Collagen1和Collagen3在牦牛肺纖維化組織中的表達(dá)研究

陳 平 何振富 王 斐 謝建鵬 何翃閎

（1甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070；2青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；3西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

牦牛生活在海拔3 000 m以上的高原地區(qū)，是高寒牧區(qū)特有的牛種資源［1］。牦牛對(duì)高寒低氧環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，為牧區(qū)人民提供了基本的生產(chǎn)生活資料，對(duì)牧區(qū)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有不可替代的作用［2-3］。高原地區(qū)空氣中的含氧量?jī)H為海平面一半左右，牦?？稍诘脱?、低氣壓環(huán)境下生存，這與牦牛特殊的遺傳適應(yīng)性結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系，如肺血管收縮緩慢、肺動(dòng)脈壓低等［4］。肺是動(dòng)物體呼吸系統(tǒng)重要的組成部分，也是機(jī)體供氧的重要器官，而膠原纖維、彈性纖維和平滑肌是肺結(jié)構(gòu)的主要組成部分。膠原蛋白（collagen）是脊椎動(dòng)物體內(nèi)最豐富的分泌蛋白，約占總蛋白的1/3，在動(dòng)物生命過(guò)程中不斷更新［5］，也是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的主要化合物，具有支撐器官和保護(hù)機(jī)體的作用［6-7］，可提供支架并引導(dǎo)細(xì)胞遷移、增殖和分化［8］。Ⅰ型膠原蛋白（Collagen1）和Ⅲ型膠原蛋白（Collagen3）是肺內(nèi)主要的間質(zhì)型膠原蛋白，Collagen1蛋白直徑較粗，伸張能力強(qiáng)，主要起支持作用；Collagen3直徑較細(xì)，柔韌性強(qiáng)［9］。Kim 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，以膠原蛋白為主的ECM 在肺纖維化進(jìn)程中起著重要作用，發(fā)生炎癥時(shí)成纖維細(xì)胞被過(guò)度激活，導(dǎo)致纖維化增殖并促使Collagen1 的合成［11-12］。Collagen1 和Collagen3 水平發(fā)生變化，將導(dǎo)致膠原合成代謝紊亂［13］，而ECM 過(guò)度沉積或降解都會(huì)導(dǎo)致肺纖維化，因此Collagen1 和Collagen3 可以作為反映纖維化的指標(biāo)［14-15］。肺纖維化組織病理學(xué)檢查可見(jiàn)肺間質(zhì)增生和ECM 過(guò)度沉積。但在肺纖維化組織中，Collagen1 與Collagen3 的相對(duì)表達(dá)量尚未研究，尤其是高寒地區(qū)特有動(dòng)物。因此，本試驗(yàn)探究Collagen1與Collagen3在牦牛肺纖維化不同階段的相對(duì)表達(dá)量，旨在為牦牛纖維化肺炎提供一定的理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)還通過(guò)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和Masson 染色及透射電鏡觀察正常組和試驗(yàn)組組織結(jié)構(gòu)變化；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）和蛋白免疫印跡（western-blotting，WB）比較Collagen1 和Collagen3 在牦牛肺正常組和試驗(yàn)組的表達(dá)差異；并運(yùn)用免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色研究Collagen1 和Collagen3 在正常組和試驗(yàn)組肺組織中的分布特征，以期闡明Collagen1和Collagen3在牦牛肺發(fā)生纖維化進(jìn)程中發(fā)揮的作用，為研究牦牛纖維化肺炎提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021年11月于甘肅省臨夏回族自治州，挑選健康和有嚴(yán)重呼吸道疾病的牦牛各6 頭，頸動(dòng)脈放血致死后迅速解剖，取其肺組織，用生理鹽水沖洗干凈。將樣品分為3 份，第一部分做好標(biāo)記迅速放入液氮，存于-80 ℃冰箱，用于RNA和蛋白的提?。坏诙糠纸萦?%多聚甲醛磷酸鹽緩沖固定液中固定，用于HE染色和Masson 染色、免疫組織化學(xué)以及免疫熒光染色；最后一部分固定于戊二醛中，用于制作透射電鏡切片。

1.2 儀器與試劑

812 環(huán)氧樹脂包埋套裝、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛染液，北京中鏡科儀技術(shù)有限公司；四氧化鋨，德國(guó)徠卡公司；TransZol、Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Go Taq?Green Master Mix 2×，美國(guó)Promega 公司；SYBR?Premix Ex Taq? Eraser?，大連TaKaRa 公司；Collagen1 抗體、Collagen3 抗體、Anti-GAPDH Mouse mAb、Goat antirabbit IgG-HRP antibody，蘇州江蘇親科生物研究中心有限公司；顯影定影試劑，武漢賽維爾生物科技有限公司；放射免疫沉淀法裂解液（radio immunoprecipitation assay，RIPA）、免疫組化試劑盒，北京索萊寶生物有限公司；ABI ViiA7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，美國(guó)Life Technologies 公司；DP71 顯微照相裝置，日本Olympus公司；DP71 掃描成像儀，日本EPSON 公司；EM UC7 超薄切片機(jī)，德國(guó)徠卡；JEM-1400PLUS 透射電鏡，日本電子（JEOL）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 HE 和Masson 染色觀察 肺組織在4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖固定液中固定48 h 以上，脫水，石蠟包埋，制作4 μm 石蠟切片。HE 染色觀察正常肺和發(fā)生纖維化肺組織的結(jié)構(gòu)變化；Masson 染色（鐵-蘇木精染色5 min，Masson 染液染5 min，阿利新蘭染色2 min）觀察膠原纖維變化。

1.3.2 透射電鏡觀察 分別取正常和發(fā)生纖維化的肺組織，修剪為1 cm3大小的肺塊。經(jīng)3%戊二醛預(yù)固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級(jí)脫水，脫水劑濃度梯度為30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%（100% 濃度中換3 次脫水劑），將脫完水的組織再經(jīng)過(guò)脫水劑與環(huán)氧樹脂滲透液（脫水劑與環(huán)氧樹脂滲透液的比例分別為3∶1、1∶1、1∶3），每步30～60 min。將滲透好的樣品塊放到適當(dāng)模具中，灌上包埋液包埋經(jīng)過(guò)加溫聚合形成固體基質(zhì)，即包埋塊，隨后采用超薄切片機(jī)制備約50 nm 的超薄切片，進(jìn)行醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，利用JEM-1400PLUS透射電鏡觀察。

1.3.3 引物的設(shè)計(jì)與RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄 從GenBank 檢索牛（Bos taurus）Collagen1、Collagen3基因和β-actin基因的序列，用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物，由上海生工生物工程有限公司合成，以β-actin作為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1。將-80 ℃冰箱儲(chǔ)存的牦牛肺組織樣品按照TransZol 說(shuō)明書提取總RNA，再按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，存于-20 ℃條件下備用。

1.3.4Collagen1和Collagen3基因的擴(kuò)增 以牦牛對(duì)照組和試驗(yàn)組肺的cDNA為模板，對(duì)Collagen1、Collagen3和β-actin基因進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增。PCR 總反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，無(wú)菌去離子水8 μL，Taq PCR Master Mix 10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s；72 ℃終延伸5 min，40 個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂凝膠進(jìn)行核酸電泳。

1.3.5 qRT-PCR 檢測(cè)Collagen1和Collagen3基因在牦牛對(duì)照組和試驗(yàn)組肺組織中的表達(dá) 使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀以β-actin為內(nèi)參基因檢測(cè)Collagen1和Collagen3基因在牦牛對(duì)照組和試驗(yàn)組肺組織中的表達(dá)水平。反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 1 μL，上下游引物各0.8 μL，無(wú)菌去離子水7.4 μL，SYBR?Premix Ex Taq? Eraser? 10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)4 次。分析其熔解曲線，用SPSS 21.0 軟件對(duì)qRT-PCR 數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6 制備牦牛肺組織蛋白樣品 將存于-80 ℃冰箱的肺組織樣品迅速轉(zhuǎn)移到用錫箔紙包被的研缽中，加入液氮用研杵充分研磨至粉末狀，各稱取0.1 g 至1.5 mL 離心管中，并加入RIPA 裂解液，冰浴搖床裂解1.5 h，吸取上清液，一部分存于-80 ℃?zhèn)溆茫硪徊糠痔崛『玫牡鞍准尤?×蛋白上樣緩沖液進(jìn)行蛋白變性，用于WB檢測(cè)，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 WB 檢測(cè)Collagen1 和Collagen3 蛋白的相對(duì)表達(dá)量 將變性好的組織樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，電泳結(jié)束后切膠，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用脫脂牛奶封閉，然后于4 ℃條件下孵育一抗過(guò)夜，室溫孵育二抗2 h，PVDF膜上滴加化學(xué)發(fā)光液，采用掃描成像儀掃描條帶。用Image J 6.0測(cè)量灰度值，根據(jù)灰度值分析蛋白的表達(dá)量。

1.3.8 免疫組織化學(xué)對(duì)Collagen1和Collagen3蛋白定位 4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖固定液充分浸泡固定組織，石蠟包埋后切片（4 μm），乙醇脫水，0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。按照免疫組化試劑盒進(jìn)行染色，滴加3% H2O2溶液，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；滴加試劑盒A 液，濕盒內(nèi)室溫孵育15 min，進(jìn)行一抗反應(yīng)，4 ℃過(guò)夜；滴加試劑盒B 液，濕盒內(nèi)37 ℃溫箱孵育15 min；再滴加試劑盒C液，濕盒內(nèi)37 ℃溫箱孵育15 min；滴加3，3-二氨基苯聯(lián)胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微攝影觀察。

1.3.9 免疫熒光染色 石蠟切片脫蠟至水，置于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA）抗原修復(fù)液（pH 值8.0）中，并于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后滴加牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）封閉液封閉30 min，之后滴加一抗置于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜，陰性對(duì)照用PBS 代替一抗；PBS 清洗后，置于避光室溫條件下孵育熒光二抗50 min；滴加4＇，6-二脒基-2-苯基吲哚（4＇，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染液，避光室溫孵育10 min；加入自發(fā)熒光淬滅劑作用5 min，之后流水沖洗10 min；切片風(fēng)干后用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡拍照觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，每組重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 HE和Masson染色結(jié)果

由HE 染色結(jié)果可見(jiàn)，對(duì)照組（圖1-a）肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁完整，結(jié)構(gòu)清晰，肺泡隔無(wú)增厚，支氣管管腔和肺泡腔內(nèi)無(wú)炎性滲出物，肺泡無(wú)炎性改變；試驗(yàn)組（圖1-b）肺組織可見(jiàn)幾處片狀壞死，胞核碎裂溶解，并可見(jiàn)重度出血，大范圍肺水腫，肺泡腔內(nèi)充滿嗜酸性蛋白樣物質(zhì)，大范圍肺泡壁中度至重度增厚，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡萎縮，部分肺泡代償性增大，肺泡大小不一。Masson 染色時(shí)膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色，相比對(duì)照組（圖1-c），試驗(yàn)組（圖1-d）肺組織膠原纖維與肌纖維大量增生。

圖1 肺組織HE和Masson染色結(jié)果Fig.1 HE and Masson staining results of lung tissue

2.2 透射電鏡觀察

透射電鏡觀察結(jié)果如圖2顯示。對(duì)照組（圖2-a、b）肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較正常，血管開放性良好，I 型肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰，僅見(jiàn)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。試驗(yàn)組（圖2-c、d）肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)有明顯異常，電鏡下可見(jiàn)部分肺泡上皮細(xì)胞已裂解，細(xì)胞碎片散入肺泡腔內(nèi)；少數(shù)血管內(nèi)還可見(jiàn)中性粒細(xì)胞（炎癥反應(yīng)）；Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體已發(fā)生輕度腫脹，還可見(jiàn)少量空泡；Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)多數(shù)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)已擴(kuò)張呈至囊狀。

圖2 肺組織透射電鏡觀察圖Fig.2 Electron microscopic observation of lungs tissue

2.3 Collagen1和Collagen3基因的擴(kuò)增

由圖3 可知，Collagen1、Collagen3和β-actin分別在131、258 和174 bp 處有單一明亮條帶，驗(yàn)證了反轉(zhuǎn)錄后的引物和cDNA良好，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 Collagen1、Collagen3和β-actin基因PCR產(chǎn)物的電泳分析結(jié)果Fig.3 PCR products of electrophoretic analysis result of Collagen1，Collagen3 and β-actin gene

2.4 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

由圖4 可知，Collagen1基因在牦牛肺試驗(yàn)組中的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），Collagen3基因在牦牛肺對(duì)照組中的表達(dá)量極顯著高于試驗(yàn)組（P＜0.01）；對(duì)照組Collagen3相對(duì)表達(dá)量極顯著高于Collagen1（P＜0.01），試驗(yàn)組Collagen3相對(duì)表達(dá)量顯著高于Collagen1（P＜0.05）。

圖4 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 qRT-PCR results

2.5 Western-blotting檢測(cè)結(jié)果

WB 結(jié)果如圖5所示。Collagen1 和Collagen3 蛋白在肺對(duì)照組和試驗(yàn)組中均有表達(dá)且差異顯著，其中Collagen1 蛋白在肺試驗(yàn)組中的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而Collagen3 蛋白則在肺對(duì)照組中的表達(dá)量顯著高于試驗(yàn)組（P＜0.05）；且試驗(yàn)組、對(duì)照組中Collagen3 蛋白的表達(dá)量均顯著高于Collagen1 蛋白（P＜0.05）。

圖5 Collagen1和Collagen3蛋白的檢測(cè)結(jié)果及相對(duì)表達(dá)量Fig.5 The detection results and relative expression of Collagen1 and Collagen3 proteins

2.6 免疫組化檢測(cè)Collagen1 和Collagen3 蛋白的分布

由圖6 可知，Collagen1 和Collagen3 蛋白在對(duì)照組和試驗(yàn)組中均有分布，棕褐色表示Collagen1 和Collagen3 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物。Collagen1 蛋白同Collagen3 蛋白主要分布于細(xì)支氣管黏膜上皮的克拉拉細(xì)胞、纖毛細(xì)胞和外膜平滑肌細(xì)胞、肺泡隔以及伴隨動(dòng)脈和平滑肌細(xì)胞中。

圖6 Collagen1和Collagen3蛋白在牦牛肺組織中的分布Fig.6 Distribution of Collagen1 and Collagen3 protein in lung tissue of yak

2.7 免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果

免疫熒光染色結(jié)果顯示，在牦牛肺對(duì)照組（圖7-a、b），Collagen1 蛋白主要分布于細(xì)支氣管和終末細(xì)支氣管的克拉拉細(xì)胞、纖毛細(xì)胞、外膜平滑肌和伴隨動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌以及少量肺泡隔中；Collagen3蛋白在肺泡隔中只有極少量分布，其余分布位置同Collagen1。在試驗(yàn)組（圖7-c、d）中，Collagen1 和Collagen3 蛋白大量增生，在肺泡隔中有大量分布，其余分布位置同對(duì)照組，但表達(dá)均強(qiáng)于對(duì)照組。

3 討論

3.1 肺纖維化病理學(xué)檢查與發(fā)生機(jī)制

急性肺損傷早期，肺成纖維細(xì)胞過(guò)度活化，出現(xiàn)纖維化增殖，產(chǎn)生膠原蛋白，從而啟動(dòng)肺纖維化過(guò)程［16-17］。本研究病理組織學(xué)檢查顯示，病變肺組織結(jié)構(gòu)異常紊亂，肺泡間隔增寬，大范圍肺泡壁中度至重度增厚，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡大小不一，大量膠原及基質(zhì)增生，呈典型纖維化。肺纖維化主要是肺間質(zhì)、肺泡、肺小血管或末梢氣道發(fā)生不同程度的炎癥，導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)破壞，形成肺泡腔內(nèi)完全型纖維化，在炎癥損傷和修復(fù)過(guò)程中形成肺纖維化［18-19］，肺纖維化機(jī)制涉及大量的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，膠原蛋白降解需要基質(zhì)金屬蛋白酶來(lái)完成，其活性受金屬蛋白酶組織抑制物抑制。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）能夠誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞生成活性氧（reactive oxygen species，ROS），并促進(jìn)ERK1/2通路的激活，導(dǎo)致Collagen1、Collagen3mRNA 相對(duì)水平和合成增加［20-21］。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）可能通過(guò)上調(diào)Hippo信號(hào)通路中Yap1 的表達(dá)和TGF-β1/Smad 信號(hào)通路中Smad2/3 的表達(dá)，促進(jìn)Collagen1 合成，誘導(dǎo)大鼠肺纖維化［15］。本研究牦牛病變組織結(jié)構(gòu)異常，推測(cè)該牦牛發(fā)生了急性肺損傷，產(chǎn)生了大量生長(zhǎng)因子，從而促進(jìn)了ERK1/2通路的激活，導(dǎo)致膠原蛋白合成增加。

3.2 中草藥改善肺纖維化部分機(jī)制

前人研究發(fā)現(xiàn)，部分中草藥可顯著抑制肺纖維化進(jìn)程，滇龍膽草通過(guò)抑制MAPK 信號(hào)通路可改善小鼠肺纖維化的影響，Collagen1 蛋白水平顯著下調(diào)［22］；由缺氧導(dǎo)致肺間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞化進(jìn)程相關(guān)的Collagen1、Collagen3 指標(biāo)明顯上調(diào)，黃芩苷干預(yù)后Collagen1、Collagen3 指標(biāo)明顯下調(diào)，可有效抑制肺纖維化［23］。姜黃素通過(guò)調(diào)節(jié)博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺組織膠原蛋白周轉(zhuǎn)、組裝和沉積來(lái)防止纖維化沉積［24］。本試驗(yàn)中，在病變肺組織中，Collagen3 的表達(dá)量高于Collagen1，推測(cè)可能處于肺纖維化早期，因此，可通過(guò)檢測(cè)Collagen1 和Collagen3 的含量來(lái)反映牦牛肺纖維化的病程或病變活動(dòng)情況。后續(xù)在研究富含多酚類物質(zhì)的中草藥改善肺纖維化時(shí)，可通過(guò)中草藥經(jīng)信號(hào)通路調(diào)節(jié)Collagen1、Collagen3水平作為判斷依據(jù)。

3.3 Collagen1和Collagen3在纖維化肺中的表達(dá)

Collagen1 和Collagen3 在不同動(dòng)物肺臟表達(dá)形式不同。馬躍文等［25］研究發(fā)現(xiàn)，鼠的肺支氣管周圍以及肺泡間隔中可見(jiàn)Collagen1 和Collagen3，且Collagen1的含量比Collagen3 高。本研究免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Collagen1 和Collagen3 也在牦牛肺細(xì)支氣管和肺泡間隔中有分布，與前人發(fā)現(xiàn)的分布部位一致，但qRTPCR 和WB 結(jié)果表明，牦牛正常肺組織中Collagen1 的含量比Collagen3 低，與前人結(jié)果相反，推測(cè)是由于牦牛具有肺低氧適應(yīng)性結(jié)構(gòu)，高海拔地區(qū)牦牛肺泡隔的厚度大于低海拔地區(qū)，而肺泡隔中含有大量的Collagen3［26］，因此推測(cè)本研究正常肺Collagen1 的表達(dá)量低于Collagen3，可能是高海拔地區(qū)牦牛肺泡隔Collagen3 高表達(dá)所致。Taniwaki 等［27］發(fā)現(xiàn)，一些組織器官如肺、腎、肝等在開始發(fā)生纖維化時(shí)，其上皮合成Collagen4 的能力轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣蒀ollagen1 和Collagen3。當(dāng)組織器官纖維化轉(zhuǎn)變?yōu)槁院?，則以Collagen1 沉積為主，Collagen1 和Collagen3 比例失調(diào)，膠原代謝紊亂，導(dǎo)致膠原在肺間質(zhì)中沉積，肺組織基質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，從而發(fā)生纖維化［28］。張燕萍等［29］研究闡述了Collagen1 和Collagen3 的升高或降低影響肺纖維化程度，Collagen1的過(guò)度沉積在肺間質(zhì)纖維化進(jìn)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，Collagen3 主要分布在肺間質(zhì)，在肺纖維化組織中變化最明顯。Abraham 等［30］研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化時(shí)成纖維細(xì)胞釋放以Collagen1 和Collagen3 為主的膠原蛋白。本試驗(yàn)免疫組化和免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Collagen1 和Collagen3 在試驗(yàn)組大量增生，除在肺泡隔中有大量分布外，在對(duì)照組和試驗(yàn)組中的分布位置基本一致，均分布在細(xì)支氣管黏膜上皮組織和平滑肌組織，伴隨動(dòng)脈內(nèi)皮和平滑肌等肺間質(zhì)中，且在試驗(yàn)組中呈強(qiáng)陽(yáng)性分布。由此推測(cè)本研究中試驗(yàn)組牦牛患有巴氏桿菌病或纖維素性肺炎所致的急性肺損傷，導(dǎo)致其肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，膠原蛋白大量分布。

4 結(jié)論

Collagen1 和Collagen3 在牦牛對(duì)照組和試驗(yàn)組肺組織中均有表達(dá)且存在表達(dá)差異，Collagen1 在牦牛試驗(yàn)組中的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，Collagen3 在牦牛對(duì)照組中的表達(dá)量顯著高于試驗(yàn)組。Collagen1 和Collagen3 主要分布在對(duì)照組和試驗(yàn)組肺組織的細(xì)支氣管黏膜上皮組織、平滑肌組織以及肺泡隔，伴隨動(dòng)脈內(nèi)皮和平滑肌等肺間質(zhì)中。綜上，Collagen1 和Collagen3 在牦牛發(fā)生肺纖維化的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。