基于偏最小二乘法分析枇杷葉提取物中α-葡萄糖苷酶抑制劑

孔紅銘 趙楠星 夏旭東 袁 芳 曹少謙 戚向陽 陳秋平

（浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一類與胰島素分泌缺陷相關(guān)，以高血糖為特征的代謝性疾?。?］。常見癥狀有多食、多飲、多尿以及消瘦等［2］，久病可致眼、腎、心臟等器官出現(xiàn)慢性損害［3］。目前口服降糖藥和注射胰島素通常可以控制糖尿病。天然α-葡萄糖苷酶抑制劑因副作用小，能夠有效控制糖尿病患者餐后血糖上升等優(yōu)勢(shì)而成為輔助治療Ⅱ型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的首選藥物。市面上常見的α-葡萄糖苷酶抑制劑大多為人工合成且副作用較多，例如阿卡波糖會(huì)引起腹脹、腹瀉、腹痛等不良反應(yīng)［4］。

獨(dú)特的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論讓中醫(yī)藥在糖尿病及其并發(fā)癥的治療方面有著良好的效果和廣闊的前景。陳海君等［5］運(yùn)用親和超濾技術(shù)從毛菊苣種子提取物中篩選并鑒定出4 種α-葡萄糖苷酶抑制劑；Chen 等［6］通過沉淀交聯(lián)法將豬胰脂肪酶固定在金屬有機(jī)骨架上，篩選出夏枯草中的脂肪酶抑制劑，獲得13 種可抑制脂肪酶的小分子化合物。枇杷葉（Eriobotrya japonica）為薔薇科植物枇杷的干燥葉［7］，作為傳統(tǒng)中藥，其性微寒、味微苦，有清肺止咳、降逆止嘔之功效［8］，主要化學(xué)成分為三萜酸類、黃酮類、多酚類等物質(zhì)［9］。近年來，枇杷葉在抗炎、抗氧化［10］、降血糖［11］等方面的作用逐漸受到關(guān)注，枇杷葉所含化合物十分復(fù)雜，目前尚缺乏對(duì)枇杷葉抗糖尿病的藥效成分及作用機(jī)制的整體認(rèn)識(shí)。

本試驗(yàn)采用偏最小二乘回歸分析法，對(duì)枇杷葉提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性組分的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatographymass spectrometry，UPLC-MS）特征圖譜與體外酶抑制藥效進(jìn)行相關(guān)性分析，以篩選出枇杷葉提取物中抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性成分，初步揭示其物質(zhì)基礎(chǔ)。旨在從天然產(chǎn)物中尋找藥效溫和、毒副作用小的α-葡萄糖苷酶抑制劑，以解決糖尿病人的實(shí)際需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-葡萄糖苷酶（50～120 kDa），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；阿卡波糖、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇（分析純）、科羅索酸、奎寧酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；枇杷葉（產(chǎn)地品種見表1）；甲酸、乙腈（色譜純），德國(guó)Merk公司；試驗(yàn)用水為重蒸水。

表1 枇杷葉樣品信息Table 1 Loquat leaf sample information

1.2 儀器與設(shè)備

DXF-04D 手提式磨粉機(jī)，廣東大祥儀器有限公司；RE2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮儀器有限公司；Centrifuge 5804R 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；U570超低溫冰箱，英國(guó)NBS公司；FD-1F-80T真空冷凍干燥機(jī)，上海舜制儀器有限公司；TU-1810可控溫紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；Waters Synapt G2 MS 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Waters公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.2 提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用 空白酶活的測(cè)定：用0.1 mmol·L-1磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline ，PBS，pH 值6.8）將α-葡萄糖苷酶配制成1.5 U·mL-1的溶液，用于酶活性分析［12-13］。比色皿中加入1.8 mL PBS 緩沖液，于37 ℃預(yù)熱5 min，待其溫度穩(wěn)定后，加入100 μL PNPG（5 mmol·L-1）溶液，然后加入20 μL 1.5 U·mL-1酶液，迅速搖勻，于405 nm 處檢測(cè)其2 min 內(nèi)吸光度值的變化，平行測(cè)定3次，計(jì)算酶活性（enzymatic activity，EA）［14-15］。

樣品和陽性對(duì)照阿卡波糖的半抑制濃度（semiinhibition concentration，IC50）測(cè)定：緩沖液預(yù)熱后，加入100 μL PNPG，再加入不同體積梯度的抑制劑，其余步驟同上，抑制率計(jì)算公式如下：

將抑制劑濃度及其對(duì)應(yīng)的抑制率輸入CalcuSyn Demo軟件，計(jì)算半抑制濃度，并通過SPSS 25軟件進(jìn)行抑制率曲線繪制。

1.3.3 LE 對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的動(dòng)力學(xué)分析 以IC50值最低的LE 為樣品組，控制反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH 值等不變，在添加相同濃度不同體積（0、30、60、75 μL）抑制劑的條件下，改變底物PNPG 的添加量（90、32、20、13、10 μL），測(cè)定α-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)速率（V），以底物濃度倒數(shù)（1/［S］）為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率倒數(shù)（1/V）為縱坐標(biāo)，采用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖分析［16］，再以抑制劑濃度為橫坐標(biāo)，雙倒數(shù)圖中不同直線的斜率（Vmax/Km）為縱坐標(biāo)，得到與x軸相交的直線，并求出Ki，確定抑制類型［17-18］。Vmax和米氏常數(shù)Km計(jì)算公式如下：

式中，Vmax為最大反應(yīng)速率（μmol·L-1·s）；［S］為底物濃度（μmol·L-1）；Km為米氏常數(shù)（μmol·L-1）。

1.3.4 UPLC-MS 特征圖譜建立 色譜條件：運(yùn)用Synapt G2 MS 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相A 為2 mmol·L-1乙酸銨+0.2%甲酸溶液，流動(dòng)相B 為乙腈。洗脫梯度：0～1 min，20% B；1～9 min，20%～45% B；9～21 min，45%～98% B。進(jìn)樣量2 μL，流速0.2 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫35 ℃。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI），負(fù)離子模式采集，自動(dòng)增益控制（automatic gain control，AGC）目標(biāo)值5 e5；噴霧電壓為3 500 V，離子傳輸管溫度為350 ℃，鞘氣壓40 arb，輔助氣壓10 arb。

1.3.5 譜效關(guān)系分析 以特征圖譜中代表化合物的各色譜峰的峰面積為自變量（X），LE 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為因變量（Y）［19-20］，導(dǎo)入SIMCA 14.0軟件，采用偏最小二乘回歸分析（partial least square，PLS）進(jìn)行回歸分析。

第四，分銷渠道延伸性較弱，忽視促銷策略。直接渠道模式，是南通鵬越紡織有限公司的主要分銷模式，但這在一定程度上制約了企業(yè)的發(fā)展，且對(duì)競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手的了解相對(duì)落后。且在促銷實(shí)踐中，推銷人員不足，推銷力度廣度都不夠，新客戶群體的獲得都會(huì)受到不同程度的影響。

1.3.6 分子對(duì)接 從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）下載配體化合物結(jié)構(gòu)，采用Chem3D 軟件將其進(jìn)行能量最小化處理［21］。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（protein data bank，PDB，https：//www.rcsb.org/）檢索α-葡萄糖苷酶（PDB ID：3A4A），保存為pdb格式，通過Pymol 2.5.0對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)刪除水分子、去除修飾配體［22］，再使用AutoDock Tools 1.5.6將活性成分和α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，并通過AutoDock Vina 1.1.2 進(jìn)行分子對(duì)接。通過LigPlus 2.5.5分析配體與蛋白的氫鍵、疏水作用力等。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，繪制抑制率曲線；通過CalcuSyn Demo 軟件計(jì)算提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷葉提取物的抑制作用

由圖1可知，不同品種產(chǎn)地的LE對(duì)α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，并表現(xiàn)出一定的濃度依賴性［23］，IC50為1.31～2.65 μg·mL-1，遠(yuǎn)低于陽性對(duì)照阿卡波糖（樣品K，IC50值為81.98 μg·mL-1），其中抑制效果最佳品種為陜西漢中野生（IC50值為1.31 μg·mL-1）。

圖1 種植品種的枇杷葉提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率曲線Fig.1 Inhibition rate curve of α-glucosidase by different varieties of LE

2.2 LE對(duì)α-葡萄糖苷酶的的抑制類型

陜西漢中野生品種對(duì)α-葡萄糖苷酶的動(dòng)力學(xué)結(jié)果如圖2所示，Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法顯示直線相交于第Ⅰ象限，非常接近Y 軸，表明提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)型抑制［24］，即提取物中的活性成分與酶促反應(yīng)底物競(jìng)爭(zhēng)α-葡萄糖苷酶的活性位點(diǎn)。通過二次作圖計(jì)算得到其抑制常數(shù)Ki為0.491 mmol·L-1。

圖2 LE對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig 2 Lineweaver-Burk curves for the inhibition of α-glucosidase by LE

2.3 UPLC-MS特征圖譜

10 批LE 的 UPLC-MS 特征圖譜如圖3所示，通過Integrate chromatogram 軟件自動(dòng)積分，分別導(dǎo)出特征圖譜中的各峰面積，根據(jù)各樣品特征圖譜的各峰保留時(shí)間，共匹配出16 個(gè)共有峰，如表2所示，其中X1、X5 和X6 峰面積相對(duì)較大，意味著所對(duì)應(yīng)化合物在LE 中占比相對(duì)較大，而X2、X4、X11、X13 等峰面積雖相對(duì)較小，但不同品種產(chǎn)地LE 的峰面積大小并非直接與α-葡萄糖苷酶抑制率呈正相關(guān)，因此，需要通過偏最小二乘法進(jìn)一步分析。

圖3 10批LE的UPLC-MS特征圖譜Fig.3 UPLC-MS characterization of 10 batches of LE

表2 不同品種LE活性組分共有峰峰面積Table 2 The common peak areas of active components from different varieties of LE/（mAU·min）

2.4 譜效關(guān)系分析

2.4.1 偏最小二乘回歸方程 以圖3 中16 個(gè)共有色譜峰的峰面積為自變量（X），LE 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為因變量（Y），采用PLS模型進(jìn)行偏最小二乘回歸分析，數(shù)據(jù)選擇標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)化處理，消除變量量綱差異，得到如下回歸方程：Y=0.096X1-0.021X2-0.011X3+0.321X4+0.125X5-0.122X6-0.118X7-0.168X8-0.175X9-0.172X10+0.117X11-0.050X12+0.286X13-0.183X14-0.061X15+0.246X16，PLS模型抑制系數(shù)見圖4。

圖4 LE抑制α-葡萄糖苷酶譜效關(guān)系偏最小二乘回歸系數(shù)Fig.4 Partial least square regression coefficient of the spectral-effect relationship of LE inhibiting α-glucosidase

2.4.2 變量重要性分析 PLS 回歸模型采用回歸系數(shù)和變量重要性綜合評(píng)價(jià)各特征共有峰對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的貢獻(xiàn)大小，在回歸方程中，系數(shù)為正值的自變量與抑制率呈正相關(guān)，反之則呈負(fù)相關(guān)。各特征峰的回歸系數(shù)表明，X1、X4、X5、X11、X13、X16 與酶抑制活性呈正相關(guān)，變量重要性投影值（variable importance in project，VIP）顯示X4、X13、X16的值較大，變量重要性均大于1.0。在PLS 分析中，VIP 反應(yīng)自變量X對(duì)因變量Y的解釋能力大小，VIP值越大，自變量X的解釋能力越強(qiáng)［25］。因此，綜合評(píng)價(jià)各特征峰的貢獻(xiàn)小大排序?yàn)?X4＞X13＞X16＞X11＞X5＞X1，表明峰 4、13、16、11、5、1 在UPLC-MS 特征圖譜上代表的化合物為L(zhǎng)E 抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性物質(zhì)。

圖5 各共有峰對(duì)LE抑制酶活性的變量重要性分析Fig.5 Variable importance analysis of common peaks on inhibitory enzyme activity of LE

通過UPLC-MS 獲得峰 4、13、16、11、5、1的二級(jí)質(zhì)譜碎片信息并匯總至表3，結(jié)合TCMSP、PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)［26-27］，對(duì)上述6 個(gè)化合物進(jìn)行鑒定分析，其中，峰1、峰13 用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜碎片信息比對(duì)，確定成分分別為奎寧酸和科羅索酸。

表3 化合物成分鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of compound components

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

由表4可知，活性成分在氫鍵和疏水作用力的共同作用下與α-葡萄糖苷酶相互作用，其中科羅索酸、科羅索酸甲酯與α-葡萄糖苷酶結(jié)合能小于-8.0 kcal·mol-1，NRRRG、奎寧酸的結(jié)合能小于-6.0 kcal·mol-1，奎寧酸的結(jié)合能相對(duì)最高，說明科羅索酸、科羅索酸甲酯對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果優(yōu)于NRRRG和奎寧酸。

表4 枇杷葉關(guān)鍵成分與α-葡萄糖苷酶對(duì)接結(jié)果Table 4 Docking results of key components of loquat leaf with α-glucosidase

運(yùn)用LigPlus2.5.5 進(jìn)行配體與蛋白之間相互作用力分析，結(jié)果如圖6所示。以科羅索酸為例，能夠順利與α-葡萄糖苷酶蛋白活性口袋結(jié)合，通過與活性口袋的 Asp307、Gly309、Thr310、Thr310、Ser304 氨基酸形成分子間氫鍵來維持配體與蛋白活性口袋的穩(wěn)定，4 種活性成分中科羅索酸的氫鍵數(shù)量最多，與表4 結(jié)果一致。

圖6 活性成分與α-葡萄糖苷酶的分子對(duì)接結(jié)果Fig.6 Molecular docking results of active components with α-glucosidase

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，不同品種產(chǎn)地的LE 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用存在較大差異，IC50最大值與最小值相差一倍，究其原因，可能是提取物成分復(fù)雜，多種化合物共同競(jìng)爭(zhēng)α-葡萄糖苷酶的活性中心，由此產(chǎn)生協(xié)同作用，使抑制效果增強(qiáng)［28］，本研究結(jié)果為譜效關(guān)系研究提供了良好的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。枇杷樹適宜在氣候濕潤(rùn)的地區(qū)生長(zhǎng)，在生長(zhǎng)過程中對(duì)溫度要求較高，年平均溫度應(yīng)在12～15 ℃范圍內(nèi)，冬季氣溫不低于-5 ℃［29］。通過分析10 批枇杷葉的品種產(chǎn)地發(fā)現(xiàn)，人工種植的解放鐘（廣東省韻關(guān)市）和早鐘6 號(hào)（福建省漳州市）對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50值較低，酶抑制效果較好，這兩個(gè)品種均生長(zhǎng)于年平均降水量1 600 mm 以上的東南沿海地區(qū)［30］，同屬亞熱帶季風(fēng)氣候，夏季受海陸氣溫差異影響，來自太平洋的氣流攜帶大量水汽不斷吹向大陸［31］；而大五星（四川省綿陽市）、白沙（浙江省溫州市）和白玉（江蘇省蘇州市）枇杷葉的產(chǎn)地年平均降水量為800 mm，雖處于氣候濕潤(rùn)區(qū)，但無法保證充沛的水量用于開花結(jié)果［32］，因此，這三地所產(chǎn)枇杷果實(shí)相對(duì)前兩地體積稍小，葉中活性成分的積累也相對(duì)較少。

LE可以有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，但主要活性成分未知。采用傳統(tǒng)的分離方法鑒定活性單體不僅效率低，且容易丟失活性目標(biāo)。偏最小二乘回歸法是集多功能為一體的多元數(shù)據(jù)分析方法，是構(gòu)建中藥譜效關(guān)系的一個(gè)重要工具［33］。肖作兵等［34］通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatograph-mass spectrometer，GCMS）結(jié)合偏最小二乘法，以甜橙油為研究對(duì)象，成功鑒定出15種風(fēng)味化合物；孫飛等［35］通過偏最小二乘法分析山楂和焦山楂化學(xué)成分與消食健脾功效的相關(guān)性，共計(jì)識(shí)別出11 種功效成分。通過前期的酶抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，枇杷葉提取物的IC50值低于阿卡波糖，但尚未明確具體是哪些化合物發(fā)揮主要的酶抑制作用，因此，本研究采用偏最小二乘法分析枇杷葉提取物與α-葡萄糖苷酶抑制率之間的譜效關(guān)系，對(duì)活性成分進(jìn)行快速定位。通過PLS 分析發(fā)現(xiàn)，枇杷葉中各共有成分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率均有影響，在16 個(gè)共有活性成分中，6 個(gè)活性成分對(duì)抑制率影響較大，說明LE 的酶抑制能力是多種活性成分共同作用的結(jié)果，符合天然活性成分“多通路、多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)。同時(shí)，6 個(gè)活性成分回歸系數(shù)較大，說明其對(duì)抑制率貢獻(xiàn)較高［36］。卞振華等［25］、黃廣偉等［37］認(rèn)為，VIP值是反映自變量對(duì)因變量解釋能力的重要指標(biāo)，其值越大說明該自變量對(duì)因變量的解釋能力越強(qiáng)。因此，本研究認(rèn)為峰1、4、5、11、13、16 在UPLC-MS 特征圖譜上代表的化合物為L(zhǎng)E 抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性物質(zhì)。

通過分析化合物二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定得到4 個(gè)化合物。由于α-葡萄糖苷酶是臨床上用于降血糖的關(guān)鍵靶點(diǎn)［38］，因此將篩選得到的活性成分與α-葡萄糖苷酶進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助分子對(duì)接模擬，通過分子對(duì)接模擬，發(fā)現(xiàn)科羅索酸的結(jié)合能最低，同時(shí)氫鍵數(shù)量最多，主要集中在6號(hào)碳原子與14號(hào)碳原子上的羥基，推測(cè)科羅索酸在與α-葡萄糖苷酶結(jié)合時(shí)，通過疏水作用力與氫鍵共同起作用，其中氫鍵在結(jié)合過程中起主導(dǎo)地位，與α-葡萄糖苷酶的Asp307、Gly309、Thr310、Thr310、Ser304 號(hào)氨基酸殘基存在氫鍵相互作用。此外，4 個(gè)活性成分與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合能均小于-6.0 kcal·mol-1，是十分良好的天然α-葡萄糖苷酶抑制劑［39］。通過與對(duì)照品比對(duì)，最終確定峰1、峰13分別為奎寧酸和科羅索酸，然而尚有部分化合物未能成功鑒定。由于NRRRG 和科羅索酸甲酯目前在國(guó)內(nèi)無法購(gòu)買，未能鑒定峰4、峰16具體為何種化合物，將在后續(xù)深入研究中，通過色譜分離等相關(guān)技術(shù)獲得較高濃度的富集物，進(jìn)一步鑒定化合物成分。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過UPLC-MS 特征圖譜結(jié)合偏最小二乘回歸法分析α-葡萄糖苷酶的活性抑制組分與UPLCMS特征圖譜共有峰并進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，揭示了枇杷葉提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性物質(zhì)的基礎(chǔ)，確定峰1、峰13為奎寧酸、科羅索酸，分子對(duì)接結(jié)果表明，α-葡萄糖苷酶與科羅索酸、科羅索酸甲酯、nerolido-3-α-Lrhamnopyranosyl（1→4）-α-L-rhamnopyranosyl（1→2）-［α-L-rhamnopyranosyl（1→6）］-β-D-glucopyranoside、奎寧酸的結(jié)合活性較強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果為闡明枇杷葉提取物降糖機(jī)理提供了一定的理論依據(jù)。