(wú)菌檢查,應(yīng)對(duì)鼻用制劑進(jìn)行微生物限度檢查,且應(yīng)對(duì)上述檢查方法進(jìn)行適用性試驗(yàn),以確認(rèn)所采用的方法適用于該制劑。本研究先通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)用1個(gè)批次的制劑(眼用制劑和鼻用制劑)篩選出敏感菌,以確定初步的實(shí)驗(yàn)方案,從而提高工作效率,快速有效地建立適宜檢查方法[3-6]。我們?cè)趯?duì)含有硫酸慶大霉素抑菌成分的速康寧滴眼液進(jìn)行薄膜過(guò)濾法預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn),以0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為沖洗劑時(shí),沖洗量增至500 mL,枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍未符合標(biāo)準(zhǔn),因此我們采用聚山梨酯80類非離子表面活性劑作為沖洗劑,一方面該沖洗劑不具有抑菌性,另一方面該沖洗劑不對(duì)微生物造成損傷,在薄膜過(guò)濾法中起到很好的作用,既可以增加樣品的溶解性,又可增加沖洗液的洗脫力度,而且對(duì)微生物也有保護(hù)作用,可有效消除供試品對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的抑菌活性[7]。本研究對(duì)3個(gè)批次(20190722、20190723、20190724)的速康寧滴眼液供試品進(jìn)行適用性試驗(yàn),結(jié)果與預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,重復(fù)性好,可作為速康寧滴眼液無(wú)菌檢查方法,這提示采用薄膜過(guò)濾法可以對(duì)速康寧滴眼液進(jìn)行無(wú)菌檢查。

我們對(duì)速康寧滴鼻液進(jìn)行微生物限度檢查時(shí),采用傾注平皿法及1 ∶10供試液進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)用于霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的2株實(shí)驗(yàn)菌在各陽(yáng)性組中生長(zhǎng)良好,實(shí)驗(yàn)菌菌數(shù)回收率在50%～200%范圍內(nèi),因此可以選擇使用傾注平皿法對(duì)霉菌和酵母菌進(jìn)行微生物限度檢查。雖然3株(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)需氧菌敏感菌在1 ∶50供試液中的實(shí)驗(yàn)菌菌數(shù)回收率合格,但是不能排除由于稀釋比例過(guò)大導(dǎo)致供試品本底菌同時(shí)被稀釋而不被檢出的風(fēng)險(xiǎn),因此選擇使用薄膜過(guò)濾法對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌進(jìn)行微生物限度檢查,并以含0.1%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,均得到較好的實(shí)驗(yàn)菌菌數(shù)回收率。因此,筆者建議,對(duì)類似硫酸慶大霉素等抗菌藥物的制劑品種進(jìn)行需氧菌驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí),可直接以含0.1%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為沖洗劑(沖洗量為500 mL)進(jìn)行薄膜過(guò)濾法驗(yàn)證。

綜上所述,可采用薄膜過(guò)濾法對(duì)速康寧滴眼液進(jìn)行無(wú)菌檢查,但需要采用聚山梨酯80類非離子表面活性劑作為沖洗劑對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行檢測(cè);薄膜過(guò)濾法和傾注平皿法均可用于速康寧滴鼻液的微生物限度檢查,但對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌進(jìn)行微生物限度檢查時(shí),建議以含0.1%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為沖洗劑進(jìn)行薄膜過(guò)濾法檢查,而對(duì)于霉菌和酵母菌,采用傾注平皿法進(jìn)行微生物限度檢查即可獲得較好的結(jié)果。