姜黃素改善七氟烷致老年大鼠認(rèn)知功能障礙的機制

李小娜,樊少卿,趙二賢,許宏俠

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院日間手術(shù)室,鄭州 450002;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)部,鄭州 450000;3.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科,開封 475000

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是術(shù)后常見的并發(fā)癥,多發(fā)于中老年患者且集中發(fā)生于術(shù)后1周左右[1]。七氟烷吸入麻醉因術(shù)后蘇醒平穩(wěn)、迅速,對肝腎循環(huán)影響較小和對呼吸道作用溫和等,故常用于老年患者的麻醉[2]。但七氟烷會對神經(jīng)系統(tǒng)造成一定程度的損傷,且嚴(yán)重影響海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞,導(dǎo)致患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙、學(xué)習(xí)能力減退等癥狀[3],對術(shù)后預(yù)后的影響極大。姜黃素(curcumin)是一種多酚類物質(zhì),提取自姜黃、郁金、莪術(shù)的根莖,具有抗炎、抗腫瘤、抗凋亡、調(diào)節(jié)血脂等藥理作用[4]。姜黃素能夠通過減輕炎癥反應(yīng),緩解神經(jīng)損傷,但其機制尚不明確[5]。本研究通過建立POCD大鼠模型,探討姜黃素對認(rèn)知功能障礙的修復(fù)作用及可能的作用機制,為姜黃素藥物的開發(fā)及POCD的臨床治療提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SpectraMax M5型多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司);熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司);Hema9500型基因擴增儀(廣東黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥

姜黃素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司);腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒,均購自北京雅安達(dá)生物科技有限公司;兔抗鼠β-actin多克隆抗體,兔抗大鼠磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)多克隆抗體,山羊抗兔二抗IgG,均購自北京雅安達(dá)生物科技有限公司。

1.3 動物

60只18月齡SPF級雄性SD大鼠,體質(zhì)量220～250 g,由浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,合格證號:SCXK(浙)2019-0001。飼養(yǎng)條件:光/暗周期12 h,溫度(22±2) ℃,環(huán)境相對濕度為50%±10%。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,可自由獲取食物和水,墊料每日進行更換。實驗過程中對動物的各種處置均符合實驗動物委員會有關(guān)動物的使用及倫理學(xué)規(guī)定。

2 方法

2.1 造模與分組

60只18月齡SD雄性大鼠隨機分為模型組(12只)、姜黃素低劑量組(12只)、姜黃素中劑量組(12只)和姜黃素高劑量組(12只),另設(shè)對照組(12只)。每日上午同一時間,姜黃素低、中和高劑量組分別用50、150和300 mg·kg-1姜黃素混懸液[6-8](用生理鹽水配制)灌胃,對照組及模型組給予等量生理鹽水灌胃。每日下午同一時間,采用七氟烷吸入麻醉法建立POCD模型[9],將所有大鼠放入麻醉箱,除對照組外麻醉箱內(nèi)以空氣為載體,流速設(shè)置為2 L·min-1,持續(xù)時長為3 h,對照組大鼠置于麻醉箱內(nèi),給予同流速空氣,每日1次,連續(xù)處理14 d。

2.2 標(biāo)本采集

末次給藥后,腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉,翻正反射消失后,迅速打開腹腔。經(jīng)腹主動脈采集血液,靜置30 min,于4 ℃下以3 000 r·min-1離心15 min,分離血清,-20 ℃保存。冰上斷頭處死大鼠,打開頭骨,完整取出大鼠腦組織。使用預(yù)冷的生理鹽水沖洗血液,快速分離出海馬組織,將部分海馬組織浸入多聚甲醛溶液中固定24 h備用,剩余海馬組織封存于無菌凍存管內(nèi),-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 Morris水迷宮實驗

分別于給藥后1、3和7 d,待大鼠清醒后進行Morris水迷宮實驗測定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,每日5次,每次間隔5 min。水溫設(shè)定為22～26 ℃,依次將大鼠從4個象限入水點放入水中,記錄大鼠找到隱藏平臺的時間,該時長即為逃避潛伏期。當(dāng)大鼠到達(dá)平臺時,攝像系統(tǒng)停止拍照記錄,整理并分析大鼠逃避時長。撤去平臺,使大鼠重新入水,自由游泳120 s,記錄大鼠穿越平臺的次數(shù)。實驗過程中,保持室溫與水溫一致,室內(nèi)環(huán)境相同,以排除環(huán)境因素的干擾。

2.4 血清炎癥因子水平測定

取大鼠血清,室溫靜置20 min,按照TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒說明書中的步驟操作,先設(shè)置對照孔與樣本孔,于對照孔中加入不同質(zhì)量濃度的對照品50 μL,樣本孔中加入樣品稀釋液40 μL。每孔中再加入酶標(biāo)試劑100 μL,密封酶標(biāo)板,37 ℃孵育60 min。甩干廢液,加入20倍稀釋洗滌液,反應(yīng)5 s,清洗5次。每孔中加入顯色劑A與B,37 ℃避光孵育20 min,再于每孔中加入終止液終止反應(yīng)。15 min內(nèi)用全波長酶標(biāo)測試儀檢測各孔450 nm處的吸光度值,根據(jù)對照品質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣品的質(zhì)量濃度。

2.5 海馬組織HE染色觀察

取已固定的海馬組織,用PBS溶液洗滌3次,梯度乙醇脫水,置于二甲苯中透明。再分別將組織浸入軟蠟和硬蠟中進行包埋,待石蠟完全凝固后取出包埋盒,使用切片機先將組織石蠟塊粗略修形,再切成厚度為5 μm的薄片,展片晾干,置于37 ℃下烘烤過夜。滴加蘇木精染色溶液染色2 min,流水清洗,鹽酸乙醇溶液分化,流水清洗,伊紅乙醇溶液浸染1 min,流水沖洗,再次脫水透明,最后用中性樹膠封片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織的病理變化,采集圖像進行分析。

2.6 海馬組織TUNEL染色

取出制備好的海馬組織切片,置于室溫平衡溫度后,用PBS溶液洗滌3次。放入用Triton X與檸檬酸鈉配制的滲透液中10 min,PBS溶液沖洗,添加TUNEL反應(yīng)混合物,37 ℃孵育60 min,PBS溶液洗滌3次,每次3 min,浸入DAPI培養(yǎng)液中15 min,使用熒光顯微鏡拍攝圖像,觀察海馬組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況,統(tǒng)計細(xì)胞總數(shù)量和細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色的凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量,計算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=(陽性細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量)×100%。

2.7 PI3K、AKT、GSK3β mRNA的表達(dá)水平

將海馬組織研磨后置于EP管內(nèi),根據(jù)海馬組織量加入RNAAiso Plus,適當(dāng)吹打后進行勻漿處理,4 ℃以12 000 r·min-1離心15 min提取總RNA。用分光光度計檢測RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)并計算最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)。配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA,完成逆轉(zhuǎn)錄的cDNA樣品用于配制20 μL反應(yīng)體系進行PCR擴增,按照說明書配制相應(yīng)的cDNA Real-PCR,引物序列見表1。配制QPCR-20 μL反應(yīng)體系:2×SuperReal PreMix Plus 10 μL,上、下游引物各0.6 μL,50×ROX Reference Dye 2.0 μL,DNA模板1.0 μL,過氧化氫5.8 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性15 min,95 ℃ 10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,40個循環(huán)。擴增反應(yīng)結(jié)束后,讀取各樣本與內(nèi)參基因的Ct值,用2-△△CT法計算各樣本中各基因的相對表達(dá)量。

表1 RT-PCR引物序列

2.8 PI3K、AKT、GSK3β蛋白的表達(dá)水平

將海馬組織剪碎后加入RIPA裂解液,充分裂解30 min,4 ℃以12 000 r·min-1離心15 min,吸取上清液用BCA蛋白試劑盒檢測總蛋白濃度。確定蛋白上樣量,將40 μg蛋白樣品加入聚苯烯酰胺凝膠中,恒壓120 V電泳至溴酚藍(lán)底部。轉(zhuǎn)至PDVF膜上并置于脫脂奶粉中封閉60 min,加入一抗(1∶1 000),4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液清洗3次,每次10 min。加入二抗(1∶5 000),室溫孵育60 min,用TBST緩沖液清洗3次,每次10 min。滴加ECL顯色A液和B液,置于暗室中顯影和定影,以β-actin為內(nèi)參,計算相應(yīng)蛋白的表達(dá)量。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 Morris水迷宮行為學(xué)評分的比較

與對照組比較,模型組大鼠術(shù)后1、3和7 d逃避潛伏期明顯延長,跨臺次數(shù)減少(P<0.05)。與模型組比較,姜黃素高、中、低劑量組大鼠術(shù)后1、3和7 d逃避潛伏期明顯縮短,跨臺次數(shù)增加(P<0.05)。與姜黃素低劑量組比較,姜黃素中劑量組和高劑量組大鼠術(shù)后1、3和7 d逃避潛伏期明顯縮短,跨臺次數(shù)增多,且高劑量組的變化更為明顯(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠Morris水迷宮行為學(xué)評分的比較

3.2 血清炎癥因子水平的比較

與對照組比較,模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平升高(P<0.05)。與模型組比較,姜黃素低、中和高劑量組大鼠3項指標(biāo)均降低(P<0.05)。與姜黃素低劑量組比較,姜黃素中、高劑量組大鼠3項指標(biāo)均降低,且高劑量組的變化更為明顯(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組血清炎癥因子水平的比較

3.3 HE染色結(jié)果的比較

對照組大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整、清晰,排列緊密有序,神經(jīng)元數(shù)量較多,結(jié)構(gòu)完整;細(xì)胞核呈藍(lán)紫色,細(xì)胞質(zhì)呈淡紫色,染色均勻。模型組大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)被破壞,排列散亂無序,神經(jīng)元數(shù)量減少,細(xì)胞核皺縮明顯,染色不均。與模型組比較,姜黃素低、中和高劑量組大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損的現(xiàn)象得到改善,可見神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰、完整,排列緊密,神經(jīng)元數(shù)量增多,結(jié)構(gòu)較為完整。結(jié)果見圖1。

注:A.對照組;B.模型組;C.姜黃素低劑量組;D.姜黃素中劑量組;E.姜黃素高劑量組。

3.4 神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的比較

與對照組比較,模型組大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率升高(P<0.05)。與模型組比較,姜黃素高、中、低劑量組大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率降低(P<0.05)。與姜黃素低劑量組比較,姜黃素中和高劑量組大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率降低,且高劑量組的變化更為明顯(P<0.05)。結(jié)果見表4、圖2。

注:A.對照組;B.模型組;C.姜黃素低劑量組;D.姜黃素中劑量組;E.姜黃素高劑量組。

表4 大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的比較

3.5 PI3K、AKT、GSK3β mRNA水平的比較

與對照組比較,模型組大鼠海馬組織PI3K和AKT mRNA的表達(dá)水平降低,GSK3βmRNA的表達(dá)水平升高(P<0.05)。與模型組比較,姜黃素高、中、低劑量組大鼠海馬組織PI3K和AKT mRNA的表達(dá)水平升高,GSK3βmRNA的表達(dá)水平降低(P<0.05)。與姜黃素低劑量組比較,姜黃素中劑量組和高劑量組大鼠海馬組織PI3K和AKT mRNA的表達(dá)水平升高,GSK3βmRNA的表達(dá)水平降低,且姜黃素高劑量組的變化更為明顯(P<0.05)。結(jié)果見表5。

表5 大鼠海馬組織PI3K、AKT、GSK3β mRNA水平的比較

3.6 PI3K、AKT、GSK3β蛋白水平的比較

與對照組比較,模型組大鼠海馬組織PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)水平降低,p-GSK3β蛋白的表達(dá)水平升高(P<0.05)。與模型組比較,姜黃素高、中、低劑量組大鼠海馬組織PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)水平升高,p-GSK3β蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05)。與姜黃素低劑量組比較,姜黃素中劑量組和高劑量組大鼠海馬組織PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)水平升高,p-GSK3β蛋白的表達(dá)水平降低,且姜黃素高劑量組的變化更為明顯(P<0.05)。結(jié)果見表6、圖3。

圖3 海馬組織蛋白表達(dá)水平

表6 大鼠海馬組織PI3K、p-AKT、p-GSK3β蛋白水平的比較

4 討論

吸入性麻醉藥物與靜脈注射麻醉藥物相比,更易引起POCD,可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和學(xué)習(xí)記憶功能減退,藥物濃度越大神經(jīng)元凋亡越嚴(yán)重,且范圍越大[10-12]。炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡是引起神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生老化,即認(rèn)知功能減退的中心環(huán)節(jié)[13]。姜科植物姜黃是一種傳統(tǒng)中藥,姜黃素作為其特有的活性成分,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷有較好的修復(fù)作用,還可減輕機體的炎癥反應(yīng)[14-15]。姜黃素對神經(jīng)細(xì)胞凋亡亦有抑制作用[16]。

本研究用七氟烷吸入麻醉法建立POCD大鼠模型,從分子機制上探討姜黃素對POCD大鼠認(rèn)知功能障礙的修復(fù)作用及其對海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,模型組大鼠在Morris水迷宮實驗中逃避潛伏期延長,跨臺次數(shù)明顯減少,血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,表明模型組大鼠認(rèn)知功能障礙模型建立成功且伴有炎癥反應(yīng)。在給予不同劑量的姜黃素治療后,大鼠均表現(xiàn)逃避潛伏期縮短,跨臺次數(shù)明顯增多,血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低,表明大鼠認(rèn)知功能障礙得到改善,且體內(nèi)炎癥反應(yīng)減輕。觀察海馬組織HE染色切片也發(fā)現(xiàn),海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量增多,細(xì)胞凋亡現(xiàn)象得到改善。

PI3K/AKT/GSK3β信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可改善神經(jīng)炎癥,抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,是典型的抗炎、抗凋亡通路之一[17-18]。PI3K活化可激活下游因子AKT,而絲氨酸蛋白激酶參與細(xì)胞增殖、存活和凋亡等多種生理過程[19]。p-AKT作為GSK3β的負(fù)調(diào)節(jié)因子,能夠下調(diào)GSK3β從而降低凋亡蛋白相關(guān)因子的水平,起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[20]。在本研究中,與模型組比較,姜黃素各劑量組大鼠海馬組織中PI3K、AKT mRNA和蛋白的表達(dá)水平升高,GSK3βmRNA和蛋白的表達(dá)水平均降低,且海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率降低,表明姜黃素能夠激活PI3K/AKT/GSK3β信號通路,抑制POCD大鼠細(xì)胞凋亡,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上所述,姜黃素能夠改善七氟烷致POCD大鼠的認(rèn)知功能障礙,減輕炎癥反應(yīng),降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡率,可能是通過激活PI3K/AKT/GSK3β信號通路發(fā)揮作用,為臨床治療POCD提供實驗依據(jù)。