葡萄VvJAZ9蛋白原核表達(dá)與多克隆抗體制備

劉德帥 馮 美，2 姚 磊 王 燁 樊姍姍 姚文孔，2，3，*

（1寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2寧夏現(xiàn)代設(shè)施園藝工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750021；3寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021）

葡萄（Vitisspp.）為葡萄科葡萄屬多年生落葉藤本植物，是世界上廣泛栽培的果樹之一。目前，用于栽培生產(chǎn)的葡萄品種多數(shù)為歐亞種葡萄（Vitis viniferaL.），其產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)，但普遍抗逆性較差。葡萄作為一種低溫敏感作物，在栽培生產(chǎn)過程中常遭受不同程度的低溫傷害，限制了其在我國冷涼地區(qū)的發(fā)展，嚴(yán)重影響了葡萄經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量和產(chǎn)業(yè)發(fā)展［1-3］。茉莉酸（jasmonic acid，JA）作為一種重要的植物內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，也作為內(nèi)源信號(hào)分子參與病原菌和植食性昆蟲的防御過程［4］和低溫、高溫、干旱、鹽堿、重金屬及紫外線（ultraviolet-B，UV-B）脅迫的抗性反應(yīng)過程［5］。前人研究發(fā)現(xiàn)，外源施用JA 可通過提高抗氧化酶活性，增加抗氧化劑、防御化合物合成以及誘導(dǎo)冷響應(yīng)基因表達(dá)來增強(qiáng)番茄（Solanum lycopersicum）［6］、葡萄（Vitis vinifera）［7］、西瓜（Citrullus lanatus）［8］等植物的抗寒性。

JAZ（jasmonate ZIM-domain）蛋白不僅是JA 信號(hào)調(diào)控途徑中的重要負(fù)調(diào)控因子，也是調(diào)節(jié)JA 信號(hào)通路中參與植物抵御非生物和生物逆境脅迫應(yīng)答的關(guān)鍵因子［9］。JAZ蛋白是植物中特有的一類蛋白，定位于細(xì)胞核中，屬于TIFY 蛋白家族，由ZIM（zinc-finger protein expressed in inflorescence meristem）、Jas（jasmonates）和NT（N terminal domain）3 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成［10-11］。JAZ 蛋白主要包含ZIM 和Jas兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，存在于N 端的ZIM（又稱TIFY）結(jié)構(gòu)域，包含一個(gè)TIFY基序（TIF［F/Y］XG）。ZIM結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)JAZ蛋白同源或異源二聚體的形成以及與NINJA（novel interactor of JAZ）和TPL（topless）等抑制子的相互作用［12］；存在于C端的Jas（又稱CCT _2）結(jié)構(gòu)域，可以與MYC（myelocytomatosis proteins）、ICE（inducer of CBF expression）蛋白的ACT和TAD 區(qū)域廣泛互作，也是JA-Ile（jasmonic acidisoleucine）與COI1（coronatine insensitive 1）相互作用的關(guān)鍵［13-14］；NT 是JAZ 蛋白N 端的一個(gè)弱保守區(qū)，該結(jié)構(gòu)域可以與DELLA 蛋白互作抑制JA 信號(hào)［15］。有研究表明，OsJAZ9過表達(dá)可降低水稻（Oryza sativa）葉片寬度和氣孔密度，減小葉片蒸騰速率，從而提高植物抗旱性［16］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過表達(dá)AtJAZ7可通過調(diào)節(jié)光合作用、氧化還原、植物激素和防御代謝產(chǎn)物來增強(qiáng)擬南芥的耐旱性［17］。在受到12 h低溫脅迫的黃花苜蓿（Medicago falcata）地上和地下組織中JAZs均上調(diào)表達(dá)，表明JAZs在調(diào)節(jié)植物低溫耐受性的茉莉素信號(hào)中起著重要作用［18］。

低溫冷害和凍害是葡萄栽培生產(chǎn)中普遍存在的問題［19］。在我國北方葡萄栽培地區(qū)多采用埋土防寒措施來減少冬季寒冷、春季霜凍對(duì)葡萄造成的傷害［20］。埋土防寒不但會(huì)增加生產(chǎn)成本，而且對(duì)樹體會(huì)產(chǎn)生損傷，影響產(chǎn)量，還不利于環(huán)境保護(hù)［19-20］。挖掘葡萄中與抗寒相關(guān)的基因并研究其功能和作用機(jī)理，對(duì)亟待解決葡萄冷害和凍害問題有著重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。因此，本試驗(yàn)以釀酒葡萄霞多麗為研究材料，克隆JAZ9基因，探究VvJAZ9基因在低溫條件下的表達(dá)模式，進(jìn)行擬南芥原生質(zhì)體亞細(xì)胞定位分析，并通過原核蛋白表達(dá)獲得JAZ9 蛋白，制備多克隆抗體，檢測葡萄內(nèi)源JAZ9 蛋白的表達(dá)特點(diǎn)，旨在深入分析JAZ9蛋白在葡萄抗寒反應(yīng)中的調(diào)控功能，為合理利用外源JA處理提高葡萄抗寒性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物材料為兩年生盆栽扦插苗霞多麗（V.viniferacv.Chardonnay）植株，于日光溫室中，在自然光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)。選擇生長狀況良好且長勢一致的幼苗，移至LT-BIX120L 低溫培養(yǎng)箱（上海立德泰勀科學(xué)儀器有限公司）內(nèi)，經(jīng)4 ℃處理0、3、6、9、12及24 h后采集葉片組織，以室溫條件下的葉片組織作為對(duì)照（CK），將采集到的葉片組織迅速放入液氮中冷凍后置于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

試驗(yàn)所用反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真酶、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；植物總RNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購于北京天根生化科技有限公司；無縫克隆試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司；其余試劑均為化學(xué)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因克隆 使用植物RNA 提取試劑盒，按照標(biāo)準(zhǔn)流程提取葡萄葉片總RNA，隨后用試反轉(zhuǎn)錄劑盒合成第一鏈cDNA，用于目的基因的克隆。以NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）中的VvJAZ9基因序列（GenBank No.XM_002277121.3）為參考序列，使用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)同源克隆所用引物（表1）。參考俞沁含等［1］的PCR 反應(yīng)體系與程序進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得目的片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、膠回收后連接至克隆載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（E.coli）Top10 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)陽性克隆篩選后，送單克隆至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序確認(rèn)，以獲得含目的基因的重組載體pMD19-T-VvJAZ9。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 采用MEGA 7.0 軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹（bootstrap 設(shè)為1 000）；通過NCBI 在線分析工具CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測蛋白保守結(jié)構(gòu)域；采用在線軟件ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析VvJAZ9 蛋白的基本理化性質(zhì)；運(yùn)用在線網(wǎng)站Grape Genome Browser（http：//genoscope.cns.fr/externe/Genome Browser/Vitis/）分析VvJAZ9基因的染色體定位、內(nèi)含子及外顯子區(qū)域。使用在線軟件MG2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）對(duì)基因在染色體上的位置進(jìn)行可視化。

1.2.3VvJAZ9基因表達(dá)分析 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)檢測葡萄VvJAZ9基因在低溫脅迫下的表達(dá)情況。qRTPCR所用引物使用 Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)（表1）。按照植物總RNA 提取試劑盒說明書分別提取CK 和低溫處理0、3、6、9、12、24 h 的葉片樣品總RNA，各取1 μg 通過PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋10 倍后用于qRT-PCR 分析。qRT-PCR 反應(yīng)用SYBR?Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）試劑盒進(jìn)行，其反應(yīng)體系為20 μL：上下游引物各0.8 μL，模板1 μL，SYBR 試劑10 μL，ddH2O 補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸 30 s，循環(huán)40 次，每次循環(huán)第2 步進(jìn)行熒光采集，用qTOWER 2.0儀器（Analytik Jena，德國）進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果采用2-△△CT法分析計(jì)算，使用IBM SPSS 25.0 中獨(dú)立樣本t測驗(yàn)比較差異顯著性（P＜0.05），并采用Origin Pro 2021 軟件作圖，試驗(yàn)進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建 對(duì)于原核表達(dá)載體的構(gòu)建，選擇VvJAZ9基因片段的開放閱讀框（open reading frame，ORF）全長，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物（表1）。以pMD19-T-VvJAZ9質(zhì)粒為模板，通過PCR 擴(kuò)增獲得目的片段。采用無縫克隆法，將其克隆至經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI/XhoI 雙酶切原核表達(dá)載體pET28b-His 的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28b-VvJAZ9，轉(zhuǎn)化E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌液PCR 與酶切鑒定。對(duì)鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，經(jīng)測序公司測序后獲得正確質(zhì)粒pET28b-VvJAZ9。為最終檢測多克隆抗體在葡萄中的應(yīng)用效果，參照上述載體構(gòu)建的方法，設(shè)計(jì)相應(yīng)的擴(kuò)增引物（表1），以測序正確的pMD19-T-VvJAZ9質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，采用同源重組反應(yīng)的方法，構(gòu)建植物表達(dá)重組載體pC1307-VvJAZ9和pC2300-VvJAZ9。

表1 引物列表Table 1 List of primers

1.2.5 VvJAZ9 亞細(xì)胞定位觀察 根據(jù)VvJAZ9基因片段的ORF 序列設(shè)計(jì)植物表達(dá)載體的特異性引物（表1），將其構(gòu)建至植物表達(dá)載體pBI221-GFP 形成pBI221-VvJAZ9-GFP 融合表達(dá)載體。以霞多麗葡萄的愈傷組織為材料，參考Bertini 等［21］的方法制備葡萄原生質(zhì)體。采用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）介導(dǎo)法分別將 pBI221-VvJAZ9-GFP 和pBI221-GFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至葡萄愈傷組織原生質(zhì)體中，轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體在22 ℃弱光照條件下培養(yǎng)20 h，然后使用TCS SP8 X激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國）觀察VvJAZ9 蛋白的亞細(xì)胞定位情況并拍照記錄。

1.2.6 重組蛋白的表達(dá)與純化 將測序正確的pET28b-VvJAZ9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 感受態(tài)細(xì)胞，加入1.0 mmol·L-1異丙基-β-d-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-d-thiogalactoside，IPTG），37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h 后收集200 mL 菌體，經(jīng)過超聲破碎后于4 ℃、10 000×g條件下離心20 min，收集菌體蛋白的上清液與沉淀。然后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，隨后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色、脫色和拍照。將收集到的上清液與沉淀加入Ni-NTA 樹脂層析柱（翌圣生物科技股份有限公司，上海）中，流速控制在0.5 mL·min-1，收集穿柱液體。分別用10 倍柱床體積的NTA-0、NTA-20、NTA-60、NTA-200 和NTA-500 Buffer 進(jìn)行洗脫，流速控制在1 mL·min-1，收集各洗脫峰。在4 ℃下SDS-PAGE 電泳檢測收集的洗脫液，純度達(dá)到要求的組分，置于透析袋中，在4 ℃下以1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）透析的甘油中透析濃縮，并超濾濃縮透析產(chǎn)物，最后采用SDSPAGE定性，Bradford法定量。

1.2.7 抗體的制備與親和性檢測 參考吳楠等［22］的方法進(jìn)行多克隆抗體制備及親和性檢測。將符合免疫要求濃度的重組蛋白乳化后，按照1 mg·kg-1的劑量，對(duì)2 只新西蘭大白兔進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射，間隔7 d 注射一次。每只兔子免疫4～5 次后采集少量血樣，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清抗體效價(jià)，經(jīng)檢測合格后，于第1次免疫52 d后一次性采血獲得抗血清。將獲得的兔抗血清加入1/20 4 mol·L-1NaCl 溶液，過層析柱（翌圣生物科技股份有限公司，上海），加入40 mL 洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，再加入1×甘氨酸（glycine，Gly）收集樣品，向樣品中加入過量Gly 洗脫抗體，并用1×PBS 平衡。取少量抗體進(jìn)行濃度檢測，剩余抗體置于透析袋中，在4 ℃下以1×PBS 的甘油中透析濃縮過夜，-20 ℃保存。將不同劑量重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳分析，并采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以純化的兔血清為一抗（1∶1 000），再以熒光標(biāo)記的山羊抗兔抗體為二抗，進(jìn)行蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測，使用C400 蛋白成像系統(tǒng)（Azure Biosystems，美國）掃描硝酸纖維素膜，進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）染色，采用電泳系統(tǒng)對(duì)電泳圖像分析。

1.2.8 Western Blot 分析檢測抗體特異性 為確定制備出的anti-VvJAZ9 抗體是否能夠檢測到葡萄中的VvJAZ9蛋白，參考Bertini等［21］的方法制備葡萄愈傷組織葡萄原生質(zhì)體。將制備的葡萄原生質(zhì)體在細(xì)胞培養(yǎng)板上按照1 mL/組進(jìn)行分組試驗(yàn)，然后使用10 μmol·L-1茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）進(jìn)行處理，分別在0、0.5、1 和2 h 時(shí)收集原生質(zhì)體，提取蛋白。參考Yao等［23］的方法進(jìn)行Western Blot 分析，使用anti-VvJAZ9抗體對(duì)葡萄中的JAZ9 蛋白進(jìn)行檢測。為進(jìn)一步驗(yàn)證anti-VvJAZ9 抗體的特異性，將前期濃縮好的pC1307-VvJAZ9與pC2300-VvJAZ9載體提取質(zhì)粒后，通過PEG介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)入制備的葡萄原生質(zhì)體中，24 h 后收集原生質(zhì)體，提取蛋白，進(jìn)行Western Blot分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄JAZ蛋白家族序列分析

HMMER 3.0（http：//hmmer.org/）分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，歐洲葡萄霞多麗中共有11個(gè)JAZs蛋白，根據(jù)參考序列在染色體上的分布將得到的11 個(gè)JAZs基因分別命名為JAZ1、JAZ2、JAZ3、JAZ4、JAZ5、JAZ6、JAZ7、JAZ8、JAZ9、JAZ10、JAZ11，其中JAZ1和JAZ2共存于第1 條染色體上，JAZ5、JAZ6、JAZ7、JAZ8位于第10 條染色體上，其余JAZs分別位于第4、第9、第11、第12、第17條染色體上（圖1）。將所獲得的11 個(gè)JAZs基因編碼蛋白與擬南芥的JAZ家族成員構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，葡萄中JAZs 蛋白可分為4 個(gè)亞族，其中JAZ3、JAZ5、JAZ6、JAZ7、JAZ8 與擬南芥中AtJAZ7 和AtJAZ8 親緣關(guān)系最近；JAZ2 與擬南芥中AtJAZ10 進(jìn)化距離最近；JAZ4、JAZ9、JAZ10 與擬南芥中AtJAZ1 和AtJAZ2 相似度最高，而JAZ1與JAZ11同源關(guān)系最近（圖2）。

圖1 葡萄JAZ基因家族染色體定位Fig.1 The chromosome location of JAZ gene family in grape

圖2 葡萄JAZs蛋白與擬南芥JAZ家族成員進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic analysis of grape JAZs protein and Arabidopsis JAZ family members

2.2 VvJAZ9基因克隆

采用同源克隆的方式，從霞多麗葡萄cDNA 中克隆到VvJAZ9的ORF 序列，條帶為807 bp，單一明亮（圖3）。通過膠回收純化VvJAZ9基因PCR 將其連接至pMD19-T 克隆載體上，挑選陽性克隆進(jìn)行測序。將克隆到的VvJAZ9基因提交至葡萄基因組網(wǎng)（http：//www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）進(jìn)行比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，VvJAZ9基因定位于第11 條染色體，共有5 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子，ORF共807 bp，編碼268個(gè)氨基酸（圖4-A）。VvJAZ9蛋白分子量約為28.58 kDa，等電點(diǎn)pI為9.82，不穩(wěn)定系數(shù)為47.51，總平均親水性（grand average of hydropathicity，GRAVY）值為-0.404，屬于堿性不穩(wěn)定親水蛋白。經(jīng)NCBI 在線CDD 分析工具對(duì)VvJAZ9蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白在132～165 和217～241氨基酸處分別含有TIFY 和CCT_2兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（圖4-B），這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域是JAZ蛋白家族特有的結(jié)構(gòu)，因此該基因?qū)儆贘AZ基因家族。

圖3 VvJAZ9基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 The PCR amplification of VvJAZ9 gene

圖4 VvJAZ9蛋白序列和保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.4 VvJAZ9 protein sequence and conserved domain prediction

2.3 VvJAZ9基因受低溫誘導(dǎo)表達(dá)分析

為進(jìn)一步研究VvJAZ9基因?qū)Φ蜏氐捻憫?yīng)，采用qRT-PCR 對(duì)VvJAZ9在低溫處理后的葡萄葉片中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。葡萄植株在4 ℃低溫處理0 和3 h 后葉片中VvJAZ9的表達(dá)量相較于室溫處理（CK）略有上升但無顯著差異。而低溫處理6 h 以后葡萄葉片中VvJAZ9的表達(dá)量顯著高于對(duì)照，且隨著低溫處理時(shí)間的延長，VvJAZ9呈上升表達(dá)趨勢，在24 h達(dá)到最高值，約為對(duì)照的8 倍。表明VvJAZ9基因?qū)Φ蜏氐谋憩F(xiàn)敏感且響應(yīng)低溫誘導(dǎo)表達(dá)，可能參與葡萄低溫脅迫防御反應(yīng)。

圖5 葡萄VvJAZ9基因響應(yīng)低溫脅迫表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of grape VvJAZ9 gene in response to low temperature stress

2.4 植物表達(dá)載體構(gòu)建

為研究VvJAZ9基因的功能，首先成功構(gòu)建VvJAZ9基因的過量表達(dá)載體。按照前期克隆到的VvJAZ9基因序列設(shè)計(jì)引物（表1），將VvJAZ9基因的ORF 序列分別構(gòu)建至植物表達(dá)載體pC1307-MYC（攜帶MYC 標(biāo)簽蛋白，為植物穩(wěn)定整合表達(dá)載體）、pBI221-GFP［攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)簽蛋白，為植物瞬時(shí)表達(dá)載體］和pC2300-GFP（攜帶GFP標(biāo)簽蛋白，為植物穩(wěn)定整合表達(dá)載體），分別表達(dá)pC1307-VvJAZ9-MYC、pBI221-VvJAZ9-GFP和pC2300-VvJAZ9-GFP融合蛋白（圖6）。

圖6 JAZ9植物過量表達(dá)載體構(gòu)建Fig.6 Construction of JAZ9 plant overexpression vector

2.5 VvJAZ9亞細(xì)胞定位分析

為探究VvJAZ9蛋白的亞細(xì)胞定位情況，將空載質(zhì)粒pBI221-GFP 和重組質(zhì)粒pBI221-VvJAZ9-GFP 通過PEG介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)化葡萄愈傷組織原生質(zhì)體使融合蛋白在原生質(zhì)體中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，22 ℃弱光培養(yǎng)20 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光分布情況，結(jié)果如圖7所示。pBI221-GFP 和pBI221-VvJAZ9-GFP 在原生質(zhì)體中表達(dá)蛋白后均能檢測到綠色熒光，其中空載體對(duì)照pBI221-GFP的綠色熒光在整個(gè)細(xì)胞均有分布；而pBI221-VvJAZ9-GFP 融合蛋白的熒光信號(hào)只分布于細(xì)胞核，說明VvJAZ9在細(xì)胞核中表達(dá)并發(fā)揮功能。

圖7 VvJAZ9亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of VvJAZ9

2.6 抗體制備

為進(jìn)一步探究葡萄中JAZ9內(nèi)源蛋白表達(dá)情況，制備了VvJAZ9 蛋白的多克隆抗體。以前期所獲得的VvJAZ9基因的片段為模板，設(shè)計(jì)同源重組引物（表1），將VvJAZ9基因ORF 分別構(gòu)建至帶有His 標(biāo)簽蛋白的原核表達(dá)載體pET28b 上形成融合表達(dá)載體pET28b-VvJAZ9-His（圖8）。

圖8 JAZ9構(gòu)建至原核表達(dá)載體pET28b載體菌液PCR檢測Fig.8 PCR detection of prokaryotic expression vector pET28b constructed from JAZ9

將構(gòu)建成功的pET28b-VvJAZ9-His載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原核蛋白表達(dá)菌株E.coliBL21 后經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后以獲得最佳表達(dá)條件。結(jié)果表明，菌株1 在37 ℃條件下經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)可以達(dá)到純化目的蛋白的需求（圖9-A）。隨后經(jīng)Ni-NTA 親和層析獲得純化的JAZ9-His融合蛋白后，再經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，考馬斯亮藍(lán)染色鑒定所提取的蛋白大小為34.77 kDa（圖9-B），確定無誤后經(jīng)免疫挑選健康的6 周大小的新西蘭大白兔兩只（約2 kg），制備多克隆抗體，結(jié)果顯示anti-VvJAZ9 多克隆抗體制備良好可用于下一步試驗(yàn)（圖9-C）。

圖9 JAZ9蛋白多克隆抗體制備Fig.9 Preparation of polyclonal antibody JAZ9 protein

2.7 JZA9抗體在葡萄體內(nèi)檢測

為確定所制備的anti-VvJAZ9 抗體是否能夠檢測到葡萄中的JAZ9蛋白，利用霞多麗葡萄愈傷組織提取原生質(zhì)體后進(jìn)行10 μmol·L-1MeJA 處理，在0、0.5、1和2 h 時(shí)收集原生質(zhì)體，提取蛋白后，分別用anti-VvJAZ9 抗體檢測葡萄原生質(zhì)體在MeJA 處理后VvJAZ9 表達(dá)情況（圖10）。結(jié)果表明，anti-VvJAZ9 抗體可以用于檢測葡萄內(nèi)源JAZ9蛋白表達(dá)情況，葡萄原生質(zhì)體中JAZ9蛋白在MeJA 處理后呈現(xiàn)下降的表達(dá)趨勢，說明VvJAZ9 蛋白在高水平JA 條件下容易降解，說明植物體內(nèi)JAZ蛋白的降解受JA水平的影響。

圖10 葡萄原生質(zhì)體中檢測JAZ9蛋白Fig.10 Detection of JAZ9 protein in grape protoplast

2.8 VvJAZ9基因的植物過量表達(dá)載體檢測分析

為進(jìn)一步在瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系中確認(rèn)anti-VvJAZ9 抗體的特異性，同樣將前期濃縮的pC1307-VvJAZ9與pC2300-VvJAZ9載體轉(zhuǎn)入葡萄原生質(zhì)體中，經(jīng)24 h 后收集樣品進(jìn)行Western Blot 分析，結(jié)果如圖11所示。anti-VvJAZ9抗體具有良好的特異性，可以特異識(shí)別出葡萄內(nèi)源的JAZ9 蛋白、JAZ9-MYC 融合蛋白以及JAZ9-GFP 融合蛋白。表明前期構(gòu)建的VvJAZ9 植物過量表達(dá)載體可以用于葡萄遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，所制備的抗體可以用于檢測葡萄內(nèi)源對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)。

圖11 VvJAZ9基因的植物過量表達(dá)載體檢測分析Fig.11 Detection and analysis of plant overexpression vector of VvJAZ9

3 討論

JA 是一種廣泛存在于高等植物體內(nèi)的脂肪酸衍生植物激素，不僅在植物生長發(fā)育過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，而且在植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫中也扮演著重要角色［24］。SCFCOI1（Skp1-Cul1-F-box proteinCOI1）泛素蛋白復(fù)合體、轉(zhuǎn)錄抑制因子JAZ 蛋白和轉(zhuǎn)錄激活因子MYC 蛋白是JA 信號(hào)通路的三個(gè)核心作用元件，其中JAZ 蛋白作為E3 泛素連接酶SCFCOI1的靶蛋白和MYC 的轉(zhuǎn)錄抑制子，是JA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵組分，在JA調(diào)控植物脅迫應(yīng)答的過程中發(fā)揮著重要作用［10］。JAZ 基因家族成員眾多，且生物學(xué)功能豐富。目前己報(bào)道在擬南芥［25］、煙草（Nicotiana tabacum）［26］、番茄［27］、水稻［28］、 西瓜［29］和葡萄［30］中分別鑒定出12、15、13、15、8 及11 個(gè)JAZ基因。Zhang 等[30]運(yùn)用生物信息學(xué)手段從葡萄基因組中鑒定出11 個(gè)JAZ基因。而本研究用生物信息學(xué)方法從葡萄全基因組中篩11 個(gè)葡萄JAZs基因家族成員，并根據(jù)JAZ基因在染色體上的分布將其分別命名為VvJAZ1～VvJAZ11。本研究篩選鑒定結(jié)果與前人一致，說明葡萄中存有11 個(gè)JAZ基因家族成員，但其分別參與葡萄各種生物學(xué)過程有待進(jìn)一步研究。粗山羊草（Aegilops tauschii）中鑒定出的9個(gè)AtJAZs成員在染色體上的分布較廣泛，在7號(hào)染色體上分布密集[31]。本研究發(fā)現(xiàn)11 個(gè)VvJAZs成員不均勻地分布在7 條染色體上，在10 號(hào)染色體上分布較集中。這與粗山羊草JAZs家族基因在染色體上的分布研究結(jié)果類似，說明葡萄VvJAZ基因家族隨機(jī)分布在染色體上，沒有染色體偏好性，但在10 號(hào)染色體上分布密集，推測這些基因可能存在正向或反向的重復(fù)。前人研究結(jié)果顯示，橡膠草（Taraxacum kok-saghyz）TkJAZ9 蛋白與黃花蒿（Artemisia annua）AaJAZ9 蛋白的進(jìn)化距離最近[32]；黑果枸杞（Lycium ruthenicum）LrJAZ9 蛋白與擬南芥AtJAZ9 蛋白親緣關(guān)系最近[33]；葡萄VvJAZ9 蛋白與AtJAZ1 和VvJAZ4 親緣關(guān)系最近[30]。本研究通過系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，VvJAZ9蛋白與擬南芥AtJAZ1 和AtJAZ2 親緣關(guān)系最近，并推測VvJAZ9 蛋白可能與AtJAZ1 和AtJAZ2 在蛋白結(jié)構(gòu)或功能上具有一定的相似性。

近年來，隨著JAZ 蛋白在JA 信號(hào)途徑中研究的不斷深入，許多植物中JAZ 蛋白基因已被成功克隆。本研究采用同源克隆的方法從歐洲葡萄中成功克隆出VvJAZ9基因，隸屬植物特有的JAZ基因家族。該基因位于第11 條染色體，有5 個(gè)外顯子，4 個(gè)內(nèi)含子，編碼268 個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子質(zhì)量約為28.58 kDa，是堿性不穩(wěn)定親水蛋白，與LrJAZ9 蛋白性質(zhì)研究類似［33］。橡膠草TkJAZ9［32］、黑果枸杞LrJAZ9［33］、高粱（Sorghum bicolor）SbJAZ9［34］、水稻OsJAZ9［35］蛋白都具有兩個(gè)高度保守的ZIM 和Jas 結(jié)構(gòu)域，其中LrJAZ9 和OsJAZ9都屬于核定位蛋白。本試驗(yàn)結(jié)果表明，VvJAZ9蛋白定位于細(xì)胞核，也具有ZIM 和Jas 保守結(jié)構(gòu)域，屬于典型的JAZ家族蛋白，與上述前人研究結(jié)果一致。

JAZ基因是茉莉酸信號(hào)通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，也是植物響應(yīng)逆境脅迫的關(guān)鍵調(diào)控因子。水稻中OsJAZ9 蛋白與OsMYB30 相互作用負(fù)調(diào)控BMY（Betaamylase）基因以調(diào)節(jié)淀粉分解和麥芽糖含量，從而增強(qiáng)植物的抗寒性［36］。在NaCl處理后，黑果枸杞葉片中的LrJAZ9和橡膠草中的TkJAZ9基因都受鹽誘導(dǎo)表達(dá)，隨處理時(shí)間的推移其表達(dá)量逐漸升高，且都在6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，表明LrJAZ9和TkJAZ9可能參與植物鹽脅迫響應(yīng)［32-33］。PEG-6000 處理后的高粱植株葉片中SbJAZ9基因的表達(dá)水平顯著增加，在12 h 達(dá)到最大［34］。棉花（Gossypium hirsutum）幼苗葉片中GhJAZ1基因受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，隨著低溫處理時(shí)間的延長，其表達(dá)量逐漸升高，且在12 h 達(dá)到最高值，推測該基因參與棉花低溫脅迫防御反應(yīng)［37］。本研究結(jié)果表明，低溫處理后的葡萄葉片中VvJAZ9基因的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間延長而呈現(xiàn)上升趨勢，顯著受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，與上述前人研究結(jié)果類似，說明VvJAZ9基因可能參與葡萄應(yīng)答低溫脅迫過程。

目前，運(yùn)用原核表達(dá)的重組蛋白免疫鼠、兔等動(dòng)物制備多克隆抗體已成為一種行之有效且常用的方法［38］。此外，通過原核表達(dá)獲得大量的抗原蛋白，既可用于蛋白質(zhì)性質(zhì)與功能研究，也可用于蛋白質(zhì)的相互作用等生化功能研究［39］。在葡萄抗寒方面研究所制備出的多克隆抗體有anti-VvHOS1［1］、anti-VaCIPK18［22］和anti-VaERD15［40］，而VvHOS1、VaCIPK18和VaERD15在植物響應(yīng)低溫脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。本研究中VvJAZ9蛋白不含能夠影響原核表達(dá)效率的信號(hào)肽、跨膜區(qū)等高級(jí)結(jié)構(gòu)，使得其在原核細(xì)胞內(nèi)能夠高效表達(dá)。經(jīng)免疫純化后可獲得效價(jià)高且特異性好的anti-VvJAZ9多克隆抗體，該抗體能夠特異識(shí)別葡萄中不同形式JAZ9 蛋白。通過anti-VvJAZ9 抗體檢測到外源MeJA 處理后的葡萄中VvJAZ9蛋白表達(dá)呈現(xiàn)下降的趨勢，說明在JA 作用下葡萄JAZ 蛋白易發(fā)生降解，JA 信號(hào)通路中JAZ 蛋白的降解受JA 水平影響。綜上，本研究為深入分析JAZ蛋白在葡萄抗寒反應(yīng)中的調(diào)控功能奠定了理論基礎(chǔ)，并為JAZ 基因參與葡萄抗寒控機(jī)理的研究和抗寒葡萄品種的選育提供了參考。

4 結(jié)論

本研究從歐洲葡萄中克隆得到VvJAZ9基因，經(jīng)生物信息學(xué)分析可知，VvJAZ9 蛋白具有JAZ 蛋白家族特有的TIFY 和CCT_2 保守結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR 結(jié)果表明，VvJAZ9 顯著響應(yīng)低溫誘導(dǎo)表達(dá)，推測該基因可能在葡萄抵御冷脅迫的應(yīng)答過程中起重要作用。通過亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，VvJAZ9在細(xì)胞核中表達(dá)并發(fā)揮功能。將VvJAZ9基因成功構(gòu)建至植物表達(dá)載體pC1307-MYC、pBI221-GFP、pC2300-GFP 及原核表達(dá)載體pET28b-His形成融合表達(dá)載體pC1307-VvJAZ9-MYC、pBI221-VvJAZ9-GFP、pC2300-VvJAZ9-GFP 和pET28b-VvJAZ9-His。pET28b-VvJAZ9-His 在E.coliBL21 中，經(jīng)37 ℃、1.0 mmol·L-1IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，再經(jīng)免疫純化后獲得anti-VvJA9 多克隆抗體。Western Blot 結(jié)果表明，anti-VvJAZ9抗體可以特異性識(shí)別葡萄中不同形式的VvJAZ9 蛋白，植物體內(nèi)高水平的JA 會(huì)促使JAZ 蛋白降解，JA 信號(hào)途徑中的JAZ 蛋白的降解受JA 水平影響。