精草銨膦綠色生物合成技術及應用前景

董怡

(永農(nóng)生物科學有限公司，浙江 紹興 312300)

精草銨膦又稱L-草銨膦，是拜耳從吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)發(fā)酵液中分離得到具有殺菌活性的三肽化合物——雙丙氨膦(bialaphos)，由2 分子L-丙氨酸和一種當時未知的氨基酸構成[1]。精草銨膦(L-草銨膦)屬于膦酸類除草劑，其作用機制和草銨膦相同。草銨膦是D/L-草銨膦的外消旋物，僅L-草銨膦具有除草活性[2]，通過作用于植物體谷氨酰胺合成酶，抑制L-谷氨酰胺合成，導致細胞毒劑銨離子累積、銨代謝紊亂、氨基酸缺失、葉綠素解體、光合作用被抑制，最終將雜草徹底殺死[3]。

除草劑銷售榜首草甘膦[4]的長期廣泛使用已導致牛筋草、小飛蓬、田旋花等雜草抗性的發(fā)生、發(fā)展。2015 年，草甘膦被國際癌癥研究列為可能的人類致癌物，慢性動物飼養(yǎng)研究也發(fā)現(xiàn)可導致肝臟和腎臟腫瘤發(fā)病率增加[5]，種種致癌風波使法、德等國家禁用草甘膦。因此，草銨膦市場進一步增量，其銷售額從2012 年4.5 億美元增至2020 年10.50 億美元，成為增長最快的非選擇性除草劑。

相較于傳統(tǒng)草銨膦，精草銨膦活性是其2 倍以上。永農(nóng)生物科學有限公司2018 年在國內(nèi)登記了精草銨膦的原藥和制劑，精草銨膦的推廣能夠降低50%施藥量，即每使用1 t 精草銨膦相當于直接向農(nóng)田減排1 t D-草銨膦無效體，有效減輕農(nóng)田耕作對環(huán)境造成的負擔[6]，符合國家農(nóng)藥減量增效政策。

1 精草銨膦化學合成現(xiàn)狀

L-草銨膦制備方法主要有3 種：不對稱合成法[7-9]、外消旋體拆分法[10-12]和生物催化法。工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)方法主要是不對稱合成法和外消旋體拆分法[13]。

不對稱合成法是從手性原料出發(fā)合成光學純L-草銨膦。2007 年，明治制果將β-次膦酸酯基醛與伯胺反應生成亞胺類化合物，在Jacobsen 催化下，用三甲基硅氰對亞胺進行不對稱Strecker 反應(圖1)，再經(jīng)水解轉化得到精草銨膦，e.e.值最高達94%[14]。此工藝較復雜，需要使用昂貴的手性拆分試劑，理論收率僅50%，單次拆分率低[15]。

圖1 不對稱Strecker 反應合成L-草銨膦工藝路線

外消旋體拆分法是通過對外消旋DL-草銨膦或其衍生物進行手性拆分，實現(xiàn)D 型和L 型異構體分離，從而得到光學純L-草銨膦。2018 年史泰龍等[16]報道了以Pseudomonassp.zjut126 為催化劑、N-癸酰草銨膦為拆分底物水解拆分制備L-草銨膦的合成工藝路線。拆分過程中N-癸酰草銨膦在Pseudomonassp.zjut126 催化下，L-N-癸酰草銨膦水解生成L-草銨膦(圖2)，而(D)-N-癸酰草銨膦不參與反應，處理后可得e.e.值大于95.2%的L-草銨膦。此工藝步驟多、收率低、手性原料昂貴，不利于大規(guī)模制備。

圖2 用Pseudomonas sp.zjut126 細胞拆分外消旋草銨膦制L-草銨膦工藝流程

2 精草銨膦生物合成

生物催化具有立體選擇性嚴格、反應條件溫和、收率高等優(yōu)點，具有替代傳統(tǒng)化學合成潛力。傳統(tǒng)生物催化法主要包括：⑴以L-草銨膦衍生物為底物，通過酶法直接水解獲得，但前體昂貴且不易得；⑵以外消旋草銨膦前體為底物，通過酶選擇性拆分獲得，理論收率僅50%，造成原料浪費。此外，以DL-草銨膦為原料的去消旋合成法優(yōu)勢明顯，由于當前市售的草銨膦主要為DL-草銨膦，其工業(yè)化生產(chǎn)技術成熟，去消旋合成法以DL-草銨膦為原料，原料易得，且成本較低，能夠較好地對接現(xiàn)有草銨膦工業(yè)生產(chǎn)體系。

2.1 草銨膦脫氫酶突變體去消旋合成L-草銨膦

浙江工業(yè)大學薛亞平教授團隊[17]發(fā)現(xiàn)了一種由野生菌Thiopseudomonas denitrificans中草銨膦脫氫酶V377S 位點突變所得的突變體。以DL-草銨膦為原料，D-草銨膦在D-氨基酸氧化酶催化下形成2-羰基-4-[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸，L-草銨膦因不參與反應而被完全保留；產(chǎn)物2-羰基-4-[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸通過草銨膦脫氫酶突變體催化還原為L-草銨膦。該方法是對當前去消旋合成法的升級，草銨膦脫氫酶突變體具有更好催化效率，以外消旋DL-草銨膦為底物進行催化反應時，轉化率遠高于野生型酶，PPO 產(chǎn)率也大幅提升。

2.2 ω-轉氨酶去消旋合成L-草銨膦

2021 年浙江大學楊立榮教授團隊[18]公開了一種全新生物酶——ω-轉氨酶，來自芽孢桿菌(Bacillussp.)YM?01，用于去消旋化生產(chǎn)L-草銨膦，能夠避免有毒物質(zhì)過氧化氫生成。以DL-草銨膦為原料，通過R-選擇性的ω-轉氨酶將D-草銨膦轉化為2-羰基-4-[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸，L-型草銨膦由于不參與反應而得以保留；然后谷氨酸脫氫酶以2-羰基-4-[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸為原料不對稱合成L-草銨膦，從而得到光學純L-型草銨膦(圖3)，并使用醇脫氫酶進行輔酶再生，同時生成丙酮作為第一步轉氨酶的氨基受體，最大幅度提高了原料利用率。合成過程中所需輔原料異丙醇轉化為副產(chǎn)物異丙胺，經(jīng)過簡單蒸餾回收為農(nóng)藥化工原料。

圖3 全新生物酶法去消旋化合成L-草銨膦的工藝流程

2.3 多酶級聯(lián)生物催化生產(chǎn)L-草銨膦

上述2 種去消旋合成法相對傳統(tǒng)生物合成法均具有一定突破，但在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中仍具有其局限性。利用D-氨基酸氧化酶將D-草銨膦氧化為2-羰基-4-[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸的過程中會產(chǎn)生過氧化氫，易導致酶蛋白失活，盡管理論上可以通過添加過氧化氫酶的方式將其去除，但在實際工業(yè)生產(chǎn)中并不能完全消除其不利影響，并且過氧化氫酶的使用會增加過程成本。ω-轉氨酶去消旋合成L-草銨膦的生物合成路線雖然能夠避免催化過程中過氧化氫的產(chǎn)生，但其后續(xù)的生物不對稱合成反應大多為可逆反應，因此存在酶利用效率低、L-草銨膦收率低等問題[17-18]。

2022 年，中國石油和化學工業(yè)聯(lián)合會組織專家召開了“手性純草銨膦(精草銨膦)除草劑綠色生物制造技術與應用”科技成果鑒定會。該成果由永農(nóng)生物聯(lián)合華東理工大學生物催化與生物合成領域專家魏東芝教授團隊共同開發(fā)，借助魏東芝教授團隊20 多年在酶工程與生物催化方面的技術優(yōu)勢以及永農(nóng)生物在草銨膦生產(chǎn)與應用方面的經(jīng)驗積累，開發(fā)了多酶級聯(lián)生物催化生產(chǎn)L-草銨膦新工藝，創(chuàng)新了高活性、高對映選擇性酶定制技術和多酶自組裝生物催化技術，創(chuàng)建了高底物濃度、純水反應體系，通過生物催化技術，實現(xiàn)將DL-草銨膦近100%效率轉化為L-草銨膦，是生物制造生產(chǎn)農(nóng)藥品種的成功范例。該項目建成國際首條生物技術可實現(xiàn)年產(chǎn)5 000 t L-草銨膦生產(chǎn)線，在全球范圍內(nèi)首次實現(xiàn)L-草銨膦綠色生物制造工藝產(chǎn)業(yè)化。大規(guī)模生物法制造L-草銨膦屬國際首創(chuàng)，有力推動了產(chǎn)業(yè)升級，經(jīng)濟和社會效益顯著[19]。

3 展望

1995 年，拜耳、先正達等巨頭開始推廣抗草銨膦以及多抗轉基因作物[20]，1996 年轉基因作物商業(yè)化種植，2018 年全球26 個國家和地區(qū)種植了轉基因作物，種植面積超1.9 億hm2，其中大豆是最大抗除草劑轉基因作物，玉米其次。2020 年草銨膦轉基因作物需求為1.2 萬t，在草銨膦總需求中占比26%。目前草銨膦已成為僅次于草甘膦的第二大轉基因作物耐受除草劑，主要需求在單抗草銨膦種子(主要為巴斯夫的耐草銨膦油菜種子和耐草銨膦大豆種子)以及大豆、棉花、玉米的雙抗/三抗種子。此外，全球草銨膦抗性基因已經(jīng)導入水稻、小麥、甜菜、煙草、大豆、棉花、番茄、玉米、油菜、甘蔗等20 多種作物中，商業(yè)化程度大幅提升。預計2025 年，轉基因作物需求將達3.4 萬t，占比36%，草銨膦全球需求量也將達6.76 萬t[21]。當前抗草銨膦轉基因作物商業(yè)化程度提升，草銨膦需求結構性改善。相較于傳統(tǒng)草銨膦，精草銨膦活性倍增、用量減半，其可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)滅生性除草劑草甘膦、百草枯，也同樣適用于耐草銨膦轉基因作物，精草銨膦正處于快速發(fā)展期，市場前景廣闊。