不結(jié)球白菜酵母雜交cDNA文庫構(gòu)建及BcFT上游調(diào)控因子篩選

徐新鳳 王惠玉 米 閔 侯喜林 李 英 王建軍 肖 棟 劉同坤

（作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095）

開花是植物生長發(fā)育過程中的重要一環(huán)［1］。同時，開花作為重要的數(shù)量性狀之一，其調(diào)控通路錯綜復(fù)雜，受到各種內(nèi)源性和外源性信號的調(diào)節(jié)［2-3］。目前，擬南芥開花途徑的相關(guān)研究已經(jīng)較為透徹，主要包括六大途徑：光周期途徑、春化途徑、溫度途徑、赤霉素途徑、年齡途徑及自主途徑［4-5］，途徑之間相互交叉、相互依賴。首先，植物通過多種途徑將信號傳遞給開花整合基因；隨后，開花整合基因進一步調(diào)控其下游開花相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)植物開花。例如，F(xiàn)LOWERING LOCUS T（FT）基因編碼一種磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白，屬于PEBP 蛋白家族［6］。FT是關(guān)鍵的開花基因，將信號進一步傳遞給花分生組織，最終調(diào)控植物開花。由此可見，F(xiàn)T基因是植物成花網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子［7］。

不結(jié)球白菜［Brassica campestris（syn.Brassica rapa）ssp.chinensis］是十字花科蕓薹屬白菜亞種中典型的開花植物，起源于我國，栽培歷史悠久，是我國長江中下游地區(qū)人們最喜愛的蔬菜之一［8-9］。然而，過早開花會導(dǎo)致不結(jié)球白菜的營養(yǎng)生長受到抑制，經(jīng)濟價值隨之降低；過晚開花則會導(dǎo)致不結(jié)球白菜錯過最佳生長季節(jié)，商品價值受到影響。因此，平衡不結(jié)球白菜的開花時間是提高其經(jīng)濟價值的前提［10］。此前的研究中，通過混合分組測序分析法（bulked segregation analysis，BSA-seq）定位到了不結(jié)球白菜開花相關(guān)基因BcFT［11］。許多研究顯示，在大豆［Glycine max（L.）merr.］中FT存在10 個同源基因，其中GmFT2a和GmFT5a在開花轉(zhuǎn)變中起促進作用，而GmFT1a和GmFT4則抑制大豆開花［12］。在甜菜（Beta vulgarisL.）中，BvFT2的直系同源物FTL1的表達(dá)與短日照的花誘導(dǎo)相關(guān)，但與長日照加速開花無關(guān)［13］。在大麥（Hordeum vulgareL.）中，有12 個已知的FT類基因（HvFT），HvFT4在春季品種中的過表達(dá)延緩了長日照條件下的開花時間［14］。在菊花（Chrysanthemum morifoliumRamat）中，CsFTL3表達(dá)在短日照期間通過CsFTL3-CsFDL1復(fù)合物的反饋機制得到正調(diào)控，并且在反復(fù)短日照下，通過高水平CsFTL3誘導(dǎo)的反饋實現(xiàn)開花［15］。綜上所述，在光周期途徑中，F(xiàn)T同源基因在數(shù)量和結(jié)構(gòu)等方面存在差異，導(dǎo)致FT同源基因可能存在相反或者冗余功能，從而呈現(xiàn)出早晚開花的差異，同時也表明FT在植物開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演著至關(guān)重要的角色。根據(jù)定位結(jié)果，比較晚開花wym-97（var.communisTesn et Lee）和早開花cx-49（var.tsaitaiHort.）兩個品種中的BcFT啟動子發(fā)現(xiàn)，cx-49 的BcFT啟動子存在1 577 bp 的插入片段，而且cx-49 的BcFT啟動子活性高于wym-97，故推測cx-49 的BcFT啟動子中的插入片段在不結(jié)球白菜開花中發(fā)揮重要作用［11］，但其調(diào)控機制仍不清楚。

酵母單雜交技術(shù)是用于研究DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)［16］，目前該技術(shù)已在多個物種中得到應(yīng)用。例如，在玉米（Zea maysL.）中，ZmNF-YA3 蛋白與ZmCO-like 和ZmFPF1 相互作用形成復(fù)合物，然后與ZmFT-like12 的啟動子區(qū)域結(jié)合來促進玉米早開花［17］；在蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphroditeRchd）中，酵母單雜交數(shù)據(jù)表明，PhSVP 蛋白與PhFT3基因的啟動子相互作用，從而抑制PhFT3的表達(dá)，最終影響蝴蝶蘭的開花時間［18］。由此可見，酵母單雜交是描述基因表達(dá)調(diào)控的有效方法之一。為了探究不結(jié)球白菜cx-49的BcFT啟動子中的插入片段在不結(jié)球白菜開花中的調(diào)控機制，本研究通過克隆BcFT的啟動子序列并利用酵母單雜交技術(shù)篩選BcFT上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，以期為進一步闡明不結(jié)球白菜成花的分子機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 供試材料為不結(jié)球白菜品種NHCC001 和cx-49，分別由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)實驗室（本課題組）和浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。將以上種子用去離子水清洗后，放置于培養(yǎng)皿中濕潤濾紙上，室溫催芽1～2 d 后移栽至穴盤中，置于人工氣候室（16 h光照，22 ℃/ 8 h黑暗，18 ℃）中生長。待第二片真葉完全展開時取樣，并將樣品放置在液氮中速凍，保存于-80 ℃冰箱。

1.1.2 試驗試劑 酵母單雜交中的誘餌載體pAbAi由本課題組提供。酵母Y1HGold 菌株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院白菜系統(tǒng)生物學(xué)實驗室保存。大腸桿菌DH5α 感受態(tài)購自南京擎科生物科技有限公司。電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞HST08、PrimeSTAR Max DNA聚合酶、TaKaRa MiniBEST 植物RNA 提取試劑盒（TaKaRa Code No.9769）、DNA 連接試劑盒（TaKaRa Code No.6022）、TaKaRa MiniBEST DNA 片段純化試劑盒（TaKaRa Code No.9761）、SMART cDNA 文庫構(gòu)建試劑盒（Clontech Code No.634901）、Advantage 2 PCR 試劑盒（Clontech Code No.639206）、CHROMA SPIN-1000-TE 離心柱（Clontech Code No.636079）、TRIMMER DIRECT cDNA 均一化試劑盒（Evrogen Cat#NK003）、酵母空載質(zhì)粒pGADT7，均購于寶生物工程（大連）有限公司。RNA 提取試劑盒和DNA 提取試劑盒均購于天根生化科技（北京）有限公司。Hifair Ⅱ1st Strand cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（11119ES60）購于翌圣生物科技（上海）股份有限公司。各種工具酶購于南京有晴生物科技有限公司。引物合成及測序由南京擎科生物科技有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA 和基因組DNA 的提取及cDNA 的合成 使用RNA 提取試劑盒提取NHCC001 總RNA，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 提取結(jié)果，然后使用Hifair Ⅱ 1st Strand cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。使用DNA提取試劑盒提取cx-49總DNA。

1.2.2 酵母單雜交cDNA 文庫的構(gòu)建 取4 葉期NHCC001 葉片0.2 g 在液氮中充分研磨，用RNA 提取試劑盒進行NHCC001 總RNA 的提取，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取結(jié)果。使用cDNA文庫構(gòu)建試劑盒及PCR 試劑盒合成cDNA，然后使用cDNA 均一化試劑盒對純化后的cDNA 進行均一化處理，繼而使用cDNA 均一化試劑盒及PCR 試劑盒對處理后cDNA 進行PCR 擴增。進一步使用限制性內(nèi)切酶SfiI對擴增得到的cDNA 進行酶切處理，然后使用離心柱對酶切后cDNA 進行過柱凈化，用ddH2O 溶出。取pGADT7-SfiI vector 與過柱后的cDNA，使用DNA 連接試劑盒在12 ℃條件下進行連接。對獲得的連接液進行純化精制，得到初級cDNA文庫。

1.2.3 cDNA 文庫的檢測與鑒定 取少量初級文庫連接液，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞HST08；取適量轉(zhuǎn)化液涂布Amp 抗性LB 平板，37 ℃過夜培養(yǎng)；通過平板上生長的菌落個數(shù)，計算初級文庫庫容。隨機挑取96 個文庫單克隆鑒定重組率，公式如下：

文庫重組率=（PCR 擴增出的菌落數(shù)/進行PCR 的菌落數(shù)）×100%。

1.2.4 酵母感受態(tài)制備 挑取Y1HGold 菌株放入2 mL 酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose adenine medium，YPDA）液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r·min-1條件下過夜培養(yǎng)。取1.5 mL過夜培養(yǎng)的菌液加入到50 mL YPDA液體培養(yǎng)液中，30 ℃、250 r·min-1條件下振蕩孵育2～3 h 至OD600達(dá)到0.4～0.6。將50 mL 菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫下700×g離心5 min。棄上清液，用30 mL 去離子水懸浮后700×g離心5 min，棄上清液，用1.5 mL TE/LiAc 重懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)到1.5 mL 離心管中。12 000 r·min-1離心15 s，棄上清液，用600 μL TE/LiAc 懸浮細(xì)胞，獲得酵母Y1HGold感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.5 構(gòu)建pAbAi-proBcFT誘餌表達(dá)載體 對cx-49的BcFT啟動子1 577 bp 序列進行克隆測序，使用在線軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測啟動子中的結(jié)合元件。將擴增片段重組到pAbAi 載體上，構(gòu)成誘餌表達(dá)載體pAbAi-proBcFT。送南京擎科生物科技有限公司測序正確后，提取質(zhì)粒并使用BbsI單酶切，隨后轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)Y1HGold中。

1.2.6 誘餌載體轉(zhuǎn)化及酵母菌株自激活檢測 利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）介導(dǎo)的醋酸鋰感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法，將線性化的pAbAi-proBcFT轉(zhuǎn)化到Y(jié)1HGold 酵母感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于SD/-Ura 固體培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)2～3 d 后，挑取單菌落進行菌檢。挑取正確的單菌落將OD600值調(diào)至0.23～0.28，吸取10 μL在SD/-Ura，SD/-Ura/AbA（金擔(dān)子素，aureobasidin A 50 ng·mL-1），SD/-Ura/AbA（100 ng·mL-1），SD/-Ura/AbA（300 ng·mL-1），SD/-Ura/AbA（400 ng·mL-1），SD/-Ura/AbA（500 ng·mL-1），SD/-Ura/AbA（600 ng·mL-1），SD/-Ura/AbA（800 ng·mL-1）固體培養(yǎng)基上進行梯度驗證。30 ℃培養(yǎng)3～4 d后，觀察菌落數(shù)量及形態(tài)。

1.2.7BcFT上游調(diào)控基因的篩選 在600 μL感受態(tài)中加入變性的載體 DNA 20 μL，cDNA 文庫10 μL，并與2.5 mL PEG/LiAc 混勻，30 ℃水浴45 min，然后加入160 μL 二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），輕輕顛倒混勻。隨后將混勻液于42 ℃熱激20 min。繼而700×g離心5 min，去上清，加3 mL YPDA，30 ℃、250 r·min-1振蕩培養(yǎng)1.5 h。再一次700×g離心5 min，去上清，加15 mL 生理鹽水重懸。最后涂布于SD/-Ura/-Leu/AbA（800 ng·mL-1）的固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～4 d。

1.2.8BcFT上游調(diào)控基因的獲得 根據(jù)pGADT7 載體圖譜設(shè)計引物（表1），對SD/-Ura/-Leu/AbA（800 ng·mL-1）固體培養(yǎng)基上生長的菌落進行PCR 檢測。將PCR 產(chǎn)物送至南京擎科生物科技有限公司測序，然后在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上對測序結(jié)果進行比對。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in the paper

1.2.9 酵母單雜交驗證 將篩選得到的候選基因重組到pGADT7 載體，隨后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到含有線性化pAbAi-proBcFT重組載體的Y1HGold 酵母感受態(tài)細(xì)胞中。最終將測序正確的菌液OD600調(diào)至0.2，并涂布于SD/-Ura/-Leu/AbA（800 ng·mL-1）固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)3～5 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取

提取不結(jié)球白菜NHCC001 的總RNA，經(jīng)檢測OD260/280=2.11，質(zhì)量濃度為967 μg·μL-1，數(shù)據(jù)表明獲得的總RNA 中未被DNA、蛋白質(zhì)和其他小分子污染，可用于下一步試驗。取300 ng 的RNA 進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，總RNA 有18 S 和28 S 兩條清晰的條帶，說明提取的總RNA 質(zhì)量合格，未發(fā)生降解，可以進行cDNA的合成（圖1）。

圖1 總RNA的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1 Total RNA analysis on 1.5% agarose gel

2.2 cDNA文庫的構(gòu)建

以1 μg 的RNA 為模板，通過SMART 技術(shù)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)離心柱純化后，取1 μL cDNA 進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳用于檢測cDNA 合成效果。試驗結(jié)果顯示，合成的雙鏈cDNA 呈彌散狀分布，片段長度分布范圍約400～2 000 bp，大小主要分布在1 000 bp 左右（圖2）。結(jié)果表明cDNA全長性較好，符合建庫要求。

圖2 雙鏈cDNA的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.2 Double-stranded cDNA analysis on 1.5% agarose gel

2.3 文庫質(zhì)量鑒定

本試驗所得的cDNA 文庫庫容為1.8×106CFU，高于1.0×106CFU，能夠保證篩選到低豐度的基因［19］。同時，1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，初級文庫的平均插入片段長度分布范圍約400～2 000 bp，平均長度大于1 000 bp，重組率為100%。結(jié)果表明，本次構(gòu)建的酵母文庫提高了獲得基因完整序列的可能性，且達(dá)到了高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，可用于酵母雜交分析（圖3）。

2.4 BcFT啟動子結(jié)合元件分析

使用引物proBcFT-F/R 擴增不結(jié)球白菜cx-49 的BcFT上游1 577 bp 啟動子序列，使用在線軟件PlantCARE分析BcFT啟動子中的順式作用元件，結(jié)果如表2所示。BcFT啟動子中存在多種結(jié)合元件，主要包括光反應(yīng)元件、脫落酸（abscisic acid，ABA）響應(yīng)元件和脅迫響應(yīng)元件。以上結(jié)果表明，BcFT上游調(diào)控因子可能通過參與光周期途徑或脅迫響應(yīng)途徑調(diào)控不結(jié)球白菜開花。

表2 BcFT啟動子順式作用元件預(yù)測Table 2 Prediction of cis-acting elements in BcFT gene promoter

2.5 誘餌載體構(gòu)建及自激活驗證

構(gòu)建酵母表達(dá)載體pAbAi-proBcFT并通過酶切將其線性化，然后轉(zhuǎn)入酵母菌株Y1HGold。在SD/-Ura固體培養(yǎng)基中加入不同濃度的AbA，驗證pAbAiproBcFT是否存在自激活性，結(jié)果表明pAbAi-proBcFT在800 ng·mL-1AbA 的SD/-Ura 中生長受到抑制（圖4），故在此濃度下可以進行酵母文庫篩選。

圖4 pAbAi誘餌載體自激活檢驗Fig.4 Self-activation test of pAbAi bait vector

2.6 酵母單雜交篩選及陽性菌落PCR測序分析

將pAbAi-proBcFT作為誘餌進行酵母單雜交篩庫。涂板5 d 后，在SD/-Leu/-Ura/AbA 800 ng·mL-1平板上共獲得138個單菌落。對單菌落進行酵母PCR 測序后，進行BLAST序列同源比對，最后篩選到3個候選蛋白：BcSAP18、BcDEAR2和BcPUB14（圖5）。

圖5 候選基因單菌落PCRFig.5 PCR detection of insert fragments in the primary library

2.7 酵母單雜交驗證

為了進一步驗證BcSAP18、BcDEAR2 和BcPUB14對BcFT的調(diào)控作用，克隆BcSAP18、BcDEAR2和BcPUB14基因全長并連接到pGADT7，分別命名為pGADT7-BcSAP18、pGADT7-BcDEAR2和 pGADT7-BcPUB14。在已轉(zhuǎn)入線性化pAbAi-proBcFT的酵母Y1HGold 中分別轉(zhuǎn)入上述3 個重組質(zhì)粒。分別涂布于AbA 濃度為800 ng·mL-1的SD/-Ura/-Leu 固體培養(yǎng)基上。pAbAi-proBcFT+pGADT7 作為陰性對照，pAbAiproBcFT+pGADT7-BcSAP18/BcDEAR2/BcPUB14為試驗組。結(jié)果表明，BcSAP18 和BcDEAR2 與BcFT之間存在互作（圖6）。

圖6 酵母單雜驗證Fig.6 Yeast-one-hybrid verification

3 討論

FT 蛋白是從葉子運輸?shù)巾斞康囊苿有盘枺現(xiàn)T的轉(zhuǎn)錄受到上游促進和抑制因子的嚴(yán)格控制［20］。前人研究表明，不結(jié)球白菜FT基因在開花過程中起著關(guān)鍵作用，本試驗根據(jù)前人研究獲得的數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）定位結(jié)果［11］，對BcFT進行分析，成功克隆BcFT的1 577 bp 啟動子序列。并使用在線軟件PlantCARE 預(yù)測了BcFT啟動子中存在脫落酸響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件和多個光響應(yīng)元件，由此推測BcFT的上游調(diào)控因子可能參與了光反應(yīng)途徑或者脅迫響應(yīng)途徑。本試驗使用SMART技術(shù)合成cDNA避免了克隆短cDNA 的偏差，使用該技術(shù)構(gòu)建cDNA 文庫富集了全長cDNA 并保留了更多的5’末端序列。同時，SMART 方法比其他技術(shù)需要更少的步驟、時間和起始RNA 量［19］，通過檢測cDNA 文庫庫容、重組率和平均插入片段大小，證明了本試驗構(gòu)建的不結(jié)球白菜酵母雜交cDNA 文庫樣本信息的完整性良好，是一個高質(zhì)量文庫，可用于目的基因互作蛋白的篩選。本試驗還克隆了BcFT的啟動子序列并將其成功構(gòu)建到誘餌表達(dá)載體pAbAi上，自激活試驗結(jié)果表明，800 ng·mL-1AbA 可以抑制誘餌表達(dá)載體的自激活。酵母單雜交術(shù)基本原理是轉(zhuǎn)錄因子可以與靶基因啟動子中的順式作用元件相互作用，以調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)［21］。本試驗利用上述構(gòu)成的高質(zhì)量cDNA 文庫篩選與BcFT啟動子互作的蛋白，最終初步篩選出BcSAP18 和BcDEAR2。

SIN3 ASSOCIATED POLYPEPTIDE 18（SAP18）是DNA 結(jié)合抑制劑的轉(zhuǎn)錄下調(diào)復(fù)合物的組成成分［22］，在擬南芥中參與植物脅迫條件下對激素敏感的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［23］和植物開花時間調(diào)節(jié)［24］，推測BcSAP18可能參與不結(jié)球白菜開花時間調(diào)節(jié)。除了常見的6 條開花通路外，植物開花還會受低溫［25］、干旱［26］等脅迫的誘導(dǎo)，而脫落酸在脅迫反應(yīng)中起著核心作用［27］。本試驗中，BcFT啟動子中含有ABA響應(yīng)元件和脅迫響應(yīng)元件，由此推測SAP18可能參與脫落酸途徑調(diào)節(jié)的不結(jié)球白菜開花。

DEAR2 編碼ERF/AP2 轉(zhuǎn)錄因子家族的DREB 亞家族A-5 的成員。DEAR1在介導(dǎo)生物和非生物應(yīng)激反應(yīng)的信號通路之間的串?dāng)_方面具有上游調(diào)節(jié)作用［28］，但是前人對DEAR2探究較少。本試驗初步驗證了DEAR2 與BcFT啟動子之間存在互作，但DEAR2在不結(jié)球白菜開花調(diào)控通路的具體作用還需更深層次的探究。

本研究為進一步闡釋不結(jié)球白菜開花調(diào)控機制提供了新的思路和方向，但對BcSAP18和BcDEAR2調(diào)控BcFT的機制尚不清楚，還需通過雙熒光素酶試驗、電泳遷移率變動分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）等試驗進一步驗證。

4 結(jié)論

本研究以不結(jié)球白菜BcFT基因為研究對象，通過構(gòu)建高質(zhì)量的不結(jié)球白菜酵母雜交cDNA 文庫，克隆菜心中BcFT基因的1 577 bp 啟動子插入片段，并構(gòu)建誘餌表達(dá)載體pABAi-proBcFT，利用酵母單雜交技術(shù)篩選BcFT基因上游調(diào)控因子，最終篩選到BcSAP18和BcDEAR2。